乙醇對秀麗隱桿線蟲壽命的影響及其分子機理

王 晉，王虹元，金玲玲，郭長祿，張治洲*

（哈爾濱工業大學（威海）海洋科學與技術學院，山東 威海 264200）

乙醇對秀麗隱桿線蟲壽命的影響及其分子機理

王 晉，王虹元，金玲玲，郭長祿，張治洲*

（哈爾濱工業大學（威海）海洋科學與技術學院，山東 威海 264200）

以秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）作為模式生物，在其生長培養基中分別添加4、40、400 mmol/L的乙醇試劑，觀察乙醇對線蟲壽命的調控作用。通過檢測對照組和喂食乙醇溶液實驗組線蟲體內壽命相關基因（age-1、pdk-1、akt-1、let-363）的表達差異，探究乙醇調控線蟲壽命的分子機制。結果表明，喂食400 mmol/L乙醇可有效提高線蟲壽命，分別將壽命中位數和平均壽命提高了11.76%和15.78%，且與對照組相比均具有顯著性差異（P＜0.05）。利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測基因表達，結果表明乙醇可能通過抑制age-1基因表達，引發胰島素信號傳導通路中一系列相應下游基因表達變化從而延長線蟲壽命；雷帕霉素受體信號傳導通路中let-363基因也因乙醇的攝入及胰島素信號傳導通路下游基因的抑制作用而表達下降，兩者聯合達到顯著延長線蟲壽命的作用效果。

秀麗隱桿線蟲；長壽；乙醇；信號傳導通路

隨著社會的進步和科技的迅猛發展，通過藥物和食品延緩衰老在技術水平上成為可能。生物體的壽命長短如何受外來因素的影響？衰老的內在調控機制到底是什么？隨著胰島素信號（insulin/IGF signalling，IIS）和雷帕霉素受體信號（mammalian target of rapamycin，mTOR）等傳導通路對衰老調控作用的機制被一一解開，衰老研究在分子生物學上取得突破性進展，并成為生物學研究領域的熱點課題[1-2]。基因的突變能夠使生物體壽命發生顯著改變，如daf-2基因突變體線蟲壽命是正常線蟲壽命的2～3 倍，而daf2/clk-1雙基因突變體線蟲壽命可提高5～6 倍[3]，Insulin/IGF-1通路相關基因突變會使實驗動物衰老表征得到大幅度改善[4]。然而壽命的調控是一個復雜的過程，除了受到遺傳的控制之外，也與人類的生存環境和生活習慣息息相關。由于秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）具備生命周期短、在實驗室易于培養且易于操作、繁殖快、容易獲取大量同期化樣本以消除個體差異等優勢[5-6]，因此選用秀麗隱桿線蟲作為壽命研究的模式生物。

以乙醇為主要成分的酒類飲料是中國人在社交、慶典等活動中不可缺少的特殊飲品，在日常生活中也占有十分重要的地位。我國自古便有“酒乃百藥之長”一說，這是古人對酒的高度評價。可以說酒在醫學上的應用是祖國醫藥學的發明之一，酒有“通血脈、散濕氣”、“行藥勢、殺百邪惡毒氣”、“除風下氣”、“開胃下食”、“溫腸胃、御風寒”、“止腰膝疼痛”等功效，而且在行醫的過程中將酒入藥可推進藥效發揮[7]。在近年來的研究中發現乙醇作為酒中的主要成分具有一定的增壽作用：2011年于笑坤[8]發現在低乙醇體積分數（1%～2%）的刺激之下，線蟲壽命有所延長而且爬行速度較快。而2012年美國加州大學科學家發現L1期線蟲幼蟲通過攝食乙醇（體積分數0.4%）并將其轉化為脂肪酸而達到增壽作用[9]。

為了進一步探究攝食乙醇可顯著延長秀麗隱桿線蟲壽命的分子機制，本實驗以N2野生型秀麗隱桿線蟲作為模式生物，通過喂食4、40、400 mmol/L 3 種不同濃度乙醇，觀察乙醇對其壽命的影響，從IIS和mTOR兩個經典的衰老調控信號傳導通路中選擇壽命相關基因（age-1、pdk-1、akt-1和let-363）（表1）。其中age-1、pdk-1、akt-1基因是IIS傳導通路關鍵基因，其對生物體表型的作用已被報道：與個體壽命、抗逆性、生育和胚胎發育都具有明顯相互關聯[10-11]；mTOR傳導通路中的let-363基因為生物個體新陳代謝關鍵基因，通過調控生物個體新陳代謝速率影響個體壽命的長短[12-13]。目前尚鮮見文獻報道上述4 個基因的表達是否受乙醇的影響。通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測第8天和第12天線蟲體內age-1、pdk-1、akt-1和let-363的表達情況，進而初步判斷乙醇對壽命的調控作用與IIS和mTOR兩個經典信號傳導通路之間的關系。

表1 4 個與線蟲壽命相關基因的基本信息Table 1 Information about lifespan-related genes in C. elegans

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

N2野生型秀麗隱桿線蟲（C. elegans，the Bristol strain N2）和大腸桿菌（Escherichia coli）OP50由天津科技大學王昌祿教授惠贈。

乙醇（100%）等試劑均購于上海生物（工程）有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-250B-Z等系列生化培養箱、SW-CJ-1F型單人雙面垂直潔凈工作臺 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；XYH-2A型連續變倍體式顯微鏡 上海永亨光學儀器制造有限公司；TDL-60B/16B型臺式離心機 上海安亨科學儀器廠；HC-3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；Stepone實時熒光定量PCR儀美國ABI生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 線蟲培養基的配制

稱量3 g NaCl、2.5 g胰蛋白胨、17 g瓊脂粉，添加ddH2O至1 L，121 ℃高溫高壓滅菌20 min，待培養基冷卻至50～60 ℃時逐一添加CaCl2（1 mol/L）1 mL、MgSO4（1 mol/L）1 mL、KPO4緩沖液（1 mol/L）25 mL、膽固醇溶液1 mL，混合均勻[22]。在普通NGM（nematode growth medium）培養基冷卻至50～60 ℃后分別加入對應濃度乙醇溶液。

1.3.2 E. coli OP50的培養與涂布

將37 ℃振蕩培養的E. coli OP50菌群涂布在NGM培養基上，涂好菌的平板封口倒置放在37 ℃生化培養箱中培養過夜后，放入4 ℃冰箱中保存，以備喂養線蟲使用。

1.3.3 線蟲的同期化培養

將線蟲母液與同期化試劑（5 g/100mL NaClO溶液與5 mol/L NaOH溶液體積比為2∶1）以體積比7∶3的比例混勻，不斷振蕩混勻，直至線蟲解體溶液由渾濁變為澄清（同期化時間控制在8～10 min），4 000 r/min離心50 s，棄上清液收集EP管底部沒有被同期化試劑破壞的蟲卵，將收集到的蟲卵用dH2O清洗3 次，接種于涂布有E. coli OP50的NGM平板上，置于20 ℃生化培養箱中孵育[23]。

1.3.4 線蟲壽命統計

從同期化3 d后的平板中選出大小一致且活躍度高的線蟲，各挑取35 只線蟲至添加有4（0.024%，體積分數，下同）、40（0.240%）、400 mmol/L（2.400%）乙醇的培養基中進行培養，每組設置3 組平行實驗，每24 h更換一次培養基，直至培養基中的線蟲全部死亡，統計線蟲壽命，并與對照組平板中線蟲進行對比（數據剔除由于意外在培養皿壁上干死的線蟲）。將每天線蟲的死亡及存活數轉換成線蟲壽命，進行Kaplan-Meier生存分析；同時，根據線蟲存活天數排序按式（1）計算平均壽命（mean of lifespan，MLS），平均壽命標準誤差（standard error，SE）按式（2）計算。

式中：j為線蟲日齡；xj為該日齡線蟲存活條數；dj為（xj+xj+1）期間死亡的線蟲條數；n為線蟲的總條數。

1.3.5 線蟲壽命相關基因的表達

由于線蟲生命周期較短，選取8 d成熟期線蟲作為對照模板（對照組）；因其于第15天左右開始出現死亡個體，故選取第12天線蟲作為衰老模板。在第8、12天分別從對照組及具有顯著延壽作用的400 mmol/L乙醇實驗組中各挑取線蟲20 只，使用Trizol進行裂解，根據乙醇提取法提取RNA，并使用對應試劑盒進行反轉錄實驗，最終獲取cDNA樣本。使用實時熒光定量PCR儀檢測其壽命相關基因的表達情況。實驗所用所有引物均為2 μmol/L且每對引物均以濃度1∶1混合（表2）。調整各個基因引物對添加量使得各基因最終擴增效率均在1左右，最終確定12 μL實時熒光定量PCR反應體系如表3所示，循環條件為：94 ℃預變性6 min；94 ℃變性20 s，61 ℃退火32 s，72 ℃延伸40 s，反應循環數為40；72 ℃完全延伸2 min。

表2 實時熒光定量PCR引物對信息Table 2 qPCR primers used in this study

表3 實時熒光定量PCR反應體系設計Table 3 qPCR reaction systems

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同濃度乙醇對線蟲壽命的影響

不同濃度乙醇對線蟲壽命的影響情況如圖1、表4所示。從生存函數可以看出400 mmol/L乙醇可有效提高線蟲整個生命周期內生存率，攝食4 mmol/L和40 mmol/L乙醇線蟲與對照組線蟲相比不存在顯著性差異。通過對數據進行單因素方差分析和LSD多重比較發現，400 mmol/L乙醇實驗組線蟲壽命中位數和平均壽命分別提高了11.76%和15.78%，與其他3 組相比均存在顯著性差異（P＜0.05）。由此可見400 mmol/L乙醇具有延壽作用。

圖1 不同濃度乙醇對線蟲生存函數的影響Fig. 1 Survival function of C. elegans fed with different concentrations of ethanol

表4 不同濃度乙醇對線蟲壽命的影響Table 4 Lifespan of C. elegans fed with different concentrations of ethanol

2.2 不同濃度乙醇對壽命相關基因表達水平的影響

圖2 線蟲壽命相關基因的相對表達量Fig. 2 Lifespan-related gene expression in C. elegans as detected by qPCR analysis

檢測線蟲成蟲后第8、12天4 個基因相對表達情況，結果由圖2可知，隨著線蟲衰老程度的增加，上述4 個基因表達量均顯著性下降（P＜0.05，P＜0.01）。喂食400 mmol/L乙醇于線蟲衰老階段均顯著抑制壽命相關基因的表達（P＜0.05，P＜0.01），進而有效延緩衰老進程而顯著提高線蟲壽命。

3 結 論

高劑量飲用酒精類飲品所帶來的負面作用一直被人們深惡痛絕，但醫學上已經證明，適量飲酒可以對人體產生真正的健康功效，比如降低膽固醇、強化智能、提高心血管機能等。本研究表明，少量、適度地補充乙醇亦存在潛在的增壽作用。通過喂食線蟲4、40、400 mmol/L乙醇溶液，觀察不同濃度乙醇對壽命長短的影響（乙醇劑量的選擇是通過對國內外文獻數據以及本研究室的前期實驗結果比較總結而定[9]）。結果表明，攝食400 mmol/L乙醇溶液具有延壽作用，喂食乙醇的實驗組線蟲無論是壽命中位數還是平均壽命均發生顯著性提高（P＜0.05）。

衰老調控機理研究中，IIS傳導通路調控壽命的機理不僅已闡述得較為清楚，并且從酵母到小鼠都具有較高的保守性，因而成為當代衰老研究中的核心通路[24]。該通路中daf-2可與細胞外的胰島素配體相結合而促使PI3K激活age-1的表達，進而通過一系列信號傳導激活下游AKT/PKB同源物[25-27]。AKT-1，AKT-2和SGK-1組成的蛋白復合物受到因PDK-1磷酸化作用而被激活，并抑制IIS傳導通路若干下游基因（如daf-16）活性，繼而直接影響線蟲壽命[28]；而IIS傳導通路下游基因還可以調控mTOR傳導通路上游基因所形成的蛋白聚合體的生物學狀態，繼而影響壽命[29-30]。IIS傳導通路下游基因（如TSC1[31]和daf-16[28]）和mTOR傳導通路上游基因（如RHEB[32]和AKT1S1[33]）的表達情況如何受乙醇攝入的影響將在本實驗基礎上詳細研究并另行報道。

通過實驗檢測第8、12天線蟲體內age-1、pdk-1、akt-1和let-363的基因表達情況可知，上述基因隨著衰老進程均呈現表達量上升趨勢，但喂食400 mmol/L乙醇可顯著抑制上述基因的表達。可以推斷，一定劑量乙醇的攝入有效抑制age-1和let-363基因的表達，在IIS傳導通路中age-1基因的下游基因pdk-1表達量下降，akt-1基因表達因受到pdk-1的調控作用表達同樣受到抑制。與此同時，mTOR傳導通路中let-363基因也因乙醇的攝入以及IIS傳導通路下游基因的抑制作用而表達下降，進而調控一系列與衰老調控相關的基因導致壽命的延長。由此可見，乙醇的增壽作用是通過調控IIS和mTOR兩個傳導通路共同實現的（圖3）。

圖3 乙醇對秀麗隱桿線蟲延壽作用的分子機制Fig. 3 Molecular mechanism for the effect of ethanol on lifespan extension in C. elegans

所以通過調節飲食來調節某一生物個體的壽命長短在理論上是可行的，但是任何一種生物的壽命調控的具體分子機制是非常復雜的，在本研究的基礎上，乙醇攝入如何帶來IIS傳導通路若干下游基因和mTOR傳導通路若干上游基因的表達變化，以及這些基因表達變化如何在更深入的分子水平上影響線蟲的壽命，值得我們進一步研究。

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Effect of Ethanol on Caenorhabditis elegans Lifespan and Its Potential Molecular Mechanisms

WANG Jin, WANG Hongyuan, JIN Lingling, GUO Changlu, ZHANG Zhizhou*
(School of Marine Science and Technology, Harbin Institute of Technology (Weihai), Weihai 264200, China)

In this paper, the effect of ethanol on Caenorhabditis elegans lifespan was investigated by culturing it in a medium with different concentrations (4, 40 and 400 mmol/L) of ethanol. The results showed that 400 mmol/L ethanol could significantly extend the median lifespan by 11.76% and the mean lifespan by 15.78% (P 〈 0.05). The expression of lifespan-related genes (age-1, pdk-1, akt-1 and let-363) was detected using real-time quantitative polymerase chain reaction(qPCR) to explore the potential molecular mechanisms. Our results demonstrated that ethanol induced lifespan extension in C. elegans could be due to the suppressed expression of the above four genes and consequent regulation of the downstream genes in both the insulin/IGF signalling (IIS) and mammalian target of rapamycin (mTOR) pathways.

Caenorhabditis elegans; longevity; ethanol; signaling pathways

10.7506/spkx1002-6630-201721026

TS201.4

A

1002-6630（2017）21-0165-05

王晉, 王虹元, 金玲玲, 等. 乙醇對秀麗隱桿線蟲壽命的影響及其分子機理[J]. 食品科學, 2017, 38(21): 165-169.

10.7506/spkx1002-6630-201721026. http://www.spkx.net.cn

WANG Jin, WANG Hongyuan, JIN Lingling, et al. Effect of ethanol on Caenorhabditis elegans lifespan and its potential molecular mechanisms[J]. Food Science, 2017, 38(21): 165-169. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721026. http://www.spkx.net.cn

2016-07-14

國家自然科學基金面上項目（31071170）；BIOX研究室啟動資金項目（HIT0904）

王晉（1991—），男，碩士研究生，研究方向為分子生物學。E-mail：490764656@qq.com

*通信作者：張治洲（1967—），男，教授，博士，研究方向為分子生物學、生物信息學。E-mail：15066317512@163.com