海洋創傷弧菌感染對宿主免疫系統的影響研究

付凱飛，劉劍飛，王欲曉，吳成林，欽可為，周麗君 （解放軍海軍總醫院中心實驗科，北京100048）

·論著·

海洋創傷弧菌感染對宿主免疫系統的影響研究

付凱飛，劉劍飛，王欲曉，吳成林，欽可為，周麗君 （解放軍海軍總醫院中心實驗科，北京100048）

目的：探討重要海洋致病菌創傷弧菌對小鼠免疫器官及免疫組織的感染效應，為有效的感染診治提供新思路.方法：以亞致死劑量的創傷弧菌感染BALB/c小鼠，采用病理顯微鏡技術觀察小鼠脾臟及腸道淋巴組織病理學變化，應用流式細胞技術檢測外周血及脾臟的淋巴細胞壞死/凋亡情況和淋巴細胞亞群分布變化，并在人工合成創傷弧菌溶血素蛋白基礎上，采用細胞毒實驗檢測創傷弧菌主要毒力因子對淋巴細胞損傷情況.結果：創傷弧菌感染后，脾臟及腸道相關淋巴組織均有明顯的結構改變，出血/充血明顯，淋巴細胞可見碎裂、壞死；創傷弧菌感染后外周血及脾臟內的淋巴細胞損傷以凋亡尤為顯著，同時淋巴細胞各亞群失去正常比例，CD4＋T細胞明顯低于對照組，CD4＋/CD8＋T細胞比例也顯著降低（P＜0.05）；體外CCK?8細胞毒活性實驗也顯示，一定濃度的創傷弧菌溶血素蛋白可顯著降低淋巴細胞的存活率（P＜0.01）.結論：創傷弧菌感染對免疫組織細胞有明顯的破壞作用，可能導致感染后期發生免疫抑制，進一步加重繼發感染.

創傷弧菌；免疫組織；溶血素；淋巴細胞；流式檢測

0 引言

創傷弧菌（Vibrio vulnificus）是一種廣泛分布在海洋中的致病弧菌，以致病毒力強、感染死亡率高著稱.接觸或食用被創傷弧菌感染的魚、蝦、貝類等海產品，或開放性傷口接觸海水等均可引起創傷弧菌感染，導致急性胃腸炎、創口蜂窩織炎、壞死性筋膜炎，甚至膿毒血癥等癥狀，偶還可致肺炎、自發性腹膜炎和腦膜炎［1－2］.世界范圍內的創傷弧菌感染病例時有發生，最早的報道見于1970年，Roland發現創傷弧菌感染導致小腿壞疽和內毒素性休克［3］，此后國內外一些沿海城市相繼有創傷弧菌感染的臨床報告，國內病例多集中于浙江溫州地區和臺灣地區［4－5］.而且多數病例分析報告［6－7］表明，發生創傷弧菌感染性重癥敗血癥患者大多是免疫力低下人群，如患有糖尿病、肝損傷、酒精性肝硬變等，感染后引發的敗血癥往往為多臟器累及，一旦發生敗血癥性休克，死亡率將達100%.目前已有大量針對創傷弧菌致病性及毒力的研究報道，常見的宿主感染效應及部分致病機制也得以闡明，但其對免疫系統是否存在特殊損傷效應目前國內外均鮮見報道.為此，我們在既往研究結果基礎上，將創傷弧菌感染后免疫組織的病理學改變和免疫細胞變化相結合，在不同病變水平上評估其對免疫系統的損傷，并對目前公認的創傷弧菌致病元兇——溶血素（Vibrio vulnificus cytolysin，VVC）的淋巴毒活性進行檢測，從免疫學角度進一步揭示其致病效應機制.

1 材料和方法

1.1 主要試劑RPMI?1640培養液購自美國Hy?clone公司；胎牛血清購于北京元亨圣馬生物技術研究所；2216E海生菌培養肉湯，胸腺依賴淋巴細胞（thymusdependent lymphocytes，T淋巴細胞）、骨髓依賴淋巴細胞（bone marrow dependent lymphocyte，B淋巴細胞）和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK細胞）亞群檢測試劑盒，以及細胞壞死/凋亡（Annexin?V/7?AAD）檢測試劑盒均購自美國BD（Becton，Dick?inson and Company）公司；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司；細胞增殖活性檢測試劑盒（cell count?ing kit?8，CCK?8）購自東仁化學科技公司.

1.2 菌株及細胞創傷弧菌（MCCC?1H00066）購于中國海洋微生物菌種保藏管理中心，于2216E海生菌培養肉湯中37℃恒溫培養；AHH?1細胞為本研究室保存，在1640培養液（含10%胎牛血清）中以37℃、50 mL/L CO2孵箱條件培養.

1.3 創傷弧菌溶血素蛋白根據GeneBank中公布的創傷弧菌VVC（GenBank＝NC＿005140.1）序列設計擴增目的基因引物［Pvvf1：5'?gcggatccatgaaaaaaat?gactctgttt?3'（BamH 1）、Pvvr2：5'?ccctcgaggagtttgacttgttg?taatgt?3'（Xho 1）］，委托上海生工進行基因的克隆與鑒定，并構建原核表達質粒，獲得大腸桿菌中的高效表達并SDS?PAGE鑒定，將純化VVC蛋白－70℃保存備用.

1.4 實驗動物及感染模型制備雌性BALB/c小鼠（8周齡）購于解放軍海軍總醫院動物中心.調整創傷弧菌懸液濃度為106CFU/mL，選取實驗組小鼠于右下腹進行腹腔注射（1 mL/只），對照組腹腔注射等量滅菌的生理鹽水.

1.5 病理學標本的制備及觀察注射后12 h眼球取血，斷椎法處死后取脾臟、并剪除小腸淋巴結，放于10%緩沖甲醛溶液固定2～3 d后，石蠟包埋制片，HE染色，光鏡觀察其組織病理變化.

1.6 流式檢測樣本制備

1.6.1 外周血樣本 將所采小鼠眼球抗凝血稀釋后，加于分離液之液面上，以400 g離心20 min，小心吸取淋巴細胞分離層，用PBS重復離心洗滌3次，并將離心細胞團重懸于100 μL的PBS中，以備流式檢測.

1.6.2 脾臟樣本 將所取脾臟組織放入盛有1640培養液的培養皿中沖洗，剝除周圍結締組織，放置于300目尼龍濾膜上，用注射器針芯輕輕研壓脾臟，至無組織團塊時，取1 mL含0.1%血清的PBS沖洗針芯及濾膜，吸取脾細胞懸液共3 mL加入流式上樣管中，以備檢測.

1.7 VVC細胞毒檢測將AHH?1細胞接種于96孔板，在不同組別的孔中分別加入VVC（終濃度分別為（0.5 μg/mL、5 μg/mL、20 μg/mL和40 μg/mL），對照組加入同體積1640培養液，空白組不含細胞.檢測時間點分別為12 h、18 h、24 h和36 h，細胞培養完成后加入CCK?8試劑，共孵育2 h后用酶標儀測定450 nm波長（630 nm參考波長）的雙波長.細胞存活率＝（OD實驗組?OD空白組）/（OD對照組?OD空白組）×100%.

1.8 統計學處理采用SPSS21.0統計學軟件進行單因素方差分析，數據以±s表示，P＜0.05表示差異有統計學意義.

2 結果

2.1 創傷弧菌感染后免疫組織病理變化陰性對照組脾臟及腸淋巴組織結構正常（圖1A、2A）.弧菌感染后小鼠脾臟可見脾臟充血出血明顯，被膜下有充血、出血改變，脾小結周圍有明顯的出血帶，脾小結縮小或消失，脾小結內可見灶狀出血，淋巴細胞碎裂、壞死改變，髓索內也可見網狀內皮細胞增生和中性粒細胞浸潤（圖1B、1C）；腸淋巴結組織可見附近腸絨毛排列紊亂，脫落絨毛細胞變性、壞死，部分絨毛水腫明顯，間質有蛋白滲出液，粘膜固有層、肌層和粘膜下層水腫，部分絨毛表面、絨毛內、粘膜和粘膜下層均有菌團侵入，部分淋巴結失去正常的形態結構，淋巴結內可見紅細胞滲出，呈灶狀出血，淋巴細胞碎裂、壞死改變（圖2B、2C）.

圖1 小鼠脾臟組織結構變化

圖2 小鼠腸組織淋巴結結構變化

2.2 創傷弧菌感染后外周血免疫細胞變化

2.2.1 壞死/凋亡變化 流式檢測結果顯示，創傷弧菌感染后，小鼠外周血淋巴細胞出現明顯壞死、凋亡，且以凋亡損傷為主，凋亡細胞數量顯著高于對照組（圖3）.

圖3 創傷弧菌感染后外周血淋巴細胞壞死/凋亡變化

2.2.2 各淋巴細胞亞群變化 創傷弧菌感染組T細胞比例顯著低于對照組，B細胞和NK細胞比例也分別有升高及降低的變化，但無統計學意義（圖4）；T細胞亞群中，CD4＋T細胞明顯減少，CD8＋T細胞及CD4＋/CD8＋T細胞比例也有相應降低，但差異無統計學意義（圖5）.

2.3 創傷弧菌感染后脾臟淋巴細胞變化

2.3.1 壞死/凋亡變化 創傷弧菌感染脾臟淋巴細胞也有壞死凋亡發生（圖6），且以凋亡改變尤為顯著，壞死細胞相對數量較少，這也與病理觀察到的結果相一致.

圖6 創傷弧菌感染后脾臟淋巴細胞壞死/凋亡變化

2.3.2 各淋巴細胞亞群變化 創傷弧菌感染脾臟中T細胞和NK細胞比例明顯較對照組降低，B細胞比例則明顯高于對照組，均存在統計學意義（圖7A）；T細胞亞群中，創傷弧菌感染組CD4＋T細胞明顯低于對照組，CD4＋/CD8＋T細胞比例也顯著降低（圖7B）.

圖7 創傷弧菌感染后脾臟不同淋巴細胞群比例變化情況

2.4 VVC的細胞毒作用VVC對淋巴細胞株AHH?1存活率影響存在一定的量效關系，0.5 μg/mL和5 μg/mL的VVC作用組AHH?1存活率無顯著下降，VVC作用濃度超過20 μg/mL時AHH?1存活率均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01，圖8）.

圖8 創傷弧菌溶血素VVC對淋巴細胞株AHH?1毒性作用

3 討論

機體的免疫系統可通過有效地啟動抗感染免疫應答效應，從而發揮殺傷作用，清除入侵的病毒、細菌等病原微生物.淋巴細胞是機體發生免疫應答的主要作用細胞，其基本成分主要包括T細胞、B細胞、NK細胞等.不同淋巴細胞亞群的數量及構成是反映機體免疫功能狀態的重要指標，也是各亞群細胞協同調節，實現機體免疫功能正常的必要條件［8］.因此，對感染機體外周血及脾等免疫組織內淋巴細胞的檢測，可以為感染程度、機體免疫狀態及臨床表現的差異等提供有效啟示.

本研究結果顯示，亞致死劑量的創傷弧菌通過腹膜吸收入血后，可引起器官組織炎癥反應和嚴重的血液循環障礙，并造成淋巴組織變性、壞死等結構上的損傷，而且流式細胞檢測表明淋巴細胞受損方式以凋亡為主，這也與病理觀察到的結果一致.關于創傷弧菌感染引起的病理變化及其相關致病因素的研究較多，已明確的致病因子包括溶血素、腸毒素、細胞毒素、蛋白酶、鐵螯合物、粘附因子和血凝素等，其中溶血素除了增加血管通透性，更是導致細胞凋亡和壞死的重要元兇［9－10］.本研究體外實驗也表明，一定濃度的創傷弧菌溶血素vvc可以顯著降低淋巴細胞的存活率.因此，在創傷弧菌感染時，機體可通過凋亡、壞死方式直接損傷淋巴細胞，造成其數量、比例的變化，進而打破機體免疫平衡.

在淋巴細胞各亞群構成中，T細胞是其中的主要組分，數量最多，功能也最為復雜，如可直接殺傷靶細胞，輔助或抑制B細胞產生抗體，以及產生細胞因子等.絕大部分成熟的T細胞可經血流遷徙至脾臟、骨髓或淋巴結（如腸相關淋巴組織），并進行淋巴再循環，發揮細胞免疫及免疫調節等功能，其中有超過一半的T細胞可進入脾臟白髓［11－12］.本研究結果中，創傷弧菌感染使外周血和脾臟T細胞比例均有顯著降低，其中CD4＋T細胞下降明顯，CD4＋/CD8＋T細胞比例也相應降低，表明機體細胞免疫功能減弱.CD4＋T是人體最重要的免疫細胞，其數量能夠直接反映人體免疫功能，也是著名的HIV的攻擊對象［13］.Leder?berger等［14］對HIV感染者的研究表明，若血液中CD4＋T數量低于200個/μL，機會性感染的風險上升2.5倍，若低于50個/μL，這種風險將會上升到5.8倍.而CD8＋T細胞是介導細胞毒性反應的效應細胞，其增多會引起免疫抑制反應［15］.因此，CD4＋和CD8＋T細胞二者之間的比值是衡量機體免疫功能是否穩定的重要依據，其降低則提示免疫功能下降，反映感染進程的加重且影響預后［16］.

而B細胞在血液和淋巴結中的數量相對較少，也可經血流遷出至脾臟和淋巴結，受抗原刺激后可產生抗體發揮體液免疫的功能［17］.雖然B細胞通過與T細胞相同的途徑定居至脾臟和淋巴結，但其在脾臟中的循環數量遠高于外周淋巴結［13］.本研究結果中，創傷弧菌感染使外周血和脾臟B細胞比例有所升高，表明機體體液免疫功能在感染后受損傷較小，甚或有所提升.除了T細胞和B細胞，NK細胞也是同樣重要的免疫效應細胞，雖數量不多，但在機體防御病原微生物感染和抗腫瘤方面發揮著及其重要的作用［18－19］.NK細胞在體內分布非常廣泛，根據表面標志不同又可分為不同亞群，存在于外周血中的NK細胞既可誘導針對靶細胞的抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用，又可產生多種不同類型的細胞因子［20］，而肝臟、脾臟等其它組織中的NK細胞功能則與其周圍的微環境狀態密切相關，不同組織中NK細胞的分化、成熟過程及其細胞毒活性都顯示出明顯差異［21－22］.本研究中創傷弧菌感染后NK細胞比例也有一定程度降低，有可能是創傷弧菌及其毒力因子的細胞毒作用所致，也不排除其本身抗菌過程中存在一定的消耗，提示創傷弧菌感染后，依賴于NK細胞的抗感染免疫功能也受到影響.

總體而言，重要海洋致病弧菌除了導致宿主免疫組織極顯著的血液循環障礙，同時也導致淋巴細胞發生凋亡、壞死性損傷，各亞群構成平衡也相應被打破，從而進一步破壞機體免疫力.因此，弧菌感染對機體免疫組織細胞的破壞作用，可能導致感染后期發生免疫抑制，進一步加重繼發感染.提示在弧菌感染后的診治過程中，有必要進行相關免疫指標監測，考慮從免疫學角度探尋提高其診治療效的新手段.

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Study on the effects of Vibrio vulnificus infection on host immune system

FU Kai-Fei，LIU Jian-Fei，WANG Yu-Xiao，WU Cheng-Lin，QIN Ke-Wei，ZHOU Li-Jun
Center for Basic Medical Science，Navy General Hospital，Beijing 100048，China

AIM：To study the effect of Vibrio vulnificus，an im?portant marine pathogen，on immune organs and tissues of mice，so that to provide new ideas for effective diagnosis and treatment of infection.METHODS：BALB/c mice were infected with suble?thal doses of Vibrio vulnificus，then the pathological changes of the spleen and gut associated lymphoid tissues were observed with mi?croscopy，and the lymphocyte necrosis/apoptosis and lymphocyte subsets distribution changes of application in peripheral blood and spleen were detected by flow cytometry.On the basis of synthetic Vibrio vulnificus cytolysin（VVC），the lymphocyte damage from main toxicity factor of Vibrio vulnificus were tested with the cell counting Kit?8（CCK?8）cytotoxic experiment.RESULTS：There were obvious structural changes in the spleen and intestinal related lymphatic tissues of mice after Vibrio vulnificus infection，and the bleeding/congestion was obvious，and the lymphocytes appeared to be fragmentation and necrosis.After Vibrio vulnificus infection，the dominant lymphocyte damage in the peripheral blood and spleen was apoptosis，and the lymphocyte subset lost the normal proportion，more specifically，the number of CD4＋T cell group decreased significantly，the proportion of CD4＋/CD8＋T cells also significantly reduced（P＜0.05）.In vitro cytotoxicity test also showed that a certain concentration of VVC could significantly re?duce the survival rate of lymphocytes（P＜0.01）.CONCLUSION：Vibrio vulnificus infection can cause significant damages to the host immune tissue cells，which may lead to immunosuppression in the later stages of infection and further aggravate secondary infection.

Vibrio vulnificus；immune tissue；Vibrio vulnificus cytolysin；lymphocyte；flow cytometer detection

R378.3

A

2017－08－29；接受日期：2017－09－10

國家自然科學基金（31400107）；軍隊醫藥衛生重點課題（BHJ14J004）

付凱飛.博士.E?mail：fukaifei＠sina.com

周麗君.博士，研究員.研究方向：抗體工程學、細胞與分子免疫學.E?mail：hzzhoulj＠126.com

2095?6894（2017）10?16?04