七氟烷在大鼠心臟再灌注心律失常中的作用及對(duì)心肌細(xì)胞電生理的影響

查木哈格 于建設(shè)

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

七氟烷在大鼠心臟再灌注心律失常中的作用及對(duì)心肌細(xì)胞電生理的影響

查木哈格 于建設(shè)

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

目的探討七氟烷在大鼠心臟再灌注心律失常中的作用及對(duì)心肌細(xì)胞電生理的影響。方法取SD大鼠40只，采用Langendoeff灌注建立心臟再灌注心律失常模型，采用重碳酸鹽緩沖液(KH)進(jìn)行15 min處理后分為空白對(duì)照組、缺血再灌注組、七氟烷預(yù)處理組和七氟烷后處理組，每組10只，采用標(biāo)準(zhǔn)的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)。結(jié)果缺血再灌注組再灌注15、30 min左心室舒張壓(LVDP)及心率水平低于空白對(duì)照組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預(yù)處理組及缺血再灌注組再灌注15、30 min左室舒張末壓(LVEDP)水平高于空白對(duì)照組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預(yù)處理組處理后肌鈣蛋白Ⅰ水平低于缺血再灌注組，高于空白對(duì)照組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預(yù)處理組和缺血再灌注組均可見(jiàn)明顯的心肌梗死；七氟烷后處理組處理后細(xì)胞內(nèi)鈣離子和活性氧水平低于七氟烷預(yù)處理組和缺血再灌注組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預(yù)處理組、缺血再灌注組心肌細(xì)胞動(dòng)作電位參數(shù)低于空白對(duì)照組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預(yù)處理組電位參數(shù)高于缺血再灌注組(P<0.05)。結(jié)論心臟再灌注心律失常大鼠采用七氟烷處理后能改善其血流動(dòng)力學(xué)，減少梗死面積，減少對(duì)心肌細(xì)胞電生理的影響。

心肌缺血；再灌注心律失常；七氟烷；血流動(dòng)力學(xué)

有研究提出機(jī)體短暫心肌缺血能對(duì)心肌缺血產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，成為缺血預(yù)處理〔1〕。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)學(xué)者提出〔2〕，機(jī)體產(chǎn)生時(shí)間缺血后，在復(fù)灌時(shí)進(jìn)行反復(fù)短暫缺血處理，能緩解患者癥狀，降低再灌注損傷發(fā)生率。研究顯示〔3〕，麻醉藥物預(yù)處理或麻醉藥后處理，均能進(jìn)一步激發(fā)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，從而能減輕心肌缺血再灌注損傷(MIRI)程度。此外，通過(guò)麻醉藥物實(shí)施預(yù)處理和后處理較機(jī)械性處理安全性較高，可控性也較強(qiáng)，臨床應(yīng)用的可行性較大，能作為缺血性心臟病患者心臟或非心臟手術(shù)的一種保護(hù)性干預(yù)方法。目前，臨床上常用的麻醉藥物包括異氟烷、七氟烷、恩氟烷等，但揮發(fā)性麻醉藥物在缺血中的處理普遍認(rèn)為：被動(dòng)保護(hù)作用機(jī)制可能與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)鈣超載、降低氧自由基水平等有關(guān)，而主動(dòng)保護(hù)則與機(jī)體相關(guān)酶通路有關(guān)，同時(shí)調(diào)控相關(guān)酶的活性從而控制蛋白的翻譯、轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生心肌保護(hù)作用，該結(jié)論尚未得到進(jìn)一步證實(shí)〔4〕。本文擬探討七氟烷在大鼠心臟再灌注心律失常中的作用及對(duì)心肌細(xì)胞電生理的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 于2015年1月至2016年7月取SD大鼠40只，SPF級(jí)，雌雄隨機(jī)，體重250～300 g，平均(278.1±5.3)g，采用重碳酸鹽緩沖液(KH液)進(jìn)行15 min處理后分為空白對(duì)照組、缺血再灌注組、七氟烷預(yù)處理組和七氟烷后處理組，每組10只。均由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)大鼠飼養(yǎng)、處理均符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》〔5〕相關(guān)規(guī)則。試驗(yàn)均通過(guò)醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2儀器及試劑 主要儀器和試劑主要有七氟烷(Sevoflurane)(Mamishi Pharmaceutical 公司，日本)，Ⅱ型膠原酶(Worthington公司)，F(xiàn)ura-2AM和DCFH-DA熒光探針(南通碧云天公司)，2，3，5-氯三苯四唑(Sigma公司)，血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)設(shè)備(AD Instruments 公司，Colorado Springs，美國(guó))，熒光分光光度計(jì)(型號(hào)：F320，港東公司，天津)，微電極控制儀(型號(hào)SUTTER P-97 (美國(guó)Sutter公司))，微電極拋光儀(型號(hào) MF-830，日本 NARISHIGE 公司)。

1.3方法

1.3.1模型構(gòu)建 向入選大鼠其腹腔內(nèi)注射1 000 U/kg肝素完成肝素化處理，10 min后向腹腔內(nèi)注射1.5 g/kg烏拉坦進(jìn)行麻醉，待麻醉生效后將其固定在實(shí)驗(yàn)室操作臺(tái)上。找到解剖標(biāo)志劍突后，沿著胸骨下緣剪開(kāi)胸腔，然后輕輕剪開(kāi)心包，游離心臟周?chē)慕M織和脂肪，確定心底部的主動(dòng)脈，了解心臟周?chē)慕Y(jié)構(gòu)、聯(lián)系，沿著心底部快速橫斷主動(dòng)脈，取出心臟并放入4℃無(wú)鈣式液中，去除心腔中的殘留血液和組織。在剪取心臟的同時(shí)，預(yù)留長(zhǎng)為2 mm的主動(dòng)脈，便于懸掛在灌注設(shè)備上。然后將心臟在取出后30 s內(nèi)懸掛在Langendoeff灌注裝置上，結(jié)扎并固定主動(dòng)脈，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，控制流速為10 ml/min向主動(dòng)脈泵入濃度為95.0%、5%CO2飽和的KH液，整個(gè)灌注裝置提前采用水浴箱進(jìn)行處理，控制心臟灌注液溫度為37℃，從而完成大鼠模型建立〔6〕。

1.3.2處理方法 四組大鼠模型建立完畢后，根據(jù)預(yù)先分組進(jìn)行相應(yīng)的處理。空白對(duì)照組在建模后給予普通KH液進(jìn)行75 min灌注；缺血再灌注組建模后在平衡器進(jìn)行20 min灌注，隨后停止灌注25 min，再次進(jìn)行30 min灌注；七氟烷預(yù)處理組建模后平衡器給予濃度為3%七氟烷飽和的KH液進(jìn)行15 min灌注，然后采用KH液進(jìn)行5 min洗脫，然后停止灌注25 min，然后采用普通KH液進(jìn)行30 min復(fù)灌；七氟烷后處理組建模成功后灌注普通KH液進(jìn)行20 min灌注，停止灌注25 min，復(fù)灌之初采用濃度為3%七氟烷飽和KH液進(jìn)行15 min灌注，然后采用普通KH液進(jìn)行15 min灌注〔7〕。

1.4觀察指標(biāo) (1)血流動(dòng)力學(xué)：采用Langendoeff灌注監(jiān)測(cè)系統(tǒng)測(cè)定四組大鼠血流動(dòng)力學(xué)變化情況，了解大鼠處理后血流動(dòng)力學(xué)情況〔8〕。(2)肌鈣蛋白 Ⅰ：四組大鼠分別在平衡期、復(fù)灌結(jié)束時(shí)采用1 ml冠脈流出液，采用180全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫系統(tǒng)及配套試劑盒完成肌鈣蛋白I的測(cè)定。(3)心肌梗死面積：采用2，3，5-氯三苯四唑染色法進(jìn)一步確定四組大鼠的心肌梗死面積。在灌注結(jié)束后，采集各組大鼠心臟，沿著短軸切成厚度為1～2 mm切片，拍照后采用相關(guān)軟件進(jìn)行圖像分析，根據(jù)梗死面積占總面積的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)算〔9〕。(4)細(xì)胞內(nèi)鈣離子或活性氧水平。采用熒光指示劑Fura-2 AM測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。采用熒光指示劑2′7′-二氨熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)完成四組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的測(cè)定，相關(guān)操作步驟嚴(yán)格遵循儀器、試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。(5)電生理實(shí)驗(yàn)：根據(jù)醫(yī)院現(xiàn)有條件采用膜片鉗系統(tǒng)，包括電極支持系統(tǒng)、膜片鉗反饋系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)設(shè)備等。控制實(shí)驗(yàn)室溫度恒定，將整個(gè)膜片鉗實(shí)驗(yàn)在恒溫下，向灌流槽中滴加0.5 ml細(xì)胞懸液，5～10 min靜置，待細(xì)胞貼壁后采用純氧飽和的細(xì)胞外液進(jìn)行5～10 min灌流，速度為1～2 ml/min。經(jīng)膜片鉗反饋的信號(hào)經(jīng)過(guò)電極導(dǎo)絲傳入細(xì)胞，產(chǎn)生電流信號(hào)經(jīng)過(guò)負(fù)反饋放大器進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)過(guò)數(shù)模轉(zhuǎn)換后傳入到計(jì)算機(jī)中，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)〔10〕。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1四組再灌注15、30 min血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 缺血再灌注組再灌注15、30 min左心室舒張壓(LVDP)及心率水平低于空白對(duì)照組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預(yù)處理組及缺血再灌注組再灌注15、30 min左室舒張末壓(LVEDP)水平高于空白對(duì)照組(P<0.05)；七氟烷后處理組再灌注15、30 min LVDP、心率及LVEDP高于七氟烷預(yù)處理組及缺血再灌注組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 四組再灌注15、30 min血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)及處理前后肌鈣蛋白Ⅰ水平比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05；與七氟烷后處理組比較：2)P<0.05；與缺血再灌注組比較：3)P<0.05；下表同

2.2四組大鼠處理前及處理后肌鈣蛋白Ⅰ水平比較 四組大鼠處理前肌鈣蛋白Ⅰ水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預(yù)處理組處理后低于缺血再灌注組，高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3四組心肌梗死面積比較 空白對(duì)照組未見(jiàn)心肌梗死，故未列入統(tǒng)計(jì)。七氟烷后處理組、七氟烷預(yù)處理組和缺血再灌注組均可見(jiàn)明顯的心肌梗死，七氟烷后處理組、七氟烷預(yù)處理組梗死面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但小于缺血再灌注組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.4四組處理前后細(xì)胞內(nèi)鈣離子和活性氧水平比較 兩組處理前細(xì)胞內(nèi)鈣離子和活性氧水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；七氟烷后處理組處理后細(xì)胞內(nèi)鈣離子和活性氧水平低于七氟烷預(yù)處理組和缺血再灌注組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖2 各組心肌梗死面積比較

組別鈣離子(mmol/L)處理前處理后活性氧水平(ng/ml)處理前處理后七氟烷后處理組230±12132±11253±32157±13七氟烷預(yù)處理組229±11145±122)251±31171±162)缺血再灌注組231±13164±162)255±34189±182)

2.5四組處理后心肌細(xì)胞動(dòng)作電位參數(shù)變化比較 七氟烷后處理組、七氟烷預(yù)處理組、缺血再灌注組心肌細(xì)胞動(dòng)作電位參數(shù)低于空白對(duì)照組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預(yù)處理組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但高于缺血再灌注組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 四組處理后心肌細(xì)胞動(dòng)作電位參數(shù)變化比較

3 討 論

七氟烷是臨床上使用較多的麻醉藥物，該藥物具有誘導(dǎo)快、血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定及冠脈竊血發(fā)生率低等特點(diǎn)，對(duì)于大鼠心臟再灌注心律失常中具有良好的保護(hù)作用，能作為手術(shù)中心肌保護(hù)的一種重要手段，從而能有效改善患者預(yù)后。七氟烷根據(jù)給藥時(shí)間及心肌缺血發(fā)生先后順序可以分為缺血前使用、缺血時(shí)使用及缺血后使用。通過(guò)七氟烷能完成心肌的保護(hù)，能降低機(jī)體內(nèi)肌鈣蛋白I水平，從而降低心肌梗死面積〔11〕。

七氟烷能改善機(jī)體左心室后負(fù)荷，有效抑制左心房、心臟收縮，從而能降低心室舒張功能，機(jī)體能藥物依賴的降低血壓水平，改善機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，七氟烷能穩(wěn)定機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)，改善機(jī)體癥狀，能直接抑制心臟L型鈣通道，從而阻礙鈣離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，降低肌漿網(wǎng)對(duì)于鈣離子的利用，從而抑制心肌收縮力。此外，七氟烷還能調(diào)節(jié)心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而能保護(hù)心肌細(xì)胞膜，保護(hù)再灌注心肌功能。本研究結(jié)果提示，七氟烷在大鼠心臟再灌注心律失常中具有良好的作用，藥物能維持心肌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)電位正常，避免正常心肌再灌注損傷后運(yùn)動(dòng)電位引起的差異，從而能降低室壁離散度，能有效預(yù)防再灌注心律失常發(fā)生率。此外，七氟烷能減少心肌細(xì)胞間的異質(zhì)性，進(jìn)一步預(yù)防心肌復(fù)極離散度，降低再灌注心律失常的嚴(yán)重程度〔12〕。

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內(nèi)蒙古自治區(qū)自然基金項(xiàng)目(No.2016MS(LH)0820);內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃委員會(huì)項(xiàng)目(No.201303056)

于建設(shè)(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要從事臨床麻醉研究。

查木哈格(1979-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事臨床麻醉研究。

R54

A

1005-9202(2017)20-4971-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.007

〔2017-02-18修回〕

(編輯 袁左鳴)