當藥醇苷對β淀粉樣蛋白誘導神經細胞損傷模型GSK-3β及Akt表達的影響

趙志英 胡志強 高洋洋

(內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古 包頭 014010)

當藥醇苷對β淀粉樣蛋白誘導神經細胞損傷模型GSK-3β及Akt表達的影響

趙志英 胡志強 高洋洋

(內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古 包頭 014010)

目的研究當藥醇苷對阿爾茨海默病(AD)細胞模型糖原合成酶激酶(GSK)-3β及蛋白激酶 B(Akt)表達的影響及機制。方法10 μmol/L Aβ作用于PC12細胞制作成AD細胞模型。實驗分為正常對照組，模型組，當藥醇苷低劑量組，當藥醇苷高劑量組，LY294002組，LY294002+當藥醇苷高劑量組。結果與正常對照組比較，模型組p-Akt蛋白水平明顯下降(P<0.05)，而p-GSK-3β蛋白顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，當藥醇苷高、低劑量組p-Akt蛋白表達水平明顯升高，p-GSK-3β蛋白表達顯著下降(P<0.05)；當藥醇苷高、低劑量組間比較差異不顯著(P>0.05)；用LY294002處理的兩組p-Akt蛋白和p-GSK-3β蛋白表達水平與正常對照組無顯著差異(P>0.05)，LY294002+當藥醇苷高劑量組與當藥醇苷高、低劑量組的p-Akt蛋白和p-GSK-3β蛋白表達水平比較有統計學差異(P<0.05)。結論當藥醇苷可以拮抗Aβ導致的AD神經損傷，具有神經細胞保護作用，其作用機制可能通過激活PI3K/Akt 信號通路，提高p-Akt蛋白表達水平，抑制該通路下游靶分子 p-GSK-3β 活性而實現。

當藥醇苷；阿爾茨海默病(AD)；PI3K/Akt通路；糖原合成酶激酶(GSK)-3β

糖原合成酶激酶(GSK)-3β是磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路下游分子，是少見的通過磷酸化而失活的蛋白激酶之一，其磷酸化后活性明顯降低。GSK-3β水平增高可以經過一系列級聯反應導致β淀粉樣蛋白(Aβ)異常沉積和tau蛋白過度磷酸化，在阿爾茨海默病(AD)患者腦內水平明顯增高〔1〕。因此，對GSK-3β的調控可能成為治療AD的重要靶點。Xanthones(口山酮)是一類有廣泛藥理活性的多酚類化合物，具有神經系統興奮、抗炎、保肝以及抗病毒等作用〔2〕。口山酮類化合物包括雛菊葉龍膽酮和當藥醇苷等，當藥醇苷有緩解烏頭堿引發的心律失常及保護心肌細胞等作用〔3〕，而當藥醇苷拮抗神經損傷的研究少見。本文探討當藥醇苷對Aβ引起神經細胞損傷的影響及部分機制。

1 材料和方法

1.1材料 PC12細胞購自上海細胞所；當藥醇苷來源于包頭醫學院蒙藥藥用植物資源保護與開發利用院士工作站，純度≥95%。Aβ，Sigma公司產品分裝，羊抗鼠IgG二抗購于寶信生物科技公司。

1.2方法

1.2.1PC12細胞培養 復蘇PC12細胞，DMEM培養液培養，2～3 d換液一次，待PC12細胞生長旺盛，占瓶底70%～80%時傳代，取對數生長周期細胞用于實驗。加入Aβ 10 μmol/L作用PC12細胞24 h后制作AD細胞模型。

1.2.2分組 將培養的PC12細胞分為六組。(A)正常對照組(正常培養的PC12細胞)；(B)神經細胞損傷模型組(在培養的PC12細胞中加入Aβ 10 μmol/L)；(C)當藥醇苷低劑量組(Aβ 10 μmol/L+當藥醇苷25 mmol/L)；(D)當藥醇苷高劑量組(Aβ 20 μmol/L+當藥醇苷50 mmol/L)；(E)LY294002組(在PC12細胞中加入Aβ 10 μmol/L+LY294002即PI3K/Akt信號通路抑制劑)；(F)LY294002+當藥醇苷高劑量組(Aβ10 μmol/L+LY294002+當藥醇苷50 mmol/L)。

1.2.3Western印跡檢測 將各組PC12細胞分別加入裂解液提取蛋白，用Bradford法蛋白定量，蛋白質樣品用SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜。三乙醇胺緩沖鹽水溶液洗膜后加入堿性磷酸酶(AP)標記的二抗，ECL檢測液顯色，β-actin為內參，用凝膠圖像軟件系統分析。

1.3統計學方法 使用SPSS19.0軟件，定量資料兩樣本均數間比較行t檢驗，多個樣本均數間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組 Akt與p-Akt 表達水平比較 與正常對照組〔(101.31±9.98)%〕比較，模型組p-AKT/AKT水平〔(61.29±6.58)%〕明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，25、50 μmol/L當藥醇苷組p-AKT/AKT表達水平〔(99.89±10.23)%，(101.67±10.86)%〕明顯升高(P<0.05)，而當藥醇苷二組間比較差異不顯著(P>0.05)；用LY294002處理的LY294002組和LY294002+當藥醇苷高劑量組，p-AKT/AKT表達水平〔(63.36±6.81)%，(65.27±7.02)%〕與正常對照組無顯著差異(P>0.05)，LY294002組與25、50 μmol/L當藥醇苷組的p-Akt蛋白表達水平比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

A：正常對照組；B：模型組；C：當藥醇苷低劑量組；D：當藥醇苷高劑量組；E：LY294002組；F：LY294002+當藥醇苷高劑量組；下圖同圖1 Western印跡檢測各組細胞Akt、p-Akt表達

2.2各組 GSK-3β 及 p-GSK-3β 蛋白表達水平比較 與正常對照組〔(63.24±6.45)%〕比較，模型組p-GSK-3β/GSK-3β〔(34.67±4.32)%〕顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，25、50 μmol/L當藥醇苷組p-GSK-3β/GSK-3β表達明顯升高〔(89.13±9.16)%，(92.64±9.03)%〕(P<0.05)；25、50 μmol/L當藥醇苷組間比較差異不顯著(P>0.05)；LY294002組和LY294002+當藥醇苷高劑量組，p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達水平〔(75.23±7.22)%，(71.46±7.17)%〕與正常對照組無顯著差異(P>0.05)，LY294002+當藥醇苷高劑量組與25、50 μmol/L當藥醇苷組的表達水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 Western印跡檢測各組細胞GSK-3β、p-GSK-3β表達

3 討 論

PI3K/Akt信號通路的調控在神經元生存、代謝、增殖、分化以及最終的凋亡過程中發揮重要作用〔4〕。Akt是PI3K/Akt信號通路中位于核心環節的重要信號蛋白，PI3K 通過磷酸化Akt使其活性增強，Akt活化后引發下游信號分子GSK-3β、Bcl-2相關蛋白、caspase系列蛋白酶等磷酸化，從而起到抗神經元凋亡及促進神經元存活的作用〔5,6〕。GSK-3β 是一種通過磷酸化作用而抑制糖原合成酶的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，GSK-3β磷酸化后其生物活性即受到相應抑制。GSK-3β的過度表達及活性增高可以導致tau蛋白過度磷酸化，而tau 蛋白過度磷酸化是AD的病因之一，也是該病重要的分子生物學改變特征。GSK-3β通過調節APP的裂解導致Aβ的生成增加〔7〕，因此，通過采取相應措施抑制GSK-3β的磷酸化，可能成為AD治療的靶點。本研究發現當藥醇苷可以拮抗Aβ導致的AD神經損傷，抑制GSK-3β磷酸化，具有神經細胞保護的作用。AD發病機制尚未完全闡明，其中Aβ級聯學說被廣為接受，即腦內在遺傳及內外環境因素發生變化刺激下生成Aβ，Aβ在腦內特定區域聚集，產生相應的神經毒性，造成神經突觸損傷、神經元凋亡，最終引發認知障礙。而Aβ可能主要通過PI3K/Akt 信號通路途徑引發神經元凋亡〔8〕。PI3K/Akt 通路下游分子中的GSK-3β是多種重要凋亡相關蛋白之一，GSK-3β可以促進過量Aβ生成、Tau蛋白過度磷酸化，并可以促使下游底物促凋亡蛋白caspase-9以及 caspase-3的磷酸化。磷酸化GSK-3β可以導致神經突觸功能可塑性障礙下降以及神經元的凋亡〔9〕。因此抑制GSK-3β的活性可能對AD的治療起到有益的作用，GSK-3β將成為治療AD藥物作用的強有力的靶點之一。龍膽科龍膽屬(Gentiana)植物及其提取物具有抑制乙酰膽堿酯酶、保肝、抗氧化、抗炎、抗抑郁、抗腫瘤等多方面的藥理作用〔10,11〕。本研究結果發現，Aβ能降低PC12細胞中p-Akt蛋白表達水平，提高p-GSK-3β蛋白表達水平，當藥醇苷可拮抗Aβ引起的這種效應，即下調Aβ引起的PC12細胞p-Akt蛋白表達水平和上調p-GSK-3β蛋白表達水平；若預先用PI3K/Akt信號通路處理PC12細胞，再應用當藥醇苷處理細胞，則不會出現PC12細胞p-Akt蛋白表達水平和p-GSK-3β蛋白表達水平的改變，這與當藥醇苷對抗PC12細胞損傷的效果是一致的，說明GSK-3β磷酸化水平下降可能是通過激活了上游的 Akt 活性，促使Akt磷酸化水平升高而引起，從而對P12細胞起到保護作用。

1Mohan ML，Jha BK，Gupta MK，etal.Phosphoinositide 3-kinase gamma inhibits cardiac GSK-3 independently of Akt〔J〕.Sci Signal，2013;6(259)：a4.

2呂麗娟，王艷芳，閆 墩，等.尖葉假龍膽中當藥醇苷的制備及其抗烏頭堿致小鼠心律失常作用〔J〕.中國新藥與臨床雜志，2015;34(8)：630-5.

3Karran E，Mercken M，De Strooper B.The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease:an appraisal for the development of therapeutics〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2011;10(9):698-712.

4代文博，曾 亮.PI3K/Akt信號通路與阿爾茨海默病關系的研究進展〔J〕.現代醫藥衛生，2014;30(10)：1499-501.

5Kong J,Ren G,Jia N,etal.Effects of nicorandil in neuroprotective activation of PI3K/AKT pathways in a cellular model of Alzheimer's disease〔J〕.Eur Neurol,2013;70(3/4):233-41.

6Jha SK,Jha NK,Kar R,etal.p38 MAPK and PI3K/AKT signalling cascades in Parkinson's disease〔J〕.Int J Mol Cell Med,2015;4(2):67-86.

7Benek O,Aitken L,Hroch L,etal.A direct interaction between mitochondrial proteins and amyloid-beta peptide and its significance for the progression and treatment of Alzheimer's disease〔J〕.Curr Med Chem,2015;22(9):1056.

8Sancheti H,Akopian G,Yin F,etal.Age-dependent modulation of synaptic plasticity and insulin mimetic effect of lipoic acid on a mouse model of Alzheimer's disease 〔J〕.PLoS One,2013;8(7):e69830.

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11倉木決，黃宛雨.藏藥蒂達的藥理作用〔J〕.西藏科技，2017;(1)：40-1.

TheeffectofswertianolinontheexpressionsofGSK-3betaandAktinnervecellinjurymodelinducedbyAβ

ZHAOZhi-Ying,HUZhi-Qiang,GAOYang-Yang.

InnerMongoliaUniversityOfScience&Technology,BaotouMedicalCollege,Baotou014010,InnerMongolia,China

ObjectiveTo explore the effect of Swertianolin against the Aβ-inducing PC12 cells(Alzheimer's disease, AD) and evaluate the expression of glycogen synthase kinase(GSK)-3β and protein kinase B (Akt) after the treatment with Swertianolin to explore the mechanism involved in it.MethodsAD model was induced by 10 μmol/L Aβ in PC12 cells. Cells were divided into: control, Aβ-inducing (model), low, high dose of Swertianolin, LY294002 inhibitor, LY294002 inhibitor + high dose of Swertianolin groups.ResultsCompared with control group, the p-Akt protein level was significantly decreased (P<0.05), while the p-GSK-3 protein was significantly increased(P<0.05) in model group. Compared with model group, p-Akt protein was significantly increased and p-GSK-3β protein was significantly decreased in high and low dose groups (P<0.05). There were no significant differences in p-Akt and p-GSK-3β protein between high and the low dose groups (P>0.05). There were no significant differences in expressions of p-Akt and p-GSK-3β protein among LY294002 inhibitor, LY294002 inhibitor + high dose of Swertianolin groups and control group (P>0.05). There were significant differences in expressions of p-Akt and p-GSK-3β protein between LY294002 inhibitor + high dose of Swertianolin and low, high dose of Swertianolin groups.ConclusionsSwertianolin could reduce Aβ-inducing nerve injury in PC12 cell by increasing the expression of p-Akt protein and decreasing the activity of p-GSK-3βin the PI3K/Akt signaling pathway.

Swertianolin;Alzheimer's disease(AD);PI3K/Akt signaling pathway;Glycogen synthase kinase-3 beta (GSK-3 beta)

國家自然科學基金資助項目(No.81560195)；內蒙古自然科學基金資助項目(No.2015MS0864)；包頭醫學院科學研究基金資助項目(No.BYJJ-YF201624)

胡志強(1975-)，男，在職碩士，副主任醫師，主要從事神經損傷與保護研究。現在烏蘭浩特市人民醫院工作。

趙志英(1970-)，男，教授，博士，主要從事神經退行性疾病發病機制及防治研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)20-4969-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.006

〔2017-03-17修回〕

(編輯 徐 杰)