近紅外漫反射光譜法快速測定丹參藥材中多指標成分的含量Δ

李真，周立紅，楊功俊，葉正良（.中國藥科大學藥物分析教研室，南京0009；.天士力制藥集團股份有限公司，天津30040；3.天士力控股集團有限公司，天津30040）

·藥物分析與檢定·

近紅外漫反射光譜法快速測定丹參藥材中多指標成分的含量Δ

李真1＊，周立紅2，楊功俊1，葉正良3#（1.中國藥科大學藥物分析教研室，南京210009；2.天士力制藥集團股份有限公司，天津300410；3.天士力控股集團有限公司，天津300410）

目的：建立快速測定丹參藥材中多指標成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法測定丹參藥材中丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮類成分（丹參酮ⅡA+丹參酮Ⅰ+隱丹參酮）的含量（作為參考值）。采用偏最小二乘法-近紅外漫反射光譜法建立預測丹參藥材中上述指標成分含量的定量模型：根據參考值，采集143批樣品，以一階導數法預處理光譜，丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮類成分的最佳波段分別為6 773.98～3 981.12、6 670.85～3 996.54、8 544.66～3 936.28、8 188.06～3 875.31 cm－1。結果：丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸和丹參酮類成分含量測定方法學驗證符合要求。丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮類成分的定量校正模型內部交叉驗證相關系數（R2）分別為0.919 0、0.832 2、0.821 5、0.925 6，校正均方差分別為4.46、0.48、1.34、0.71；外部驗證R2分別為0.852 6、0.957 3、0.819 3、0.953 1，均方差分別為9.77、0.28、0.94、0.63。結論：該方法快速、準確、簡便、無污染，可用于丹參藥材中多指標成分含量的快速測定。

近紅外漫反射光譜法；丹參；酚酸；丹參酮；快速測定；含量

中藥材在采購、驗收、入庫、投料過程中存在著質量檢測繁雜、費時長等問題，不能滿足大批量的現場快速分析要求[1]。為解決該問題，有必要研發涵蓋水分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、指標成分等不同檢測項目的快速檢測方法作為企業內控標準，與法定標準一起構建準確、便捷、普適性強的中藥材整體質量快速評價系統，以保障最終制劑產品質量的可控。

近紅外漫反射光譜法（NIR）作為一種快速分析方法，具有很多優點：快速，可實現現場和在線分析；無損；環保；可對固體、液體和氣體樣品直接進行測定，無需復雜的前處理過程[2-6]。隨著儀器與軟件的發展，NIR法己廣泛應用于農業、生物醫學、石油化工等領域[7-8]。

丹參藥材為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，化學成分以丹參酮和酚酸類化合物為主[9]，具有改善模型動物腦缺血再灌注損傷、血液流變學及血小板功能等方面的作用[10]，是復方丹參滴丸成方制劑中一味主要的原藥材[11]。本研究中，筆者以丹參藥材中丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮類成分（丹參酮ⅡA+丹參酮Ⅰ+隱丹參酮）為指標成分，應用NIR技術，并結合偏最小二乘法（PLS），建立了快速通用的多指標成分含量測定方法，為構建基于NIR技術的中藥材整體質量快速評價方法體系提供了一種新的思路。

1 材料

1.1 儀器

AntarisⅡ型傅里葉變換NIR儀，包括漫反射積分球附件、樣品旋轉臺及石英樣品杯、InGaAs檢測器、Result軟件、TQ Analyst 8.0軟件[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；2695型高效液相色譜儀，包括紫外檢測器（美國Waters公司）；高速中藥粉碎機（山東省青州市精誠醫藥裝備制造有限公司）；XS205型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；SK1200B型超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

丹參酮ⅡA對照品（批號：110766-200619，純度：＞98.0%）、迷迭香酸對照品（批號：111871-201102，純度：＞99.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；紫草酸對照品（天津士蘭科技有限公司，批號：20130908，純度：＞98.0%）；丹酚酸B對照品（天士力制藥集團股份有限公司，批號：2013061，純度：＞93.06%）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

143批丹參藥材來源于陜西、山西、四川、甘肅、河南、河北等省，由天士力制藥集團股份有限公司提供，經浙江理工大學梁宗鎖教授鑒定均為真品。

2 方法與結果

2.1 NIR的采集

采樣方式：積分球固體采樣。采集條件：分辨率為8 cm－1，掃描范圍為12 000～3 800 cm－1，掃描64次，每批藥材樣品采集6張光譜，計算平均光譜以建立模型，每次掃描前振蕩樣品杯。藥材樣品的裝樣厚度、裝填的緊密性和顆粒均勻性等在試驗中都力求一致，以減小對結果的影響。143批藥材樣品的近紅外光譜疊加圖見圖1。

圖1 143批藥材樣品的近紅外光譜疊加圖Fig 1 Superposed NIR spectrum of 143 batches of samples

2.2 參考值的測定

2.2.1 丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸的含量測定（1）色譜條件。色譜柱：Diamonsil Plus C1（8250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液（22∶78，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：288 nm；柱溫：20℃；進樣量：10μL[12]。色譜見圖2。（2）混合對照品溶液的制備。分別精密稱取待測成分對照品各適量，加75%甲醇溶液制成丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸質量濃度分別為0.504、0.076、0.201 mg/mL的單一對照品溶液。精密量取上述單一對照品溶液各適量，加75%甲醇溶液制成丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸質量濃度分別為100.848、10.660、8.042 μg/mL的混合對照品溶液。（3）供試品溶液的制備。取藥材樣品粉末（過3號篩）約0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率：140 W，頻率：42 kHz，下同）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。（4）方法學考察。按相關標準進行方法學試驗，結果，精密度、穩定性、重復性試驗中丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸峰面積的RSD均＜2.0%，表明儀器精密度、溶液穩定性、方法重復性均較好。（5）藥材樣品含量測定。取143批藥材樣品各適量，分別按“（3）”項下方法制備供試品溶液，再按“（1）”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算藥材樣品含量。結果，丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸含量分別為1.03～78.24、0.33～5.21、0.24～4.22 mg/g。

圖2 丹酚酸B、迷迭香酸和紫草酸的高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of salvianolic acid B，rosmarinic acid and lithospermic acid

2.2.2 丹參酮類成分的含量測定（1）色譜條件。色譜柱：Diamonsil C1（8200 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.02%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，61%A；6～20 min，61%→90%A；20～20.5 min，90%→61%A；20.5～25 min，61%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：20℃；進樣量：10μL。色譜見圖3。（2）對照品溶液的制備。取丹參酮ⅡA對照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成丹參酮ⅡA質量濃度為20μg/mL的對照品溶液。（3）供試品溶液的制備。按“2.2.1（3）”項下方法制備供試品溶液。（4）方法學考察。按相關標準進行方法學試驗，結果顯示，精密度、穩定性、重復性試驗中丹參酮ⅡA峰面積的RSD均＜1.3%，表明儀器精密度、溶液穩定性、方法重復性均較好。（5）藥材樣品含量測定。取143批藥材樣品各適量，分別按“2.2.1（3）”項下方法制備供試品溶液，再按“（1）”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算藥材樣品含量。結果，丹參酮類成分含量分別為0.887～10.913 mg/g。

A.對照品；B.供試品；1.丹參酮ⅡAA.substance control；B.test sample；1.tanshinoneⅡA

2.3 NIR定量校正模型的建立與驗證

2.3.1 校正集和驗證集樣品的選擇根據“2.2”項下丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸和丹參酮類成分含量分布情況，從143批藥材樣品中選取一定數量組成校正集，用于建立NIR模型；其余藥材樣品組成驗證集，用于驗證模型，詳見表1。

表1 校正集與驗證集樣品指標成分含量分布范圍Tab 1 Content distribution of index component of sample in calibration and validation set

2.3.2 光譜預處理方法的選擇NIR的采集容易受顏色、藥材樣品顆粒大小等影響，以致基線漂移和平移，因此必須對原始光譜進行預處理。常用的預處理方法有多元散射校正法（Multiple scatter correction，MSC）、標準歸一化法（Standard normal variate，SNV）、一階導數法（First derivative，FD）、二階導數法（Second derivative，SD）[13]，通過采用不同預處理方法可得不同的校正集內部交叉驗證相關系數（R2）和內部交叉驗證校正均方差（RMSECV），詳見表2。

運用TQ Analyst 8.0軟件對表2數據進行處理，結合PLS法建立近紅外定量分析模型。選擇R2、RMSECV為評價指標，綜合評價不同模型的準確性與適用性。其中，R2越接近1，NIR預測值與參考值相關性越好；RMSECV越小，所建定量分析模型適用性越強，預測效果越好。結果表明，以1st D法預處理效果最好，可以消除多重光譜偏差；對導數光譜進行微調處理，經最佳光譜預處理方法處理后得近紅外光譜，詳見圖4。

表2 不同光譜預處理方法對定量模型性能的影響Tab 2 Effects of different pretreatment methods on quantitative model performance

圖4 預處理后的近紅外光譜Fig 4 NIR spectra after pretreatment

2.3.3 建模波段的選擇建模波段要求在包含藥材樣品的大量信息的同時避免冗余信息，降低噪聲干擾[14]。采用FD法對不同的波段范圍進行手動優化比較，通過TQ Analyst 8.0軟件分析得丹酚酸B最佳波段為6 773.98～3 981.12 cm－1，迷迭香酸最佳波段為6 670.85～3 996.54 cm－1，紫草酸最佳波段為8 544.66～3 936.28 cm－1，丹參酮類成分最佳波段為8 188.06～3 875.31 cm－1，詳見表3。

表3 不同波段對R2和RMSECV的影響Tab 3 Effects of different spectral ranges on R2and RMSECV

2.3.4 主成分數的選擇在建模過程中，采用不同的主成分數，模型的預測能力不同：主成分數太少，建模信息不全，預測能力太低；反之，主成分數太多，驗證過程會出現過擬合現象[5]。采用留一交叉驗證法考察主成分數對RMSECV的影響，并作曲線，詳見圖5。結果表明，定量校正模型主成分數分別為13、10、11、17時，丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮類成分模型的RMSECV最小。

2.3.5 定量模型的建立運用TQ Analyst 8.0軟件，對143批藥材樣品進行建模，對光譜采用FD預處理方法，在“2.3.3”項下波段內對4個主成分數進行建模。結果表明，預測值與參考值的相關性較高，且結果很接近，該模型的性能較好，可以用于丹參藥材中多指標成分的定量分析。定量模型校正集樣品內部交叉驗證見圖6。

2.3.6 定量模型的驗證選擇樣品進行外部驗證，將其近紅外圖譜輸入定量模型，預測各指標成分含量，再與含量測定參考值進行比較，結果見表4（表中“RMSEP”為外部驗證均方差）；定量模型驗證集樣品外部驗證見圖7。

圖5 主成分數對RMSECV的影響Fig 5 Effects of principal component fraction on RMSECV

圖6 定量模型校正集樣品內部交叉驗證Fig 6 Internal cross validation chart of quantitative model calibration set sample

3 討論

本試驗建立了快速測定丹參藥材中丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮類成分等指標成分含量的NIR分析方法，選用各指標成分的特征光譜區間，并根據不同分析對象優選出合適的預處理方法，對NIR原始光譜進行預處理，進而采用PLS法建立了各指標成分含量的NIR定量模型。

在建模過程中，筆者最初采用單一指標成分丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的含量建模，但由于單一指標成分含量低于NIR的定量限，所建定量模型預測效果不佳。因此，最終選擇了它們的總含量（丹參酮ⅡA+丹參酮Ⅰ+隱丹參酮）建模，進行含量預測，這也與2015年版《中國藥典》（一部）丹參項下丹參酮類成分含量的測定中規定以高效液相色譜法測定丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮總量進行藥材質量評價[12]是一致的。

表4 定量模型驗證結果Tab 4 Validation results of quantitative model

圖7 定量模型驗證集樣品外部驗證Fig 7 External validation chart of quantitative model validation set sample

NIR技術是間接分析技術，模型的預測準確度直接受樣品實測值準確度與采集光譜時外界條件的影響[13]。因此，采用高效液相色譜法對樣品各指標成分含量進行測定時，每批樣品需平行測定4份，測定結果相對標準偏差應＜2%，以所測4次含量的平均值作為藥材樣品各指標成分含量的參考值；采集光譜時，每份藥材樣品應平行掃描6次，取平均光譜，以確保所建定量模型的準確度。

本試驗所采用的NIR分析方法速度快，預測結果準確度高，建立的定量模型可作為中藥材指標成分含量分析的一般規律。雖然，NIR法的準確度不及高效液相色譜法，但因其快速、無損、環保等特點，能滿足工業生產中大批量采集藥材樣品化學信息的需求，適用于快速測定中藥材高含量指標成分，可與法定標準一起構建準確、便捷、普適性強的中藥材整體質量快速評價方法體系，對保障最終制劑產品質量的穩定可控具有重要意義。

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Rapid Determination of Multi-maker Ingredients in Salvia miltiorrhiza by Near Infrared Diffused Reflection Spectroscopy

LI Zhen1，ZHOU Lihong2，YANG Gongjun1，YE Zhengliang3（1.Dept.of Pharmaceutical Analysis，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Tasly Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Tianjin 300410，China；3.Tasly Holding Group Co.，Ltd.，Tianjin 300410，China）

OBJECTIVE：To establish the method for rapid determination of nuezhenoside in Salvia miltiorrhiza.METHODS：The contents of salvianolic acid B，rosmarinic acid，lithospermic acid and tanshinone（tanshinoneⅡA+tanshinoneⅠ+cryptotanshinone）were determined by HPLC（as reference value）.Quantitative model for the contents of above components was established by partial least square（PLS）-NIR spectra.According to the reference value，143 samples were collected and the spectrum was pretreated by first-order derivative.The optimal range of wave band for salvianolic acid B，rosmarinic acid，oxalic acid and tanshinone were 6 773.98-3 981.12，6 670.85-3 996.54，8 544.66-3 936.28，8 188.06-3 875.31 cm－1.RESULTS：The methodology for the con-tent determination of salvianolic acid B，rosmarinic acid，oxalic acid and tanshinone were in line with the requirement.The coefficient（R2）of internal cross validation for quantitative correction model of salvianolic acid B，rosmarinic acid，oxalic acid and tanshinone were 0.919 0，0.832 2，0.821 5，0.925 6.The deviation of corrected mean square roots were 4.46，0.48，1.34，0.71，respectively.The R2values of external validation were 0.852 6，0.957 3，0.819 3，0.953 1，respectively；and mean square root of prediction error（RMSEP）were 9.77，0.28，0.94，0.63，respectively.CONCLUSIONS：The method is rapid，accurate，simple and pollution-free，and can be used for rapid determination of multi-maker ingredients in S.miltiorrhiza.

Near infrared diffuse reflectance spectroscopy；Salviae miltiorrhizae；Phenolic acids；Tanshinone；Rapid determination；Content

R284

A

1001-0408（2017）30-4247-05

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.19

國家自然科學基金資助項目（No.21275162）

＊碩士研究生。研究方向：藥物現代儀器分析。E-mail：lz_fly_away@163.com

#通信作者：研究員。研究方向：藥物現代儀器分析。電話：022-86342066。E-mail：yezl@tasly.com

2016-11-22

2017-01-22）

（編輯：張靜）