改進HPLC法測定雷替曲塞原料藥中的光學異構體

戴蓉，徐家根，刁巖忠（1.南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院藥學部，南京210004；2.南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院藥學部，南京210008；.南京優(yōu)科生物醫(yī)藥集團股份有限公司，南京210009）

改進HPLC法測定雷替曲塞原料藥中的光學異構體

戴蓉1＊，徐家根2#，刁巖忠3（1.南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院藥學部，南京210004；2.南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院藥學部，南京210008；3.南京優(yōu)科生物醫(yī)藥集團股份有限公司，南京210009）

目的：改進高效液相色譜法測定雷替曲塞原料藥中的光學異構體。方法：對色譜柱、流動相和進樣量進行改進，改進后的色譜柱為CHIRALPAK AD-H，流動相為正己烷-無水乙醇-三氟乙酸（70∶30∶0.1，V/V/V），進樣量為100 μL，流速為1.0 mL/min，檢測波長為226 nm，柱溫為35℃。結果：光學異構體檢測進樣量線性范圍為99.68～398.7 ng（r＝0.999 9）；定量限為4.945 ng，檢測限為1.648 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜1.0%；加樣回收率為99.43%～100.14%（RSD＝0.25%，n＝9）。結論：改進后的方法簡便、準確、靈敏度高、重復性好，可用于測定雷替曲塞原料藥中的光學異構體。

雷替曲塞原料藥；光學異構體；高效液相色譜法；方法改進

雷替曲塞（Raltitrexed）最初是由英國Zeneca公司和Royal Marsden醫(yī)院合作開發(fā)的一種喹唑啉葉酸鹽類似物，于1996年首先在英國申請獲準上市，商品名為Tomudex[1]。2009年，我國原國家食品藥品監(jiān)督管理局批準南京正大天晴制藥有限公司國產(chǎn)雷替曲塞制劑上市，商品名為賽維健。雷替曲塞屬于細胞毒抗腫瘤藥物，直接對胸苷酸合成酶（TS）起到抑制作用，可用于治療不適合5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸與亞葉酸鈣的晚期結直腸癌患者[2-3]。已有研究表明，雷替曲塞還可用于治療惡性胸膜瘤、胰腺癌、頭頸癌、食管癌、胃癌等實體瘤，療效顯著，耐受性好[4-5]，具有較好的臨床應用前景。

雷替曲塞分子結構中存在一個手性中心，除雷替曲塞主成分外，只具有一個手性異構體，即光學異構體。大多數(shù)情況下，其中一種光學異構體具有藥理活性，而另一種異構體活性很差，甚至有毒副作用，因此對光學異構體的分析控制極為重要[6]。雷替曲塞原料藥收載于我國國家藥品標準[7-8]中，其采用高效液相色譜法（HPLC）測定其光學異構體，色譜柱填料為α-酸性糖蛋白鍵合硅膠，該填料容易變性失活、發(fā)霉變質(zhì)，使色譜柱耐用性差，從而增加檢驗成本；且對有機相的種類和濃度選擇均有一定限制，對使用溫度、壓力及流動相中緩沖鹽濃度和pH要求苛刻；同時，該色譜柱的載樣量小，易受污染和累積殘留，柱效低，導致方法重復性差，影響了其應用及推廣[9-10]。鑒于此，筆者參考文獻[11-18]，改用CHIRALPAK AD-H色譜柱，并對流動相和進樣量進行了改進，建立了以HPLC法測定雷替曲塞原料藥中光學異構體的方法，以期為該原料藥質(zhì)量標準的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AB型HPLC儀，包括CBM-20A系統(tǒng)控制器、DGU-20A3真空脫氣機、SPD-M20A二極管陣列檢測器、LC-20AB輸液單元、SIL-20AC自動進樣器、CTO-20AC柱溫箱、LabSolutions色譜工作站（日本Shimadzu公司）；XS205型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Biosafer SB25-12DTD型超聲波清洗儀（上海諾頂儀器設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

雷替曲塞原料藥（南京優(yōu)科制藥有限公司，批號：20150101、20150102、20150103）；光學異構體對照品（南京優(yōu)科制藥有限公司，批號：20141022，純度：98.6%）；正己烷和無水乙醇為色譜純，其作試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：CHIRALPAK AD-H（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：正己烷-無水乙醇-三氟乙酸（70∶30∶0.1，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：226 nm；柱溫：35℃；進樣量：100 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液取光學異構體對照品約10 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加甲醇1 mL，超聲（功率：600 W，頻率：40 kHz，下同）處理5 min使溶解，用流動相定容，搖勻，精密量取5 mL，置于50 mL量瓶中，用流動相定容，搖勻，即得對照品貯備液；精密量取對照品貯備液5 mL，置于50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取樣品約10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇1 mL，超聲處理5 min使溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 系統(tǒng)適用性溶液取樣品約10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇1 mL，超聲處理5 min使溶解，再加入“2.2.1”項下的對照品貯備液1 mL，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對照溶液取甲醇1 mL，置于10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下陰性對照溶液、系統(tǒng)適用性溶液、對照品溶液和供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，光學異構體與雷替曲塞主成分峰之間能達到基線分離，分離度＞2.5；理論板數(shù)以光學異構體峰計為8 226，保留時間為24.9 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下對照品貯備液適量，分別用流動相定量稀釋制成每1 mL中約含光學異構體1.0、1.4、2.0、2.4、3.0、4.0 μg的系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以光學異構體進樣量（x，ng）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得光學異構體回歸方程為y＝1 932.9x－27 462（r＝0.999 9）。結果表明，光學異構體檢測進樣量線性范圍為99.68～398.7 ng。

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ為4.945 ng；當信噪比為3∶1時，得LOD為1.648 ng。

2.6 精密度試驗

分別精密量取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果，光學異構體峰面積的RSD＝0.41%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20150101）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，光學異構體峰面積的RSD＝0.73%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：20150101）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算光學異構體的含量。結果，光學異構體含量的平均值為0.076‰，RSD＝0.62%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取樣品（批號：20150101）約10 mg，精密稱定，共9份，分別置于10 mL量瓶中，各加入低、中、高質(zhì)量的光學異構體對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

2.10 樣品中光學異構體測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算光學異構體含量，并與國家藥品標準收載方法進行結果比較[該標準中色譜柱為α-酸性糖蛋白鍵合硅膠色譜柱，流動相為0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液（用稀磷酸調(diào)節(jié)pH為6.5）-異丙醇（98∶2，V/V），進樣量為10 μL]，詳見表2（注：“-”為未檢出）。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

表2 樣品中光學異構體測定結果（n＝3，%）Tab 2 Results of optical isomers determination in samples（n＝3，%）

3 討論

3.1 色譜柱及流動相的選擇

[12-14]，采用CHIRALPAK AD-H手性色譜柱，該色譜柱以表面涂布直鏈淀粉-三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）的硅膠為填料，對大多數(shù)消旋體均具有極高的手性識別能力。因此，選擇上述色譜柱進行試驗。

考慮到雷替曲塞化學結構中含有2個羧基，加入一定濃度的有機酸調(diào)節(jié)流動相的pH可以減弱手性固定相與主成分之間的分子間作用力，故加入酸性較強的三氟乙酸，從而可改善峰形，抑制色譜峰拖尾[11]。經(jīng)優(yōu)化，最終選用的流動相為正己烷-無水乙醇-三氟乙酸（70∶30∶0.1，V/V/V）。

3.2 專屬性考察

破壞性試驗中用到的酸、堿、強氧化劑等都屬水溶液，含水樣品進入正相色譜系統(tǒng)中，對手性色譜柱填料會造成不可逆的破壞，故為避免色譜柱受損傷，未進行破壞性試驗相關研究。但在預試驗中，筆者將起始物料、各步反應中間體、已知工藝雜質(zhì)、降解雜質(zhì)和反應粗品（含未知雜質(zhì)）等，與光學異構體對照品按比例混合，進行專屬性試驗研究，考察各雜質(zhì)與光學異構體峰之間的分離度是否符合要求。結果，各雜質(zhì)在光學異構體保留時間處均未出峰，在二極管陣列檢測器中顯示，各溶液中光學異構體峰純度指數(shù)均＞0.998。說明各有關物質(zhì)對光學異構體的檢測無干擾，本法專屬性良好。

綜上所述，改進后的方法簡便、準確、靈敏度高、重復性好，可用于測定雷替曲塞原料藥中的光學異構體。

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Determination of Optical Isomers in Raltitrexed Raw Material by Modified HPLC

DAI Rong1，XU Jiagen2，DIAO Yanzhong3（1.Dept.of Pharmacy，Obstetrics and Gynecology Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210004，China；2.Dept.of Pharmacy，Stomatological Hospital Affiliated to Medical College of Nanjing University，Nanjing 210008，China；3.Nanjing YOKO Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Nanjing 210009，China）

OBJECTIVE：To improve HPLC method for determining optical isomers in raltitrexed raw material.METHODS：After improved，the column was CHIRALPAK AD-H with mobile phase consisted of n-hexane-anhydrous ethanol-trifluoroacetate（70∶30∶0.1，V/V/V）.The sample size was 100 μL.The flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 226 nm，and column temperature was 35℃.RESULTS：The linear range of optical isomers was 99.68-398.7 ng（r＝0.999 9）.The quantitation limit was 4.945 ng，and detection limit was 1.648 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 1.0%；the recoveries ranged 99.43%-100.14%（RSD＝0.25%，n＝9）.CONCLUSIONS：The optimized method is simple，accurate，sensitive and reproducible，which can be used for the determination of optical isomers in raltitrexed raw material.

Raltitrexed raw material；Optical isomers；HPLC；Method improvement

R917

A

1001-0408（2017）30-4295-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.32

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學、藥物分析。電話：025-52226272。E-mail：rongdai88@126.com

#通信作者：副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學、藥物分析。電話：025-83620369。E-mail：Xjg.234@163.com

2017-05-28

2017-07-28）

（編輯：劉柳）