青稞核糖體蛋白基因HbRPL11的克隆、序列分析及原核表達

王玉林

摘 要：【目的】為了進一步明確青稞核糖體蛋白基因HbRPL11的功能【方法】根據鑒定得到的青稞核糖體蛋白基因HbRPL11的序列設計了引物，從青稞幼嫩葉片的cDNA中得到目的片段，并對目的基因序列進行了測序鑒定和序列分析，同時構建了原核表達載體pET28a（+）-RPL11，轉化入大腸桿菌BL21（DE3）后利用IPTG 誘導外源蛋白質表達并利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測。【結果】成功擴增出了青稞核糖體蛋白基因HbRPL11的CDS全長序列，得到了重組蛋白。【結論】青稞核糖體蛋白基因HbRPL11的CDS全長序列大小為543 bp。經生物信息學分析，HbRPL11編碼的蛋白質含有181個氨基酸，相對分子質量為24KD，理論等電點（pI）為5.17，總平均親水性（GRAVY）為0.766，不穩定系數為37.67為穩定蛋白。重建蛋白質三維結構表明該蛋白包含14個β-片狀螺旋結構存在典型的核糖體蛋白L5結構域。系統進化分析表明，HbRPL11與小麥和山羊草的RPL11具有較近的親緣關系。蛋白表達結果顯示，重組蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中。

關鍵詞：青稞；核糖體蛋白；RPL11；序列分析；原核表達

青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum HooK.f.）為禾本科大麥屬，又名裸大麥、米大麥，為藏族人民主要糧食作物，是高原特色農作物之一，有獨特的營養結構和保健作用。青藏高原環境條件極端：高寒缺氧， 環境惡劣， 降雨量少、蒸發量大，青稞是在這種極端環境下植物適應性進化的典型代表。近些年來，研究者們先后對青稞的抗鹽性[2， 3]、抗旱性[4， 5]等方面進行了研究，為選育適應性強、綜合性狀優良的品種奠定基礎。

我們通過轉錄組測序和抑制性差減雜交技術對青稞的抗寒相關基因進行了篩選，發現了核糖體蛋白基因RPL11（GeneBank登錄號： AK249873.1）。核糖體蛋白主要有70S和80S兩種類型[6， 7]，RPL11是葉綠體50S大亞基中編碼核糖體蛋白L11基因的序列。近期研究發現，核糖體蛋白不僅具有組成核糖體參與蛋白質合成的功能，還可通過參與復制、轉錄、RNA加工、DNA修復等進程調節細胞的分裂、增殖、分化、發育等多種生命活動。我們以青稞為材料，進行RPL11基因的克隆、序列分析及原核表達，旨在為進一步了解RPL11功能，明確該蛋白與抗寒相關性方面提供參考依據，并為青稞的資源有效保護與利用提供科學依據。

一、材料與方法

1.材料

供試材料為西藏自治區農牧科學院提供的青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.）‘320和‘喜馬拉雅8號種子。

2.方法

（1）青稞種苗轉錄本的提取及反轉錄。將適量的青稞種子播種于富含有機質的盆栽土壤中，正常澆水管理，待植株生長正常，以青稞新鮮幼葉為材料，使用Scientz-48高通量組織研磨儀磨樣，采用Jena InnuPREP RNA Mini Kit試劑盒提取新鮮葉片RNA，采用TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit進行反轉錄，cDNA樣本與-20℃冷凍保存。

（2） HbRPL11基因的克隆。依據轉錄組測序分析結果，利用Primer Premier 5.0 軟件設計特異引物RPL11-F：5′- ATGTGCGGATCCATGTCGACGGAGAAG -3′，RPL11-R：5′- ATGTCGCTCGAGTTAGCTCGCATGGGACT -3′。RT-PCR反應于S-1000 Thermal Cycler儀器，反應體系采用20 μL PCR獲得充足產物：TaqDNA聚合酶（TaKaRa，5 U/μL） 0.2μL，10×PCR反應緩沖液（Takara） 2μL，dNTP（10 mmol/L）1.6μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.8μL，cDNA 2μL，滅菌水12.6μL。反應條件：：94℃預變性 3 min；94 ℃變性 45 s，64 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 60 s，35 個循環；72 ℃延伸 10 min。回收目標片段，克隆、測序。

（3）HbRPL11基因的生物信息學分析。利用NCBI（http：//ncbi.nlm.nih.gov/）、ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）、DISPHOS（http：//www.dabi.temple.edu/disphos/）、InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）、Conserved domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、Signal IP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、TargetP 1.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）、PredictProtein（https：//ppopen.rostlab.org/）、NPS（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopm.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）等網絡資源對HbRPL11進行序列分析。根據推測的HbRPL11氨基酸序列，利用MEGA5.1軟件進行氨基酸序列同源性比對和進化樹分析。

（4）原核表達載體的構建及轉化。挑選測序正確的陽性克隆使用堿裂解法提取質粒，采用EcoR I和Hind III分別雙酶切陽性重組質粒和表達質粒pET-28a（+），1%瓊脂糖凝膠回收目標片段，使用T4 DNA連接酶在16℃條件下過夜進行片段連接。挑取單克隆，37℃震蕩培養后提取質粒，酶切鑒定陽性重組質粒。將鑒定正確的陽性質粒pET28a-RPL11熱激轉化至表達宿主菌BL21（DE3）大腸桿菌感受態細胞。將提取的pET-28a（+）空載體轉化表達宿主菌BL21（DE3）作陽性對照，BL21（DE3）感受態細胞不轉化組作陰性對照。endprint