鼻寧噴霧劑的HPLC指紋圖譜研究Δ

王森，邱玉玲，熊永愛，歐水平，王玉和#（.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義563003；.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義563099）

鼻寧噴霧劑的HPLC指紋圖譜研究Δ

王森1＊，邱玉玲1，熊永愛1，歐水平2，王玉和2#（1.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義563099）

目的：建立鼻寧噴霧劑的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Neptune C18，流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為326 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μL。以蘆丁為參照，測定20批樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行共有峰指認(rèn)和相似度評價(jià)。結(jié)果：20批鼻寧噴霧劑的HPLC圖譜有40個(gè)共有峰，相似度均＞0.9。經(jīng)驗(yàn)證，20批樣品HPLC圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜可為鼻寧噴霧劑的鑒別和質(zhì)量評價(jià)提供參考。

鼻寧噴霧劑；高效液相色譜法；指紋圖譜；蘆丁

鼻寧噴霧劑是鼻科苗藥品種，由鵝不食草和一枝黃花藥材經(jīng)水提醇沉工藝制得，具有疏風(fēng)解表、清熱通竅之功效，臨床用于治療急性、慢性單純性和過敏性鼻炎等癥狀。鵝不食草和一枝黃花藥材均為菊科植物，所含化學(xué)成分復(fù)雜，均含揮發(fā)油和黃酮類、萜類、甾醇類成分。但該品種現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[WS-10548（ZD-0548）-2002-2012Z]

中僅鑒別兩味藥材和測定蘆丁的含量，難以全面綜合評價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量[1]。目前，各地方的鵝不食草和一枝黃花藥材標(biāo)準(zhǔn)參次不齊[2-5]，幾乎均僅限藥材鑒別和單一成分含量測定。中藥高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜能全面地反映化學(xué)成分信息，已廣泛用于中藥材或中成藥的質(zhì)量控制。因此，本試驗(yàn)采用HPLC法對鼻寧噴霧劑進(jìn)行指紋圖譜研究，以為全面有效控制該制劑的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括DAD檢測器（美國Agilent公司）；BT125D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；JA1002型電子分析天平（上海浦春計(jì)量儀器有限公司）；Exceed-Cd-20型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（成都艾科水處理設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑

鼻寧噴霧劑[百花醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號：20150807、20150815、20150827、20150904、20150912、20150920、20151009、20151017、20151030、20151104、20151114、20151128、20151203、20151214、20151224、20160106、20160112、20160120、20160209、20160217（S1～S20），規(guī)格：10 mL/瓶]；綠原酸對照品（批號：110753-201415，純度：96.2%）、蘆丁對照品（批號：100080-201409，純度：92.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸A對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：151028，純度：98.2%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

1.3 藥材

鵝不食草、一枝黃花藥材均購于貴州省畢節(jié)市玲源中藥材行，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院楊建文主任藥師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Neptune C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，10%→15%A；15～25 min，15%→20%A；25～55 min，20%→35%A；55～65 min，35%→10%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：326 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL[6-8]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液取待測成分對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶液制成綠原酸、蘆丁和異綠原酸A質(zhì)量濃度分別為140.00、403.60、322.56 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取樣品適量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液按鼻寧噴霧劑處方和工藝分別制備缺鵝不食草、一枝黃花藥材的單一陰性樣品和雙陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成單一陰性對照溶液和雙陰性對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：20150807）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以蘆丁的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，40個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD＜0.5%（n＝6），相對峰面積的RSD＜2.5%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：20150807）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以蘆丁的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，40個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD＜2.5%（n＝6），相對峰面積的RSD＜0.5%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批樣品（批號：20150807）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以蘆丁的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，40個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD＜0.3%（n＝6），相對峰面積的RSD＜5%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成取20批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對20批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

圖1 20批樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 20 batches of samples

圖2 樣品HPLC對照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprint of sample

2.4.2 相似度分析采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對20批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果，20批樣品（S1～S20）相似度均＞0.9，表明20批樣品質(zhì)量穩(wěn)定，詳見表1。

2.4.3 共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對20批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果，20批樣品有40個(gè)共有峰。對比藥材圖譜可知，7、23號峰來源于鵝不食草藥材，1～4、6、8～10、12、14、16、18～21、24、31～40號峰來源于一枝黃花藥材，5、11、13、15、17、22、25～30號峰為鵝不食草和一枝黃花藥材共有；對比混合對照品圖譜可知，11號峰為綠原酸，22號峰為蘆丁，28號峰為異綠原酸A。其中，蘆丁峰面積較大且穩(wěn)定，因此選擇22號峰（蘆丁）作為參照峰，計(jì)算其他共有峰相對于22號峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，詳見表2、表3。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

鵝不食草和一枝黃花藥材均含揮發(fā)油、黃酮類、萜類等成分，藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)質(zhì)量研究文獻(xiàn)報(bào)道多選擇黃酮類為指標(biāo)成分，如綠原酸、蘆丁、異綠原酸A、槲皮素和山奈酚等[9-12]。預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)樣品中的槲皮素和山奈酚含量較低，故最終選擇綠原酸、蘆丁和異綠原酸A為指標(biāo)成分。

3.2 指紋圖譜分析

在本研究中，筆者共發(fā)現(xiàn)40個(gè)共有峰，成分歸屬分析表明，12種成分為鵝不食草和一枝黃花藥材共有，包括選擇的指標(biāo)成分綠原酸、蘆丁和異綠原酸A，這與鵝不食草和一枝黃花藥材同屬菊科植物有關(guān)。從20批樣品的相似度分析結(jié)果可知，各批樣品的HPLC圖譜與對照指紋圖譜之間的相似度良好，均＞0.9，表明不同批次鼻寧噴霧劑所含化學(xué)成分基本一致。

表1 20批樣品相似度評價(jià)結(jié)果 Tab 1 Similarity evaluation of 20 batches of samples

表2 20批樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時(shí)間Tab 2 Relative retention time of common peaks in HPLC chromatograms of 20 batches of samples

續(xù)表2Continued Tab 2

綜上所述，本研究所建指紋圖譜可為鼻寧噴霧劑的鑒別和質(zhì)量評價(jià)提供參考。

表3 20批樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積Tab 3 Relative peak area of common peaks in HPLC chromatograms of 20 batches of samples

[1] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10548（ZD-0548）-2002-2012Z[S].2012.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：3、347.

[3] 貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].貴陽：貴州科技出版社，2003：4.

[4] 香港衛(wèi)生計(jì)劃署.香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第七冊[S].2015：111-122.

[5] 香港衛(wèi)生計(jì)劃署.香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第六冊[S].2014：755-766.

[6] 吳靜，程謙凡，孫莉，等.鵝不食草中短葉老鶴草的定量方法研究[J].北方藥學(xué)，2015，12（10）：8-9.

[7] Chan CO，Jin DP，Dong NP，et al.Qualitative and quantitative analysis of chemical constituents of Centipeda minima by HPLC-QTOF-MS&HPLC-DAD[J].J Pharm Biomed Anal，2016，doi：10.1016/j.jpba.2016.04.029.

[8] 賈媛，張恒玉，柴堯，等.東北地區(qū)鐵線透骨草藥材的HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2017，28（9）：1265-1267.

[9] 劉杰，王曙炎，都恒青.氣象色譜法測定鼻塞通噴霧劑中乙酸菊烯酯的含量[J].藥物分析雜志，2005，25（7）：840-842.

[10] 劉杰，侯惠鳴，屠萬倩.鵝不食草揮發(fā)油成分的GC-MS分析[J].中草藥，2002，33（9）：785-786.

[11] 茅向軍，許乾麗，鮑家科，等.一枝黃花高效液相指紋圖譜研究[J].中成藥，2011，33（10）：1657-1659.

[12] 馮華，聶明華，王祥培，等.HPLC法同時(shí)測定一枝黃花藥材中綠原酸、蘆丁和山奈素的含量[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16（4）：904-907.

Study on HPLC Fingerprint of Bining Nasal Spray

WANG Sen1，QIU Yuling1，XIONG Yong’ai1，OU Shuiping2，WANG Yuhe2（1.School of Pharmacy，Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563003，China；2.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563099，China）

OBJECTIVE：To establish HPLC fingerprint of Bining nasal spray.METHODS：HPLC method was performed.The determination was performed on Neptune C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 326 nm，and the column temperature was 25℃.The sample size was 10 μL.Using rutin as reference，HPLC chromatograms of 20 batches of samples were determined.Common peak identification and similarity evaluation were conducted by using Similarity Evaluation System for TCM Fingerprint（2012 edition）.RESULTS：There were 40 common peaks in HPLC chromatograms of 20 batches of Bining nasal spray，with similarity＞0.9.After validation，HPLC chromatograms of 20 batches of samples were in good agreement with the control fingerprints of those.CONCLUSIONS：Established fingerprint can provide reference for identification and quality evaluation of Bining nasal spray.

Bining nasal spray；HPLC；Fingerprint；Rutin

R927

A

1001-0408（2017）30-4278-05

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.27

貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.黔科合SY字〔2015〕3034）；遵義市“15851人才精英工程”科研項(xiàng)目（No.黔科合SY字〔2015〕3034）

＊副教授，博士。研究方向：中藥外用制劑。電話：0851-28642515。E-mail：wangsen912912@126.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0851-28609699。E-mail：1149076068@qq.com

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吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.20160204021YY）

＊講師，碩士。研究方向：天然藥物化學(xué)成分。E-mail：43253545@qq.com

#通信作者：工程師。研究方向：天然藥物化學(xué)成分。E-mail：miao4596@163.com