人腦膠質瘤中ADAM17、EGFR和CD4+CD25+Treg的表達及免疫調節機制

呼鐵民 齊寶柱 田 甜 楊國軍 王昆鵬 周敬君 季東鑫 王維興

(承德醫學院附屬醫院，河北 承德 067000)

1 秦皇島市青龍滿族自治縣醫院 2 承德市第六醫院

人腦膠質瘤中ADAM17、EGFR和CD4+CD25+Treg的表達及免疫調節機制

呼鐵民 齊寶柱 田 甜 楊國軍 王昆鵬 周敬君1季東鑫2王維興

(承德醫學院附屬醫院，河北 承德 067000)

目的探討人腦膠質瘤中解聚素-金屬蛋白酶(ADAM)17、表皮生長因子受體(EGFR)和CD4+CD25+Treg的表達及免疫調節機制。方法選取人腦膠質瘤標本52例，其中Ⅰ～Ⅱ級(低度惡性膠質瘤)19例，Ⅲ～Ⅳ級(高度惡性膠質瘤)33例；另取10例因顱腦損傷行手術治療切取的正常腦組織標本為對照組。免疫組化染色觀察標本組織中ADAM17、EGFR蛋白陽性表達情況；Western印跡和RT-PCR檢測其中ADAM17、EGFR蛋白和mRNA表達量；流式細胞術檢測CD4+CD25+Treg細胞比率。結果膠質瘤組織中ADAM17蛋白陽性表達率明顯高于正常腦組織(P<0.01)；高度惡性組織明顯高于低度惡性組織(P<0.05)。腦膠質瘤組織ADAM17、EGFR蛋白和mRNA表達量明顯高于正常腦組織；高度惡性腦組織表達量明顯高于低度惡性腦組織(P<0.01)。腦膠質瘤組織CD4+CD25+Treg細胞比率明顯高于正常腦組織，且隨惡性程度增加而升高(P<0.01)。腦膠質瘤組織中ADAM17、EGFR蛋白和mRNA表達水平均與CD4+CD25+Treg細胞比率呈正相關(P<0.05)。結論ADAM17、EGFR和CD4+CD25+Treg在人腦膠質瘤中高表達且與病理分級相關；ADAM17、EGFR可能通過誘發CD4+CD25+Treg的負性免疫調節而減弱免疫監視，促進膠質瘤的發生、發展。

人腦膠質瘤；表皮生長因子受體解聚素-金屬蛋白酶(ADAM17)；表皮生長因子受體(EGFR)；免疫調節

解聚素-金屬蛋白酶(ADAM)17屬于細胞膜表面糖蛋白，具有蛋白剪切作用，可發揮多種生物活性〔1〕。表皮生長因子受體(EGFR)屬于多功能跨膜糖蛋白，已被證實在神經系統中發揮神經誘向作用〔2〕。因ADAM17、EGFR在胃癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中均發揮作用，逐漸受到該領域學者的重視。相關研究顯示，ADAM17、EGFR蛋白可作為經典CD4+CD25+Treg的特異性表面標志，而CD4+CD25+Treg屬于調節性T細胞，在腫瘤免疫耐受中具有重要作用〔3〕。目前關于ADAM17、EGFR和CD4+CD25+Treg在人腦膠質瘤方面的研究鮮有報道，本研究旨在檢測上述三者在人腦膠質瘤和正常腦組織中的表達及其在腦膠質瘤發生中的免疫調節機制。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2016年10月在承德醫學院附屬醫院神經外科手術切除并經病理證實的人腦膠質瘤標本52例，其中男29例，女23例，年齡57～75歲，平均(66.35±4.18)歲。按世界衛生組織2007年頒發的中樞神經系統腫瘤分級標準：Ⅰ～Ⅱ級(低度惡性膠質瘤)19例，Ⅲ～Ⅳ級(高度惡性膠質瘤)33例。另取同年齡段10例因顱腦損傷行手術治療切取的正常腦組織標本為對照組。

1.2材料與設備 兔抗人ADAM17多克隆抗體、鼠抗人EGFR單克隆抗體購于上海康朗生物科技有限公司；Per CP標記的CD4抗體、FTTC標記的CD25抗體購于北京泰澤瑞達科技有限公司；RT-PCR試劑盒購于上海酶聯生物科技有限公司，引物由上海合星生物科技有限公司合成；全自動組織處理器由德國美天旎生物技術公司生產；流式細胞儀由德國Partec生產。

1.3方法

1.3.1免疫組化檢測 將標本組織切片常規脫蠟、水化，放入3% 雙氧水中孵育15 min，放入枸櫞酸緩沖液中加熱10 min修復抗原，10%山羊血清封閉30 min；滴加10%封閉液稀釋的ADAM17、EGFR多克隆抗體100 μl(1∶200稀釋)，陰性對照用磷酸緩沖液代替一抗，4℃孵育過夜；滴加HRP標記的二抗，室溫下放置40 min，加入鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶，孵育40 min，DAB顯色，蘇木精復染。光學顯微鏡下觀察棕黃色顆粒為ADAM17和EGFR蛋白陽性表達，根據陽性細胞比例和染色強度分級：無陽性細胞計0分、陽性細胞<30%計1分、30%～70%計2分、>70%計3分；染色為淺黃色計1分、黃色計2分、棕黃色計3分；兩者綜合評分：0分為陰性、1～2分為弱陽性、3～4分為陽性、5～6分為強陽性。

1.3.2Western印跡檢測 膠質瘤組織標本放入EP管中，加入組織裂解液，4℃ 10 000 r/min離心20 min，取上清，BCA法蛋白定量，吸取100 μg總蛋白，100℃水浴10 min變性后行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將目標細胞蛋白濕法轉移至PVDF膜，TBST液洗滌后加一抗：兔抗人ADAM17多克隆抗體(1∶200稀釋)、鼠抗人EGFR單克隆抗體(1∶500稀釋)，β-actin抗體(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜；加二抗，室溫孵育60 min，DAB顯色，Image J分析蛋白表達條帶的灰度值，以β-actin為內參，計算ADAM17、EGFR蛋白的相對表達量。

1.3.3RT-PCR檢測 液氮下研碎膠質瘤組織標本，Trizol法提取RNA，按試劑盒說明進行PCR擴增，反應體系共30 μl：Taq酶15 μl，cDNA 1 μl，上、下游引物各2 μl，雙蒸水10 μl；反應條件：90℃ 10 min、94℃ 5 min、56℃ 40 s、72℃ 1 min，共40個循環。產物行瓊脂糖凝膠電泳，掃描檢測目標條帶，以β-actin為內參計算ADAM17 、EGFR mRNA的相對表達量。

1.3.4流式細胞術檢測CD4+CD25+Treg細胞比率 使用全自動組織處理器得到膠質瘤組織單細胞懸液，加入淋巴細胞分離液行梯度離心，收集單個核細胞層；分別加入Per CP標記的CD4抗體、FTTC標記的CD25抗體，4℃暗室孵育60 min，3 000 r/min離心棄上清，磷酸緩沖液洗滌后重懸細胞，滴加二抗，待標記完成后用流式細胞儀分選CD4+CD25+Treg細胞并計數。

1.4統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗和Spearman相關分析。

2 結 果

2.1腦膠質瘤中ADAM17、EGFR蛋白陽性表達情況 ADAM17、EGFR蛋白多陽性表達于細胞質，在正常腦組織中陽性表達率為30.00%(3/10)、40.00%(4/10)，均為弱陽性。腦膠質瘤組織中陽性表達率為86.53%(45/52)、94.23%(49/52)，其中低度惡性組織中陽性表達率為73.68%(14/19)、78.95%(15/19)，主要為陽性表達；高度惡性組織中陽性表達率為93.94%(31/33)、96.97%(32/33)，主要為強陽性表達。膠質瘤組織中ADAM17、EGFR蛋白陽性表達率明顯高于正常腦組織(P<0.01)；高度惡性組織明顯高于低度惡性組織(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 不同惡性程度腦膠質瘤中ADAM17蛋白陽性表達情況(×400)

圖2 不同惡性程度腦膠質瘤中EGFR蛋白陽性表達情況(×400)

2.2腦膠質瘤中ADAM17、EGFR蛋白表達量 正常腦組織、低度惡性腦組織、高度惡性腦組織中ADAM17蛋白相對表達量分別為(0.17±0.05)、(0.33±0.07)、(0.79±0.16)；EGFR蛋白相對表達量分別為(0.00±0.00)、(0.51±0.10)、(1.21±0.26)。腦膠質瘤組織中ADAM17、EGFR蛋白表達量明顯高于正常腦組織；高度惡性腦組織中蛋白表達量明顯高于低度惡性腦組織(P<0.01)。見圖3。

圖3 不同惡性程度腦膠質瘤中ADAM17、EGFR蛋白表達情況

2.3腦膠質瘤中ADAM17、EGFR mRNA表達情況 正常腦組織、低度惡性腦組織、高度惡性腦組織中ADAM17 mRNA相對表達量分別為(0.19±0.01)、(0.65±0.03)、(1.38±0.09)；EGFR mRNA相對表達量分別為(0.01±0.00)、(0.47±0.02)、(1.10±0.06)。腦膠質瘤組織ADAM17、EGFR mRNA相對表達量明顯高于正常腦組織；高度惡性腦組織相對表達量明顯高于低度惡性腦組織(P<0.01)。

2.4腦膠質瘤中CD4+CD25+Treg細胞比率 正常腦組織、低度惡性腦組織、高度惡性腦組織中CD4+CD25+Treg細胞比率分別為(3.61±0.34)、(6.75±0.18)、(11.37±0.53)；腦膠質瘤組織明顯高于正常腦組織，且隨惡性程度增加而升高(P<0.01)。

2.5相關性分析 腦膠質瘤組織中ADAM17、EGFR蛋白表達水平與CD4+CD25+Treg細胞比率呈正相關(r=3.614、2.186，P<0.05)；ADAM17、EGFR mRNA表達水平與CD4+CD25+Treg細胞比率呈正相關(r=1.405、1.118，P<0.05)。

3 討 論

膠質瘤是人腦中的常見腫瘤，放化療、生物治療等傳統手段的總體預后不理想。近年來，隨著對膠質瘤機體免疫耐受機制的進一步研究發現，調節T細胞在病情發展過程中發揮關鍵作用〔4〕，其中CD4+CD25+Treg不僅能夠抑制自身免疫性疾病發生，還參與腫瘤的免疫調節，可有效抑制樹突細胞和CTL細胞的功能，抑制腫瘤抗原的呈遞與識別，降低機體的細胞免疫力，使腫瘤處于免疫逃避狀態〔5〕。同時CD4+CD25+Treg還可對輔助性T細胞(Th)1/ Th2信號通路產生影響，減弱Th對腫瘤細胞的殺傷作用〔6〕。相關研究發現，ADAM17、EGFR蛋白具有神經細胞誘導作用，在神經軸突中可檢測到其表達，與神經發育、重塑具有相關性〔7〕。研究發現，ADAM17、EGFR在胃癌、肺癌、乳腺癌等多種癌細胞中均存在高表達，且與病理分級呈正相關，在癌細胞遷移、侵襲中發揮重要作用〔8〕，但目前國內外仍鮮見ADAM17、EGFR蛋白與CD4+CD25+Treg在人腦膠質瘤中的表達及作用研究。近年來研究已經證實腦組織并非免疫豁免器官，如腫瘤發生后會損壞血腦屏障，淋巴細胞進入中樞神經細胞調節免疫功能；星狀膠質細胞和小膠質細胞均在顱內發揮免疫監控作用〔9〕。同時膠質瘤的發生、發展及復發與免疫缺陷存在明顯關聯〔10〕。

ADAM17、EGFR是CD4+CD25+Treg的表面特異性分子，能夠誘發其免疫耐受。綜合CD4+CD25+Treg在腫瘤微環境中免疫耐受作用，可認為ADAM17、EGFR通過誘發CD4+CD25+Treg的負性免疫調節，使腫瘤細胞脫離機體免疫監視，進而促進膠質瘤的發生、發展。

1Yang Z,Zhao T,Liu Y,etal.Upregulation of tumor suppressor WWOX promotes immune response in glioma〔J〕.Cell immunol,2013;285(1/2):1-5.

2Anirban G,Malabika B,Pallab S,etal.T11 target structure exerts effector function by activating immune cells in CNS against glioma where cytokine modulation provide favorable microenvironment〔J〕.Indian J Exp Biol,2010;48(9):879-88.

3劉英姿.Treg細胞和IL-18在腦膠質瘤中的作用研究〔D〕.石家莊：河北醫科大學,2011.

4劉許昌,王 健.老年惡性腦膠質瘤術后替莫唑胺化療聯合放療的近遠期療效〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(20):5835-6.

5Maes W,van Gool SW.Experimental immunotherapy for malignant glioma:lessons from two decades of research in the GL261 model〔J〕.Cancer Immunol Immunothera,2011;60(2):153-60.

6皇甫羅鍇.B7-H1在腦膠質瘤中對Treg細胞的調節作用〔D〕.西安：第四軍醫大學,2013.

7趙 雪,宋文剛.重組金針菇免疫調節蛋白的純化及生物活性研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2015;16(2):178-81.

8Xu L,Xiao H,Xu M,etal.Glioma-derived T cell immunoglobulin-and mucin domain-containing molecule-4(TIM4) contributes to tumor tolerance〔J〕.J Biolog Chem,2011;286(42):36694-9.

9許昌海,金紅旭.持續性腎臟替代聯合血必凈對膿毒癥患者炎癥反應、免疫功能的影響〔J〕.中國衛生工程學,2016;(5):499-500.

10Piotrowska MJ,Bodnar M,Poleszczuk J,etal.Mathematical modelling of immune reaction against gliomas:Sensitivity analysis and influence of delays〔J〕.Nonlinear Anal Real World Appl,2013;14(3):1601-20.

呼鐵民(1974-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事顱內腫瘤及顱內動脈瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)20-5063-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.049

〔2017-02-03修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)