南極長城灣海綿共附生可培養細菌多樣性研究

劉 歡，俞 勇，廖 麗，劉 雙，3，陳 波

南極長城灣海綿共附生可培養細菌多樣性研究

劉 歡1，2，俞 勇2，廖 麗2，劉 雙2，3，陳 波1，2

（1.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306；2.中國極地研究中心，國家海洋局極地科學重點實驗室，上海 200136；3.華東理工大學生物工程學院，上海 200237）

研究了南極長城灣潮間帶海綿共附生可培養細菌多樣性及其疑似新種應用有利于放線菌生長的選擇性培養基ISP2從長城灣海綿動物組織中分離出120株細菌，基于這些菌株的16SrRNA基因序列開展系統發育分析。結果顯示，所分離菌株隸屬于三個細菌門五大類群的11個目、22個屬，表明長城灣海綿共附生細菌的種屬分布較廣、多樣性非常高。其中紅球菌Rhodococcus屬占優勢，另外包含α-變形菌綱Puniceibacterium屬、放線菌門Aeromicrobium屬、β-變形菌綱Limnobacter屬等罕見種屬。16SrRNA基因序列同源性比對分析表明，菌株HM145與Rhodococcus屬模式種Rhodococcus qingshengii具有最高序列相似性97.0%，菌株HQ09與Puniceibacterium antarcticum有96.9%的最高相似性，為2株疑似新種，其分類地位和種水平上的分類學研究有待開展多相分類進行鑒定。

南極長城灣；潮間帶；海綿共附生可培養細菌；多樣性

海綿動物是一類多孔濾食性的底棲生物，可以過濾大量海水［1－2］，一部分居住在海綿組織內的微生物可能是暫時性的周圍海水的組成部分［3］。海綿共附生微生物主要包括：a）附著在海綿表面或內腔表面的附生微生物；b）進入了海綿細胞間中質層而躲過了海綿細胞吞噬作用的海綿細胞外微生物；c）被海綿細胞吞噬的可為海綿細胞提供營養的海綿細胞內微生物［4］。海綿的共附生微生物可以達到海綿生物量的40%，這些微生物參與到海綿的宿主防御、營養和代謝過程中［5］。溫帶和熱帶海域海綿共附生微生物群落已被廣泛研究，基于可培養和非培養技術研究顯示，海綿中的共附生微生物既有原核的古菌和細菌，也有大量的真菌，約有40個門的微生物物種存在于海綿體內，其中以變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteriodetes）和藍藻門（Cyanophyta）為主［6］。已有少量的文獻報道海綿動物是南極半島沿岸底棲生物群落常見的類群，其中尋常海綿綱（Demospongiae）占比最大，其次是六放海綿綱（Hexactinellida），其地理分布主要受地質類型、水溫和深度的影響［7］。2004年LARS等［8］使用特異的 PCR引物構建了海綿Aplysina aerophoba共附生細菌的16S rRNA基因文庫，通過系統發育分析發現了與已知門細菌16S rRNA基因同源性＜75%的海綿菌門（Poribacteria），提示海綿動物存在豐富的共附生細菌新類群。

我國南極長城站及其毗鄰的長城灣位于西南極喬治王島的菲爾德斯半島（Fildes Peninsula）南部，氣候相對溫暖。長城灣是菲爾德斯半島的內灣，最大水深35 m，沿岸具有巖礁、沙質和泥沙等3種主要海岸類型，潮間帶至潮下帶動植物種類豐富。已有的調查表明，西南極的喬治王島和南極半島海域海水和沉積環境具有較多微生物，多樣性比較豐富。迄今南極低溫海洋環境的海綿動物共附生微生物的類群和多樣性研究仍然少見。本文利用長城灣潮間帶采集到的海綿，通過選擇性培養基獲得以放線菌為主的海綿共附生細菌，研究了這些菌株的多樣性，以期為海綿共附生微生物的分類、代謝及其基礎應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2013年中國第29次南極科學考察期間于長城灣潮間帶的沙質表層沉積物中（62°12′41＂S、58°57′08＂W）采集到 3個未鑒定的海綿動物樣品。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株分離

將海綿動物組織樣品剪碎，取1 g置于裝有10 mL無菌海水中勻漿器中進行組織破碎，靜置5 min后，取上清涂布添加終濃度為30μg·mL－1萘啶酮酸的ISP2分離培養基（ISP2：葡萄糖4 g，麥芽粉10 g，酵母粉4 g，瓊脂15 g，海水定容至1 L，調 pH至7.2～7.3）。20℃培養4周以上，根據菌落形態挑取單菌落轉接到ISP2培養基上進行純化培養。

1.2.2 16SrRNA基因 PCR與測序

使用博大泰克（北京）的細菌基因組小量快速提取試劑盒提取細菌gDNA，按照其操作說明進 行。 采 用 通 用 引 物 27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′及 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，進 行 細 菌 16S rRNA基因的擴增［9］。PCR程序為98℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，共30個循環；72℃延伸10 min；4℃低溫保存。使用pMD18-T質粒，按照說明書步驟進行TA克隆。挑取3～6個陽性單克隆進行液體培養，之 后 采 用 通 用 引 物 M13F（-47）：-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC和 M13R（-48）：-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-進行菌液PCR。PCR程序為95℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸2 min，共25個循環；68℃延伸10 min；4℃低溫保存。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，在1.5 Kb左右檢測到清晰的目的條帶后，送PCR產物至上海桑尼生物科技有限公司或上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

1.2.3 序列分析與系統發育樹構建

測序結果提交至生物信息學數據庫GenBank（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）及 EzTaxon-e［10］（http：／／www.ezbiocloud.net）進行序列的相似性比較分析。選擇 MEGA 6.0［11］軟件里漸進的多序列比對方法Cluster W進行海綿共附生細菌16SrRNA基因序列比對，樹的拓撲形狀采用鄰接法［12］（Neighbor-Joining），分枝上的數字為 1 000次bootstrap［13］分析所得的值，自展值設定在50以上構建系統發育樹?；跀祿霦zTaxon-e的16S rRNA基因比對結果，尋找最高相似性在97%左右的菌株，選取比對結果中與其相似性較高的模式株并加入一個外群，采用MEGA 6.0軟件的鄰接法構建系統發育樹，其它方法同上。

2 結果與分析

2.1 海綿共附生可培養細菌的種類

經過20℃培養4周以上，平板上出現形態多樣的菌落，進一步在ISP2培養基上進行劃線和純化，共獲得120株海綿共附生細菌。提取菌株的基因組DNA后，用16SrRNA基因通用引物進行PCR擴增，測序后獲得的16S rRNA基因序列。通過與GenBank數據庫中序列的比對分析，發現所得16SrRNA基因序列與數據庫中很多已有序列的相似性較高（98%～100%），但這些序列多數來自未培養或者未鑒定的細菌，且有部分序列來自本實驗室之前在中山站附近分離并提交的菌株，另有部分序列來自北極海洋環境的菌株。進一步將所得序列與EzTaxon-e數據庫中序列進行比對，發現所分離菌株的16S rRNA基因序列與已描述模式菌株的16S rRNA基因序列的相似度為96.9%～100%，其中有2株菌株與已知細菌種的16SrRNA基因序列相似性低于97%，有5株菌株與已知細菌種的16S rRNA基因序列相似性低于98%。另有8株菌株與已知細菌種的16S rRNA基因序列相似性為100%。

基于16S rRNA基因序列的比對分析，所獲得的120個菌株可歸屬為擬桿菌門（Bacteroidetes），變形菌門（Proteobacteria）的 α-變形 菌 綱 （α-Proteobacteria）、β-變 形 菌 綱 （β-Proteobacteria）和 γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria），放線菌門（Actinobacteria）等三個門五大類群的11個目、22個屬。屬水平的菌株分布見圖1，其中放線菌門各屬占絕對優勢，表明ISP2培養基作為選擇性培養基有利于海綿動物共附生放線菌的分離，組份中萘啶酮酸的使用抑制了大多數革蘭氏陰性細菌的生長，能夠以此培養基分離獲得的革蘭氏陰性細菌在一定程度上能耐受萘啶酮酸的抑制作用。分離菌株數最多的屬為Rhodococcus屬，共獲得57個菌株，占總分離菌數的47%。其它屬所獲得的菌株數量明顯少于Rhodococcus屬，占比分別在1%～8%，表現出了較高的多樣性，并獲得了一些比較罕見的屬，例如α-變形菌綱 Puniceibacterium屬、放線菌門Aeromicrobium屬、β-變形菌綱 Limnobacter屬等，這些屬的細菌在GenBank數據庫中已有的序列和信息并不多，目前針對其開展的分離培養也較少見。

圖1 長城灣海綿共附生可培養細菌的屬水平上的分布Fig.1 Distribution of sponge-associated culturable bacteria from the Great Wall Bay on genus level

2.2 海綿共附生可培養細菌的系統發育分析

進一步對獲得菌株進行基于16SrRNA基因序列的系統發育分析，構建了進化樹（圖2）。放線菌門的菌株在系統發育樹上體現了較高的多樣性，有些屬則表現了明顯的優勢性，Corynebacterium屬的4個菌株和Mycetocola屬的5個菌株其16S rRNA基因序列高度相似。其它屬的菌株則表現了一定的差異，代表了多個不同種（圖2-A）。Rhodococcus屬占據了最大的比例，呈現了絕對的優勢性（圖2-B），由圖2-B可見，該屬可以歸為4個主要的分支，且其中一個分支占據了主要優勢。從16SrRNA基因序列的相似性比對結果分析，該屬57個菌株中最相似的標準菌株只有5個，即很多菌株跟同一個標準菌株具有很高的相似性，可能為同一個種內的不同菌株。嚴立恩等［14］比較了南極潮間帶和陸地土壤放線菌的分布和多樣性，認為潮間帶相較于陸地土壤，放線菌占比更大，但是多樣性較低，本研究優勢屬Rhodococcus數量多但多樣性不高的結果與其一致，而不同之處在于本研究選擇性培養基的使用可從海綿組織樣品中分離獲得包括Rhodococcus屬在內的12個屬的放線菌菌株。

2.3 疑似新種的發現

16SrRNA基因序列相似性分析表明所分離的菌株HM145和HQ09與已知細菌種的序列相似性均低于97%。按照目前普遍接受的16S rRNA基因序列相似性97%為細菌新種劃分的界限標準［15－16］，這兩株極地海綿共附生細菌可能代表新的細菌種，筆者進一步對這兩株細菌菌株進行了基于16S rRNA基因序列的系統發育分析。

與菌株HM145的16S rRNA基因序列相似性在95%以上的已描述細菌種只分布在Nocardiaceae科的 Rhodococcus屬和 Nocardia屬。菌株 HM145與 Rhodococcus屬的模式種Rhodococcus qingshengii［17］的 16S rRNA基因序列相似性最高，為 97.0%，其次為 Nocardia arthritidis［18］，兩者間有 96.6%的相似性。選擇Escherichia coli作為外群，Nocardiaceae科中與菌株HM145的16SrRNA基因序列相似性＞95%模式菌株作參比菌株，構建系統發育樹。從系統發育樹（圖3）看，Rhodococcus屬和Nocardia屬的菌株形成兩個分支，為兩個進化簇，HM145位于Rhodococcus屬進化簇的根部，難以歸類為Rhodococcus屬或Nocardia屬，其準確的分類地位有待進一步通過多相分類研究確定。

圖2 長城站潮間帶120株海綿共附生細菌的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 120 sponge-associated bacterial strains isolated from sponge samples in the intertidal sand sediment，Great Wall Bay（bootstrap values，based on 1 000 replications，over 50%are shown at nodes）

圖3 基于菌株HM145及其相應模式株16S r RNA基因序列，使用鄰接法構建的系統發育樹Fig.3 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S r RNA gene sequences for the positions of strain HM145 and other related species（bootstrap values，based on 1000 replications，over 50%are shown at nodes.Bar，0.02 substitutions per nucleotide position.GenBank accession numbers are indicated in parentheses after the sequence name）

與菌株HM09比對相似性在96%以上的模式種有 Rhodobacteraceae科的 Puniceibacterium屬、Pseudooceanicola屬、Phaeobacter屬和 Marivita屬的模式菌。菌株 HQ09與 Puniceibacterium antarcticum［19］有 96.9%的最高相似性，其次是Pseudooceanicola antarcticus［20］的 96.8%，與新屬Puniceibacterium的另一個模式種Puniceibacterium sediminis［21］有 96.8% 的 相 似 性。 選 擇Rhodobacteraceae科的10個屬和作為外群的一個Escherichia coli共17個16S rRNA基因序列構建系統發育樹（圖4）。由進化樹可以看出，菌株HQ09與Puniceibacterium屬所在支更接近，自展值為57。目前為止Puniceibacterium屬只有2株已經鑒定的新種，HQ09的發現可能成為該屬的第3個新種。

3 討論與小結

本文應用選擇性培養基ISP2，從南極長城站毗鄰的長城灣潮間帶沙質沉積物的海綿動物組織中分離獲海綿共附生細菌120株，開展了基于16SrRNA基因序列的系統發育分析，結果表明，所獲得的分離菌株可歸屬為擬桿菌門（Bacteroidetes），變形菌門（Proteobacteria）的 α-變形 菌 綱 （α-Proteobacteria）、β-變 形 菌 綱 （β-Proteobacteria）和 γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria），放線菌門（Actinobacteria）等三個門五大類群的11個目、22個屬，其中含放線菌12個屬，顯示了該海綿共附生細菌非常高的多樣性，以Rhodococcus屬菌株最多，呈現了明顯的優勢性。其中α-變形菌綱下的Puniceibacterium屬、放線菌門下的 Aeromicrobium屬、β-變形菌綱下的Limnobacter屬菌株在GenBank數據庫中已有的序列和信息并不多，目前針對其開展的分離培養也較少見，為罕見種屬，表明了選擇性培養基ISP2的應用有利于這些罕見屬菌株的分離獲得。

圖4 基于菌株HQ09及其相應模式株16S r RNA基因序列，使用鄰接法構建的系統發育樹Fig.4 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16Sr RNA gene sequences for the positions of strain HQ09 and other related species（bootstrap values，based on 1000 replications，over 50%are shown at nodes.Bar，0.02 substitutions per nucleotide position.GenBank accession numbers are indicated in parentheses after the sequence name）

16SrRNA基因序列同源性比對分析發現，菌株HM145與Rhodococcus屬模式種Rhodococcus qingshengii具有相似性最高為97.0%，與Nocardia arthritidis有96.6%的相似性。菌株HM145具體的分類地位和種水平上的分類學研究有待進一步開展多相分類進行鑒定。菌株 HQ09與Puniceibacterium antarcticum有96.9%的最高相似性，與 Pseudooceanicola antarcticus有96.8%的相似性，與 Puniceibacterium屬的另一個模式種Puniceibacterium sediminis有96.8%的相似性。系統發育分析顯示，菌株HQ09與Puniceibacterium屬所在支更接近，目前Puniceibacterium屬只有2株已經鑒定的新種，HQ09的發現可能成為該屬的第3個新種。

海綿為一類多孔濾食性的底棲無脊椎動物，與多種微生物存在共生或附生關系，是微生物新分類類群的一個重要來源，也是今后深入研究獲得多種天然產物的重要研究對象。海綿動物中分離的多數天然化合物均為其共附生的微生物所產生，例如張海濤［22］首次從海綿中大量分離獲得放線菌株，其中約61%的菌株具有多種抗菌活性，且在抗腫瘤篩選中，20%的放線菌具有超過50%的抑制腫瘤細胞生長能力，顯示了海綿共附生微生物為藥源天然產物的重要潛在資源。本研究可為南極海洋環境海綿共附生微生物新分類群和藥源微生物菌株資源的發現提供一個新的途徑。

致謝：感謝中國第29次南極科學考察隊和中國南極長城站為本研究提供南極現場考察的后勤裝備和條件支持。本實驗室孫茜和季青在菌株保藏和測序前的實驗工作中給予了許多幫助和支持，在此一并由衷致謝。

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Diversity of sponge-associated culturable bacteria，Great Wall Bay，Antarctica

LIU Huan1，2，YU Yong2，LIAO Li2，LIU Shuang2，3，CHEN Bo1，2
（1.College of Marine Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.SOA Key Laboratory for Polar Science，Polar Research Institute of China，Shanghai 200136，China；3.College of Bioengineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

This paper studied the diversity of intertidal sponge-associated culturable bacteria and suspected novel species in the Great Wall Bay，Antarctica.120 bacterial strains were isolated from three unidentified sponge samples in the intertidal sediment by using the selective medium ISP2 which was beneficial to the growth of actinomycetes.Phylogenetic analysis based on 16SrRNA gene sequences showed these strains could be classified into 11 orders，22 genera in 3 phyla and 5 taxa，indicating that these culturable spongeassociated bacteria had a wide genus distribution with high diversity.In addition，the Rhodococcus strains were dominant and contained the rare strains from genus Puniceibacterium，Limnobacter and Aeromicrobium.Analysis on the homology alignment of 16SrRNA gene sequences revealed that strain HM145 had the highest similarity of 97.0%with the type strain Rhodococcus qingshengii from genus Rhodococcus，and strain HQ09 had the highest similarity of 96.9%with the type strain Puniceibacterium antarcticum.These data indicated that strain HM145 and HQ09 would be the suspected novel species.However，their classification status and polyphasic taxonomy at the level of species need to be further studied.

Great Wall Bay；Antarctica；intertidal；sponge-associated culturable bacteria；diversity

S 932.8

A

1004－2490（2017）05－0554－08

2016－05－18

南北極環境綜合考察與評估專項／南極周邊海域海洋生物多樣性和生態考察專題（CHINARE 2016－01－05）；南極周邊海域與大陸資源潛力綜合評估專題（CHINARE 2016－04－02）

劉 歡（1989－），女，安徽阜陽人，碩士研究生，主要從事極地微生物多樣性及其新種多相分類研究。

E-mail：buzhilh＠hotmail.com

陳 波，研究員。Tel：021－58711026，E-mail：chenbo＠pric.org.cn