實時熒光定量PCR技術(shù)在侵襲性真菌感染診斷中的應(yīng)用價值

馬曉薇 李 明 李慶倫 張慧婷 羅彩琴

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心腦血管病院ICU，寧夏 銀川 750012)

1 寧夏醫(yī)科大學(xué)

實時熒光定量PCR技術(shù)在侵襲性真菌感染診斷中的應(yīng)用價值

馬曉薇 李 明1李慶倫1張慧婷 羅彩琴

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心腦血管病院ICU，寧夏 銀川 750012)

目的探討實時熒光定量PCR(RTFQ-PCR)技術(shù)在侵襲性真菌感染(IFI)診斷中的應(yīng)用價值。方法采集IFI高?；颊?02份血清,收集其相關(guān)臨床資料。以“重癥患者IFI的診斷和治療指南(2007年)” 作為金標(biāo)準(zhǔn)，計算RTFQ-PCR和G試驗的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。 以血培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，計算 RTFQ-PCR的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。結(jié)果根據(jù)“2007年指南”的診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診病例2例，臨床診斷病例20 例，擬診病例31例，非IFI病例49例。以確診和臨床診斷病例作為感染組，非IFI病例作為非感染組。兩組年齡、慢性腎功能不全、糖尿病、預(yù)后差患者的比例比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。IFI感染部位主要為呼吸道感染10例(50.0%)、泌尿感染8例(40.0%)、血液感染2例(10.0%)。在24例IFI患者中共分離出17株真菌，分別為9株白色念珠菌(52.9%)，1株熱帶念珠菌(5.9%)，3株光滑念珠菌(17.6%)，2株念珠菌屬(11.8%)，2株煙曲霉(11.8%)。以“2007年指南”作為金標(biāo)準(zhǔn)，RTFQ-PCR靈敏度為50.0%，特異度為95.9%，陽性預(yù)測值為81.8%，陰性預(yù)測值為83.9%；G試驗的敏感度為61.1%，特異度為91.8%，陽性預(yù)測值為73.3%，陰性預(yù)測值為 86.5%。以血培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，RTFQ-PCR的敏感度為100.0%，特異度為88.2%，陽性預(yù)測值為15.4%，陰性預(yù)測值為100.0%。結(jié)論RTFQ-PCR檢測技術(shù)可以作為重癥患者IFI早期診斷的一種有效手段，在臨床上對IFI的早期診斷具有一定的價值。

侵襲性真菌感染；實時熒光定量PCR技術(shù)；診斷

目前鏡檢是臨床上最常用的診斷侵襲性真菌感染(IFI)的方法，但其敏感度低，培養(yǎng)方法周期較長，檢出率不高。臨床上診斷IFI的金標(biāo)準(zhǔn)是組織病理學(xué)檢查，由于需有創(chuàng)取材，患者難以接受。影像學(xué)檢查缺少特異性，血清學(xué)檢查G試驗雖然彌補了傳統(tǒng)診斷手段的一些缺點，但假陽性、假陰性高〔1〕。實時熒光定量PCR技術(shù)(RTFQ-PCR )耗時短，污染少，敏感度和特異度高，能夠為IFI的早期診斷提供幫助〔2〕。但對于重癥患者IFI的診斷價值尚不清楚。在重癥監(jiān)護病房(ICU)，侵襲性白色念珠菌感染(ICI)在IFI中占50%左右，本研究擬評價RTFQ-PCR技術(shù)在重癥患者ICI早期診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院及心腦血管病醫(yī)院ICU科2015年5月至2016年3月102例IFI高?；颊?，納入標(biāo)準(zhǔn)：①入住ICU時間≥24 h；②年齡≥18周歲；③經(jīng)抗菌素抗感染治療72 h后仍有感染跡象。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入ICU前已使用抗真菌藥物治療；②臨床擬診斷其他真菌感染的患者?；颊呋蚣覍僦橥獠⒑炇鹬橥鈺?，本研究在醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)下實施。其中男70例，女32例，年齡22～89〔平均(63.83±15.32)〕歲。

1.2研究方法 收集研究對象的相關(guān)臨床資料，包括一般情況、危險因素、基礎(chǔ)疾病、實驗室檢查、組織病理、影像學(xué)及預(yù)后等臨床資料。血清標(biāo)本的收集：采集研究對象的血清，保存于-80℃冰箱，留作進一步PCR檢測。相關(guān)實驗室檢測：送檢血培養(yǎng)、G試驗，收集其結(jié)果。血培養(yǎng)和G試驗均由寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗科進行檢測。

1.3PCR檢測

1.3.1RTFQ-PCR檢測 引物和探針購自生工公司。上游引物：5'-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3'；下游引物：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；TapMan探針：5'-FAM-ATTGCTTGCGGCGGTAACGTCC-TAMRA-3'。先按照Biospin試劑盒說明書進行白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA的提取，后進行白色念珠菌陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備，包括普通PCR擴增，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，采用AxyPren DNA試劑盒進行膠回收，將回收的基因片段通過電泳進行鑒定。如確定為目的片段后，將回收的目的片段送昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司進行測序，進一步驗證。將上述提取的白色念珠菌目的基因片段作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)ND-1000分光光度儀測定其濃度，判斷其純度，根據(jù)拷貝數(shù)計算公式計算出標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。再行白色念珠菌RTFQ-PCR擴增，將回收的基因片段作為標(biāo)準(zhǔn)品，給予10倍梯度的倍比稀釋，通過計算得到拷貝數(shù)，進行擴增，獲得各自CT值，選取其中線性關(guān)系最好的5個梯度，由軟件繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。IFI高?；颊哐錎NA的提取采用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒，按實驗說明進行。最后進行血清標(biāo)本DNA的RTFQ-PCR檢測，每次實驗設(shè)立5組標(biāo)準(zhǔn)品，提取健康人血清的DNA作為陰性對照，將雙蒸水作為空白對照，每個樣本均3個復(fù)孔。

1.3.2普通PCR檢測 引物為1.3.1的引物，建立反應(yīng)體系，提取健康人血清的DNA作為陰性對照，將雙蒸水作為空白對照，采用全式金公司的Agarose，按照說明書操作進行普通PCR產(chǎn)物的鑒定。

1.4觀察指標(biāo) 分析IFI高危患者的臨床資料：年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、ICU住院時間、預(yù)后；以“2007年重癥患者IFI的診斷和治療指南” 為金標(biāo)準(zhǔn)，分析評價RTFQ-PCR、G試驗的診斷價值；以血培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，分析評價RTFQ-PCR的診斷價值。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS2.0統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用軟件進行χ2及t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1一般資料 根據(jù)“2007年指南”的診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診病例2例，臨床診斷病例20 例，擬診病例31例，非IFI病例49例。以確診和臨床診斷病例作為感染組，非IFI病例作為非感染組。兩組年齡、慢性腎功能不全、糖尿病、預(yù)后差(死亡或放棄)患者的比例均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

2.2ICU中IFI感染部位分布情況和真菌種屬分布 IFI感染部位主要為呼吸道感染10例(50.0%)、泌尿感染8例(40.0%)、血液感染2例(10.0%)。IFI患者中共分離出17株真菌，分別為9株(52.9%)白色念珠菌，1株(5.9%)熱帶念珠菌，3株(17.6%)光滑念珠菌，2株(11.8%)念珠菌屬，2株(11.8%)煙曲霉。

表1 兩組一般資料比較〔n(%)〕

2.3白色念珠菌RTFQ-PCR檢測結(jié)果分析 102份病例,2例煙曲霉感染，3例光滑念珠菌感染，2例熱帶念珠菌感染，根據(jù)排除標(biāo)準(zhǔn)，排除這7份標(biāo)本后，最終納入95份標(biāo)本。其中RTFQ-PCR陽性13例(13.7%)。2例確診病例2例陽性，16例臨床診斷病例7例陽性，28例擬診病例 2例陽性，49例非IFI病例 2例陽性。白色念珠菌RTFQ-PCR檢測結(jié)果為2例確診病例2陽性，16例臨床診斷病例7例陽性，49例非IFI病例 2例陽性。RTFQ-PCR陽性時，2007年指南檢測陽性9例，陰性2例；RTFQ-PCR陰性時，2007年指南檢測陽性9例，陰性47例。RTFQ-PCR靈敏度為50.0%，特異度為95.9%，陽性預(yù)測值為81.8%，陰性預(yù)測值為83.9%。

2.4普通PCR檢測結(jié)果 本實驗納入102份病例，其中，僅2例確診病例檢測結(jié)果為陽性，余病例均為陰性。

2.5G試驗結(jié)果 95份標(biāo)本中G試驗陽性為29例(30.5%)，其中2例確診病例1例陽性，16例臨床診斷病例10例陽性，28例擬診病例14例陽性，49例非IFI病例4例陽性。以“2007年指南”作為金標(biāo)準(zhǔn)，G實驗陽性，2007年指南陽性11例，陰性4例，G實驗陰性，2007年指南陽性7例，陰性45例。G試驗的敏感度為61.1%，特異度為91.8%，陽性預(yù)測值為73.3%，陰性預(yù)測值為 86.5%。

2.6以血培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌RTFQ-PCR檢測結(jié)果 血培養(yǎng)結(jié)果為2個確診病例為陽性，其他病例均為陰性。以血培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，RTFQ-PCR陽性，血培養(yǎng)陽性2例，陰性11例；RTFQ-PCR陰性，血培養(yǎng)陰性0例，陰性82例，白色念珠菌 RTFQ-PCR的敏感度為100.0%，特異度為88.2%，陽性預(yù)測值為15.4%，陰性預(yù)測值為100.0%。

3 討 論

在ICU中嚴(yán)重感染問題依然非常棘手，重癥感染患者的死亡率依然未得到有效控制，IFI就是其中重要組成部分。由于重癥患者病情危重且侵入性操作多導(dǎo)致IFI的發(fā)生率更高，目前在ICU病房中，IFI占院內(nèi)感染的8%～15%〔2〕，其中白色念珠菌比例依然較高。IFI的危險因素包括接受免疫抑制劑治療、大劑量激素治療、長期應(yīng)用廣譜抗菌素，各種侵入性操作、接受器官移植患者及患者年齡>65歲、慢性腎功能不全、糖尿病、存在念珠菌定植等。獨立危險因素有APACHEⅡ評分>22分、年齡>65歲、患有慢性腎功能不全、廣譜抗菌素長期使用、多次入住重癥監(jiān)護室等〔3〕。本研究提示IFI患者的基礎(chǔ)疾病較非IFI患者的基礎(chǔ)疾病更多，且患有IFI的患者病死率高，而且預(yù)后差。ICI在IFI中占多數(shù)，而白色念珠菌感染占40%～60%〔4〕。本研究與上述研究的結(jié)果一致。

目前臨床上常用的診斷手段不能快速、準(zhǔn)確的做出診斷，影響早期診斷和治療，是造成IFI病死率高，治療費用昂貴的因素之一。TaqMan探針RTFQ-PCR技術(shù)具有耗時短、污染少、敏感度、特異度高和重復(fù)性好的特點。本次研究所采用的TaqMan探針為白色念珠菌專屬性探針，檢測標(biāo)本為IFI高?；颊哐?。將研究對象分為確診IFI、臨床診斷IFI、擬診IFI及非IFI。本研究結(jié)果提示RTFQ-PCR在ICI的早期診斷中有一定的應(yīng)用價值。在本次研究中白色念珠菌RTFQ-PCR靈敏度為50.0%，分析其原因：本實驗采用臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)作為金標(biāo)準(zhǔn)，納入的感染組病例可能并非全是白色念珠菌感染，因此影響了RTFQ-PCR的敏感性。另外RTFQ-PCR在IFI的診斷中有一定價值。普通PCR的引物為真菌廣譜性引物，能夠檢測絕大多數(shù)真菌病原體。有文獻報道，RTFQ-PCR的敏感度為普通PCR的數(shù)倍〔5〕。在臨床上，真菌血培養(yǎng)陽性，可確診為IFI，因此以血培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，來評價白色念珠菌RTFQ-PCR的診斷價值〔6〕。本實驗結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果相似〔7〕。相對于3～5 d才能出結(jié)果的傳統(tǒng)血培養(yǎng)，RTFQ-PCR不僅檢測速度快，敏感度高，能夠鑒定種屬，而且還可以對真菌DNA進行量化檢測〔8〕?？稍谝欢ǔ潭壬咸岣逫CI的早期診斷率，為早期治療ICI提供更加充分的依據(jù)。

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2015年第二批寧夏回族自治區(qū)科技支撐計劃項目(No.XT201418)；寧夏醫(yī)科大學(xué)2014年度校級科研項目(No.寧醫(yī)校發(fā)〔2014〕253號)

馬曉薇(1970-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事重癥感染與急性呼吸衰竭研究。

R445

A

1005-9202(2017)20-5119-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.074

〔2017-03-21修回〕

(編輯 袁左鳴)