發酵黃漿水乳酸菌的篩選及其制備工藝的研究

陳大衛+陸文琨+黃玉軍+張玉律+蔡潤嫻

摘 要：該文以黃漿水作為培養物，研究不同乳酸菌發酵黃漿水對致病菌大腸桿菌的抑菌作用，通過單因素試驗和正交試驗研究具有抑菌功能的發酵黃漿水的最佳發酵條件和碳氮源組成。結果表明：嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）TY947-4黃漿水發酵液的pH較低、酸度和活菌數較高，分別為3.91、84.66°T及9.21×108CFU/mL，對大腸桿菌的抑菌能力較強，抑菌圈直徑為18.13mm；S.thermophilus TY947-4發酵黃漿水的最適發酵條件為：添加1.5%的葡萄糖，0.5%的魚粉蛋白胨及0.5%的酵母膏，接種量為6%，39℃發酵48h，對大腸桿菌的抑菌圈直徑達到22mm。

關鍵詞：乳酸菌；抑菌；發酵黃漿水

中圖分類號 S816 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）20-0014-05

Screening of Lactic Acid Bacteria of Fermented Yellow Serofluid and its Fermentation Conditions

Chen Dawei et al.

（Key Laboratory of Dairy Biological Technology and Safety Control，College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Abstract：The antimicrobial of lactic acid bacteria （LAB） of fermented yellow serofluid were studied，the enteropathogenic Escherichia coli （E.coli） was used as indicate bacteria，and the optimum fermentation conditions of fermented and the composition of carbon and nitrogen sources were researched by single -factortest and orthogonal test.The results showed that the pH of Streptococcus thermophilus TY947-4 fermentation liquid was low，and the acidity and the viable count of LAB was higher than other strains，whcih were 3.91，84.66°T and 9.21×108CFU/mL respectively，and the antibacterial activity of E.coli was also higher，the diameter of inhibition was 18.13mm.The optimized fermentation conditions of S.thermophilus TY947-4 of fermented yellow serofluid were 39 oC，fermented 48h and 6% inoculation amount，and carbon source and nitrogen source were 1.5% glucose，0.5% peptone and 0.5% yeast extract meal ，the diameter of inhibition E.coli was 22mm.

Key words：Lactic acid bacteria；Antibacterial；Fermented yellow serofluid

黃漿水是在豆腐加工過程中產生的副產物，含有可溶性糖類、低聚糖、大豆異黃酮、蛋白質、膳食纖維及無機鹽等豐富的營養物質，由于是富營養化物質，黃漿水的化學需氧量較高，直接排放會對環境造成嚴重污染。目前我國對于豆腐黃漿水的綜合利用，主要是回收黃漿水中的營養成分[1，2]或以其作為發酵基質，生產蝦青素、維生素、曲酸、核黃素等功能性物質[3]。

隨著生物技術水平的發展，天然生物抗菌劑已被越來越多的應用于食品中，對食品中的多種有害微生物均有較強的殺滅作用，能快速抑制其生長。乳酸菌作為人體腸道中重要的益生菌，具有調節腸道菌群結構、改善胃腸道功能、增強機體的抗氧化能力及免疫力等功能[4]，被廣泛的應用于食品發酵，除了能夠增強食品的功能性外，還可以改善食品風味，并延長食品的保質期等[5]。研究[6]還發現，應用乳酸菌發酵黃漿水不僅可以獲得具有功能性的營養成分，還可以代謝異黃酮、蛋白質等物質，從而獲得生產性能優越的抗菌劑。有研究[7]表明，不同的乳酸菌發酵黃漿水的產酸能力不同，不同的發酵條件、碳源、氮源及其含量也對發酵黃漿水的抑菌能力產生了較大的影響。為此，本文以黃漿水為發酵基質，篩選出發酵黃漿水產生抑菌效果較好的乳酸菌，并研究其發酵工藝，在豐富了利用黃漿水手段的同時，也為天然抑菌劑的開發利用提供理論基礎。

1 試驗材料與設備

1.1 試驗材料 黃漿水：揚州市維揚豆制品廠；MRS液體培養基、LB培養基：北京陸橋技術有限責任公司；碳酸氫鈉、氫氧化鈉、過氧化氫、磷酸二氫鉀、鹽酸、氯化鈉、無水乙醇：分析純，均為國藥集團化學試劑有限公司提供；大腸桿菌（Escherichia coli SDZC07）：揚州大學醫學院提供；試驗菌株：揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室分離保藏。

1.2 試驗設備 JF-SX-500全自動滅菌鍋：日本TOMY公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；WS2-134-75培養箱：上海躍進醫療器械一廠；S-25型數顯pH計：上海精密科學儀器有限公司；Legend mach1.6R高速冷凍離心機：美國塞默飛世爾科技有限公司。endprint

2 試驗方法

2.1 乳酸菌的活化 將實驗室保藏的乳酸菌按3%接種量接種于MRS培養基中，37℃培養24h，4℃冷藏備用。

2.2 大腸桿菌的活化 將大腸桿菌接種于LB液體培養基中，37℃培養18h，利用平板計數法測定其活菌數，用滅菌的培養基調節其活菌濃度，使其活菌數在108CFU/mL，4℃冷藏備用。

2.3 乳酸菌的篩選 黃漿水于115℃滅菌20min后接入10%的乳酸菌，37℃培養24h，測定其pH，并參照GB 5009.239-2016[8]的方法測定其酸度，同時利用平板計數法測定乳酸菌的活菌數。采用單層瓊脂平板擴散法測定發酵液的抑菌能力，取菌液濃度為108CFU/mL的大腸桿菌菌液0.20mL涂布于LB培養基平板上，待菌液固定在培養基表面后打孔，然后將黃漿水發酵液注入孔內至滿孔，于37℃培養10h，觀察并測量抑菌圈直徑，本試驗需重復3次。判定標準為：無抑菌圈為不抑菌，10～15mm為低度抑菌，15～20mm為中度抑菌，大于20mm為高度抑菌。

2.4 黃漿水的發酵條件

2.4.1 發酵溫度 將乳酸菌以10%的接種量接種于黃漿水中，分別在30℃、33℃、36℃、39℃、42℃條件下培養24h。測定發酵液的抑菌活性，確定最適培養溫度。

2.4.2 發酵時間 將乳酸菌以10%的接種量接種于黃漿水中，在37℃條件下分別培養24h、36h、48h、60h、72h。測定發酵液的抑菌活性，確定最適培養時間。

2.4.3 乳酸菌接種量 將乳酸菌分別以2%、4%、6%、8%、10%的接種量接種于黃漿水中，在37℃條件下培養24h。測定發酵液的抑菌活性，確定最適接種量。

2.4.4 正交試驗 根據單因素試驗結果，選擇發酵溫度、發酵時間和接種量為影響因素，利用SPSS 17.0軟件中的3因素3水平正交設計，對試驗結果進行分析。

2.5 碳源的確定 在黃漿水中分別添加2%和4%的蔗糖、乳糖、葡萄糖，按上述發酵條件中確定的發酵溫度、時間及接種量來發酵黃漿水。測定發酵液的抑菌活性，進而確定最適碳源。

2.6 復合氮源的確定 將乳清蛋白粉、魚粉蛋白胨及酵母膏分別以0%、0.5%、1%的添加量添加到黃漿水中，測定發酵液的抑菌活性。設計三因素三水平正交p試驗，確定氮源的最優添加組合，選取的因素及水平見表1。

3 結果與分析

3.1 乳酸菌發酵黃漿水對大腸桿菌的抑制作用

3.1.1 發酵液pH、酸度以及活菌數 將乳酸菌按10%的接種量接種于滅菌的黃漿水，37℃培養24h后，測定其pH、酸度以及活菌數，結果見表2。由表2可知，12株乳酸菌的黃漿水發酵液的pH值在3.6～4.6，其中菌株978-4的pH值為3.63，顯著低于其他菌株（P<0.05）；菌株TY947-4、MY087-2、LH100-1、978-4及V9的發酵液酸度均大于80°T，顯著高于其他菌株（P<0.05）；而菌株TY947-4、978-4及V9發酵液的活菌數均在9.0×108CFU/ml以上，顯著高于其他菌株（P<0.05）。

3.1.2 發酵液抑菌活性的測定 采用單層瓊脂平板擴散法測定了12株乳酸菌的黃漿水發酵液對大腸桿菌的抑菌活性，結果見圖1。由圖1可知，12株乳酸菌的黃漿水發酵液對大腸桿菌均有一定的抑制作用。其中菌株TY947-4的抑菌圈直徑為18.13mm，為中度抑菌，顯著高于V3、LPRA-1、T2等7株乳酸菌（P<0.05）。結合3.2 發酵條件的確定

3.2.1 發酵溫度、時間及接種量的確定 將乳酸菌按照不同的接種量接種至黃漿水中進行發酵，以確定接種量、發酵溫度及時間，結果見圖2。由圖2A可知，當發酵溫度在39℃時，TY947-4發酵液的抑菌圈直徑最大，但在大于39℃后，抑菌能力有所下降，表明TY947-4在黃漿水中的最適發酵溫度為39℃。由圖2B可知，當發酵時間為48h時，TY947-4發酵液的抑菌圈直徑最大，但發酵時間在大于48h后，抑菌能力有所下降，表明TY947-4在黃漿水中的最適發酵時間為48h。由圖2C可知，當TY947-4接種量為6%時，TY947-4發酵液的抑菌能力最強。

3.2.2 發酵條件的正交優化 在單因素研究的基礎上，采用L9（34）對培養基組成進行優化。表3為培養基組成的因素與水平設計表，正交試驗結果見表4。由表4可知，發酵條件中影響抑菌能力的各因素的主次關系為C（接種量）>A（發酵溫度）>B（發酵時間）。從k值得出發酵液的最佳培養條件為A2B3C2，即發酵溫度為39℃，發酵時間為48h，接種量為6%。

3.3 碳源及氮源對菌株發酵液抑菌活性的影響

3.3.1 碳源的確定 分別選擇蔗糖、乳糖、葡萄糖作為唯一碳源，39℃發酵48h后測定發酵液的抑菌能力，結果如圖3所示。由圖3可知，TY947-4在以葡萄糖為唯一碳源的培養基中抑菌能力顯著強于其他碳源（P<0.05），但在含4%葡萄糖的黃漿水中的抑菌能力與2%葡萄糖無顯著性差異（P>0.05），由此可見2%的濃度已經達到菌株的生長需求。因此選擇2%及低于2%的濃度進行進一步實驗，確定培養基中最佳的碳源濃度。

3.3.2 葡萄糖添加量對菌株發酵液抑菌活性的影響 選擇葡萄糖添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%和2.0%，進一步確定最適的添加量，結果見圖4。由圖4可知，當葡萄糖添加量為1.5%時，抑菌圈直徑最大，添加量在1.5%～2%時，抑菌圈直徑逐漸下降，表明葡萄糖添加量為1.5%時，黃漿水發酵液的抑菌能力最強。

3.3.3 復合氮源對菌株抑菌活性的影響 分別將乳清蛋白粉、魚粉蛋白胨、酵母膏作為氮源，以0%、0.5%，1.0%的添加量添加到黃漿水中，設計三因素三水平的正交試驗。表5為復合氮源的因素與水平設計表，正交試驗結果見表6。由表6可知，復合氮源中影響抑菌能力的各因素的主次關系為A（乳清蛋白粉）>B（魚粉蛋白胨）>C（酵母膏）。從k值得出發酵液的最佳培養基配方為A1B2C2，即加入0.5%的酵母膏，0.5%的魚粉蛋白胨。endprint

4 結論與討論

本文研究表明，以黃漿水作為發酵基質的乳酸菌的產酸能力較好，對乳酸菌的抑菌能力有一定的促進作用，試驗發現，乳酸菌發酵黃漿水的酸度上升和pH下降存在著較強的一致性，表明乳酸等代謝產物會引起pH的下降。試驗菌株中，TY947-4的抑菌能力最強，但產酸能力并不是最高，表明除了酸性物質外，其他一些代謝物質也對抑菌產生重要的影響；乳酸菌還可以通過代謝產生CO2造成厭氧環境來抑制需氧細菌的生長，同時還可以通過增加環境中CO2的濃度來降低細胞內pH值和酶活性，并通過減弱細胞膜的傳遞功能來抑制一些致病菌的生長[4]；乳酸菌產生的過氧化氫能夠激活過氧化氫酶-硫氰酸系統，抑制和殺滅革蘭陰性菌、過氧化氫酶陽性等細菌。同時，黃漿水中的異黃酮及其代謝產物也對致病菌具有一定的抑菌效果[9]。

本研究發現，當發酵溫度、發酵時間及接種量在一定的范圍內會促進乳酸菌的抑菌能力，但是當溫度、時間及接種量進一步增大時，反而抑制了乳酸菌的的抑菌能力，表明在發酵過程中，過多的代謝產物使得乳酸菌的生長產生了自限性[10]。試驗還研究了蔗糖、乳糖及葡萄糖作為碳源對TY947-4發酵黃漿水抑菌能力的影響，結果發現，葡萄糖可以顯著的提高發酵黃漿水對大腸桿菌的抑菌能力，表明葡萄糖作為碳源可以增加TY947-4代謝產物中抑菌物質的產生。活菌數對代謝產物有較大的影響，有研究表明乳清蛋白粉、蛋白胨及酵母膏等氮源對嗜熱鏈球菌的促生長作用具有一定的特異性[11]。本文研究發現，0.5%的酵母膏和0.5%的魚粉蛋白胨作為TY947-4的復合氮源發酵的黃漿水抑制大腸桿菌的能力較強，表明TY947-4代謝0.5%酵母膏和0.5%魚粉蛋白胨產生的抑菌物質較多。接種6%的S.thermophilus TY947-4至黃漿水中，并添加1.5%的葡萄糖、0.5%的酵母膏及0.5%的魚粉蛋白胨，在39℃發酵48h，其對大腸桿菌的抑菌能力較高。本文在體外篩選并優化了乳酸菌發酵黃漿水抑制大腸桿菌的發酵條件，其在腸道內的抑菌效果還需要在體內試驗中進一步驗證。

參考文獻

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