清痹顆粒的HPLC指紋圖譜研究Δ

清痹顆粒的HPLC指紋圖譜研究Δ

目的：建立清痹顆粒的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Diamonsil C18，流動相為甲醇-0.3%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為260 nm，柱溫為25℃，進樣量為10 μL。以黃芩苷為參照，測定10批樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2.0版）進行共有峰指認和相似度評價。結果：10批清痹顆粒的HPLC圖譜有29個共有峰，相似度均＞0.90。經驗證，10批樣品HPLC圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性。結論：該研究所建指紋圖譜可為清痹顆粒的鑒別和質量評價提供參考。

清痹顆粒；指紋圖譜；高效液相色譜法

清痹顆粒是長春中醫藥大學附屬醫院的院內制劑，由土茯苓、白花蛇舌草、青風藤、絡石藤、薏苡仁、黃芩、蒼術、枳實、香附、大黃、甘草等11味中藥組合而成，用于風濕熱痹證的治療，具有清熱解毒、疏風除濕、活血通絡的功效。方中青風藤、絡石藤，一則其性俱涼，功在清熱解毒，二則均為藤類藥材，皆能通經入絡，治一切歷節風痛；土茯苓、白花蛇舌草、黃芩、薏苡仁、枳實、蒼術有加強清熱解毒之功，且能除濕利水消腫，尤其是土茯苓、枳實、蒼術、薏苡仁能健脾胃、去脾濕、絕水濕之源；香附能活血通絡行氣；大黃瀉火解毒、活血祛瘀；甘草調和諸藥；諸藥相合，共達清熱解毒、疏風除濕、活血通絡之目的。清痹顆粒臨床應用廣泛，但質量控制目前只限于薄層色譜鑒別，未發現其指紋圖譜分析研究的報道。本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立清痹顆粒的指紋圖譜[1]，為進一步提高其質量控制標準提供依據。

1 材料

1.1 儀器

1220型HPLC儀，包括紫外檢測器（美國Agilent公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204E型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

清痹顆粒[長春中醫藥大學附屬醫院制劑室自制，批號：160101、160102、160103、160401、160402、160403、161201、161202、161203、161204（編號：S1～S10），規格：5.0 g/袋]；黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201016，純度：＞99%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～30 min，25%→35%A；30～45 min，35%→40%A；45～60 min，40%A；60～70 min，40%→50%A；70～80 min，50%→60%A；80～90 min，60%→70%A；90～100 min，70%→80%A；100～110 min，80%→90%A；110～115 min，90%→25%A；115～120 min，25%A）[2-6]；流速：1.0 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL[2-4]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液稱取黃芩苷對照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成黃芩苷質量濃度為0.098 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取樣品適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：160103）適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以黃芩苷的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，29個共有峰相對保留時間的RSD＜1.3%（n＝6），相對峰面積的RSD＜2.2%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：160103）適量，分別于室溫下放置0、4、8、10、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以黃芩苷的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，29個共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD＜1.8%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置12 h內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗精密稱取同一批樣品（批號：160103）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以黃芩苷的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，29個共有峰相對保留時間的RSD＜1.0%（n＝6），相對峰面積的RSD＜2.3%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成取10批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2.0版）對10批樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

圖1 10批樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 10 batches of samples

圖2 樣品HPLC對照指紋圖譜Fig 2 Control HPLC fingerprints of 10 batches of samples

2.4.2 相似度分析采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2.0版）對10批樣品的HPLC圖譜進行比較分析。結果，10批樣品（S1～S10）相似度均＞0.90，表明10批樣品質量穩定，詳見表1。

表1 10批樣品相似度評價結果Tab 1 Similarity evaluation of 10 batches of samples

2.4.3 共有峰相關數據分析采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2.0版）對10批樣品的HPLC圖譜進行比較分析。結果，10批樣品共有29個共有峰，通過對照品HPLC圖譜確定4號峰為黃芩苷。以4號峰為參照峰，計算其他共有峰對4號峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表2、表3。

表2 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時間Tab 2 Relative retention time of common peaks inHPLC fingerprints of 10 batches of samples

3 討論

本試驗分別對乙腈-磷酸溶液和甲醇-磷酸溶液作為流動相進行了考察[5]，結果，甲醇-0.3%磷酸溶液為流動相（梯度洗脫）時，其洗脫能力強，所得色譜信息量大，分離度較好。因此，選擇甲醇-0.3%磷酸溶液（梯度洗脫）作為流動相。本試驗還考察了不同廠家和型號的色譜柱Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、ACE C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）[6-7]，結果，選用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）時，樣品的分離效果較好。同時，本試驗通過全波長檢測發現，在260 nm波長處時各色譜峰比例適中，故選擇以260 nm作為檢測波長。

表3 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積Tab 3 Relative peak areas of common peaks in HPLCfingerprints of 10 batches of samples

本試驗通過對10批清痹顆粒的指紋圖譜分析，標定了29個共有峰，且各共有峰匹配較好，相似度均＞0.90，表明清痹顆粒各批質量穩定。結果提示，可利用本指紋圖譜指導生產，以控制藥材對成品的影響[8-10]，為清痹顆粒的鑒別和質量控制提供參考。

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白雪潔1＊，于淼2#，劉秀華3，白雪媛4，李慶杰4（1.長春醫學高等專科學校藥學系，長春130031；2.長春三德天晟科技有限公司，長春130012；3.吉林省中醫藥科學院，長春130012；4.長春中醫藥大學研發中心，長春130117）

Study on HPLC Fingerprint of Qingbi Granules

BAI Xuejie1，YU Miao2，LIU Xiuhua3，BAI Xueyuan4，LI Qingjie4（1.Dept.of Pharmacy，Changchun Medical College，Changchun 130031，China；2.Changchun Sande Tiansheng Technology Co.，Ltd.Changchun 130012，China；3.Jilin Province Academy of TCM Sciences，Changchun 130012，China；4.Research&Development Center，Changchun University of TCM，Changchun 130117，China）

OBJECTIVE：To establish HPLC fingerprint of Qingbi granules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Diamonsil C18column with mobile phase consisted of methanol-0.3%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 260 nm，and column temperature was 25℃.The sample size was 10 μL.Using baicalin as reference，HPLC chromatograms of 10 batches of samples were determined.Common peak identification and similarity evaluation were performed by using TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation Software（2.0 edition）.RESULTS：There were 29 common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of samples.The similarity among the 10 batches was more than 0.90.After validation，HPLC chromatograms of 10 batches of samples were in line with control fingerprints.CONCLUSIONS：Established fingerprints can provide reference for identification and quality evaluation of Qingbi granules.

Qingbi granules；Fingerprint；HPLC

R282.5

A

1001-0408（2017）30-4282-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.28

2017-03-17

2017-06-13）

（編輯：張靜）