Apelin13增強大鼠嗎啡鎮痛效能及對p38 MAPK和ERK活化的影響

郭延洪 阿良德 王占鵬 樊海寧

(青海大學附屬醫院麻醉科，青海 西寧 810000)

Apelin13增強大鼠嗎啡鎮痛效能及對p38 MAPK和ERK活化的影響

郭延洪 阿良德 王占鵬 樊海寧

(青海大學附屬醫院麻醉科，青海 西寧 810000)

目的探討鞘內注射Apelin13(APL)對大鼠嗎啡鎮痛效能的影響。方法選取40只雄性健康SD大鼠進行鞘內置管，并隨機分為對照組、APL高劑量(APL-H)組、中劑量(APL-M)組及低劑量(APL-L)組(n=10)，APL-H、APL-M及APL-L組分別接受鞘內注射10 μl含APL 0.05、0.5、5 μg的MES緩沖液，對照組鞘內注射等體積的MES緩沖液，1次/d，連續5 d。各組均在鞘內給藥前(d0)和給藥后第6天(d6)、7(d7)、8(d8)天皮下注射10 mg/kg嗎啡，測定各組右后爪的熱刺激縮足反應潛伏期(PWTL)及甩尾潛伏期(TFL)，并計算最大可能鎮痛效應百分比(MPE)。第8天行為學測試結束后處死大鼠，采用Western印跡檢測脊髓腰膨大處的磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)和磷酸化細胞外調節蛋白激酶(p-ERK)的表達。結果各組d0時基礎PWTL和TFL的差異無統計學意義(P>0.05)，且對照組和APL-L組d0、d6、d7、d8時PWTL、MPE和TFL的差異無統計學意義(P>0.05)；APL-M組和APL-H組d6～d8時的PWTL、MPE和TFL水平均高于d0，且APL-M組和APL-H組d6～d8時的PWTL、MPE和TFL水平均高于對照組(P<0.05)；APL-M組和APL-H組的p-p38 MAPK和p-ERK水平均低于對照組和APL-L組，且APL-H組該兩種蛋白水平均低于APL-L組和APL-M組(P<0.05)。結論鞘內注射APL可抑制熱痛敏并提高嗎啡鎮痛效能，其機制可能與抑制p38 MAPK和ERK活化有關，在恢復嗎啡耐受大鼠的嗎啡鎮痛效果上有一定價值。

Apelin13；嗎啡；鎮痛效能；p38絲裂原活化蛋白激酶；細胞外調節蛋白激酶

Apelin是由人體APLN基因合成的含77個氨基酸的前蛋白原，轉運至內質網后切割成為不同的信號肽〔1〕，其中Apelin-13(APL)含有13個氨基酸。Apelin受體在心血管系統中表達，其在控制水和食物攝入中發揮重要作用〔2～4〕。近期研究發現APL具有鎮痛效應，且可減輕神經病理性疼痛〔5，6〕。嗎啡是臨床上常用的麻醉藥物，長期應用嗎啡可導致嗎啡鎮痛效應的下降，出現嗎啡耐受現象〔7〕。但目前APL能否影響嗎啡的鎮痛效能尚未有相關報道，故本研究觀察鞘內注射外源性APL對嗎啡鎮痛效能的影響及對脊髓腰膨大處p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和細胞外調節蛋白激酶(ERK)活化的作用，從而探討APL對嗎啡鎮痛效能的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 APL購自美國Sigma公司，鹽酸嗎啡注射液購自東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，兔抗磷酸化(p)-p38 MAPK抗體購自美國Abcam公司，兔抗p-ERK抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自美國CST公司，BCA 蛋白測定試劑盒購自美國Pierce公司，ECL化學發光試劑盒及PVDF膜購自美國Millipore公司；足底輻射熱痛覺測試儀，美國IITC Life Science公司；垂直電泳儀及半干電轉移儀，美國Bio-Rad 公司。

1.2動物與分組 40只雄性SD大鼠(體重為150～180 g)購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0005，實驗動物使用許可證號：SYXK(青)2012-0003。適應性喂養1 w后行鞘內置管并隨機分為對照組、APL高劑量(APL-H)組、中劑量(APL-M)組及低劑量(APL-L)組，每組10只。APL-L、APL-M及APL-H組分別接受鞘內注射10 μl含APL 0.05、0.5、5 μg的MES緩沖液，對照組鞘內注射等體積的MES緩沖液，1次/d，連續5 d。本實驗所用大鼠鞘內置管及后續行為學檢測期間均飼養于SPF級實驗動物房，日光燈明暗交替12 h，室溫22℃～25℃，濕度40%～70%。

1.3鞘內置管 經腹腔注射水合氯醛麻醉后，以L5棘突水平為切口中心行背部正中切口，逐層分離直至暴露出L5椎板，將部分棘突鉗除以暴露L5～L6間隙，采用8號針頭刺破椎間隙的脊髓和韌帶，輕柔地插入PE-10導管，當插管深度為1.5～2.0 cm時經皮下隧道固定于頸部，采用10 μl生理鹽水沖管后封管。術后將每只大鼠進行單籠飼養，于術后6 d經導管注射利多卡因，以出現雙后肢麻痹為置管成功。

1.4熱刺激檢測縮足反應潛伏期(PWTL) 各組均在鞘內給藥前(d0)和給藥后第6(d6)、7(d7)、8(d8)天皮下注射10 mg/kg嗎啡，測定各組的右后爪的PWTL：將大鼠置于玻璃板(厚度為3 mm)上至少適應30 min后采用熱痛刺激儀光源，焦距通過玻璃板照射動物后肢足底掌心，以開始照射至出現后肢回縮反應的時間為PWTL。為避免損傷，每次照射時間控制在20 s以內。根據嗎啡處理前及處理后30 min的PWTL數值計算最大可能鎮痛效應百分比(MPE)，公式：MPE=(鎮痛閾值-基礎閾值)/(最長照射時間-基礎閾值)。

1.5甩尾潛伏期(TFL)檢測 各組均在d0和d6、d7、d8天皮下注射10 mg/kg嗎啡，測定各組的TFL：將大鼠固定于鼠籠，將尾部約3 cm浸入52℃熱水中，以浸入水中至甩出睡眠的時間為TFL。

1.6Western印跡檢測 于第8天行為學測試結束后處死大鼠，取出脊髓腰膨大處，研磨后加入裂解液裂解，12 000 r/min離心15 min后取上清，采用BCA法檢測蛋白濃度。每個樣本取20 μg上樣，經10% SDS-PAGE分離及半干轉后，根據膜面積加入適量p-p38 MAPK和p-ERK一抗，4℃孵育過夜，次日加入二抗，經ECL化學發光法顯色，采用IPP軟件計算各條帶的光密度，最終結果表示為目的條帶與內參GAPDH的比值。

1.7統計學處理 采用SPSS20.0軟件，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。

2 結 果

2.1APL處理對基礎PWTL的影響 對照組及APL處理組d0時PWTL水平的差異無統計學意義(P>0.05)；對照組和APL-L組各時間點PWTL水平的差異亦無統計學意義(P>0.05)；APL-M組和APL-H組d6～d8時的PWTL水平均高于d0，且APL-M組和APL-H組d6～d8時的PWTL水平均高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 APL處理前后的基礎PWTL比較

與d0比較：1)P<0.05；與對照組比較：2)P<0.05；下表同

2.2APL處理對MPE的影響 對照組及APL處理組d0時MPE水平的差異無統計學意義(P>0.05)；對照組和APL-L組各時間點MPE水平的差異亦無統計學意義(P>0.05)；APL-M組和APL-H組d6～d8時的MPE水平均高于d0，且APL-M組和APL-H組d6～d8時的MPE水平均高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 APL處理前后的MPE比較

2.3APL處理對基礎TFL的影響 對照組及APL處理組d0時TFL水平的差異無統計學意義(P>0.05)；對照組和APL-L組各時間點TFL水平的差異亦無統計學意義(P>0.05)；APL-M組和APL-H組d6～d8時的TFL水平均高于d0，且APL-M組和APL-H組d6～d8時的TFL水平均高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 APL處理前后的基礎TFL比較

2.4APL處理對p-p38 MAPK和p-ERK水平的影響 對照組和APL-L組p-p38 MAPK和p-ERK水平的差異亦無統計學意義(P>0.05)；APL-M組和APL-H組的p-p38 MAPK和p-ERK水平均低于對照組和APL-L組，且APL-H組的兩蛋白水平均低于APL-L組和APL-M組(P<0.05)。見表4，圖1。

表4 APL處理前后p-p38 MAPK和p-ERK水平比較

與對照組比較：1)P<0.05

A～D：對照組，APL-L組，APL-M組，APL-H組圖1 各組p-p38 MAPK和p-ERK表達的免疫組化圖

3 討 論

嗎啡等阿片類藥物是臨床常用的麻醉性鎮痛藥物，長期使用可導致耐藥，常見表現為痛覺過敏、起效時間縮短及鎮痛效能下降〔8〕，不僅影響了阿片類藥物的應用，而且增加了患者的身心負擔〔9〕。阿片受體在痛覺傳導的調節中起著重要的作用，新近研究發現Apelin對阿片信號通路有潛在的影響〔10〕。Befort 等〔11〕的研究發現嗎啡依賴小鼠下丘腦外側中的 Apelin mRNA水平降低。μ阿片受體激活是導致了Apelin轉錄水平下降，且μ阿片受體也介導了APL的鎮痛作用〔12〕，以上表明APL與μ阿片受體的潛在關系。嗎啡已被廣泛用于治療各種急性疼痛和長期重度慢性疼痛。然而，有些患者仍未能得到很好的保護，由于反復使用后諸如成癮等毒副作用的出現，同時耐受的產生直接導致療效下降。為提高嗎啡的鎮痛作用，臨床上常嘗試聯合另一種具有鎮痛作用的藥物〔13〕。

本研究提示APL在一定濃度下可增強嗎啡的鎮痛效能，有助于對改善嗎啡耐受。本研究的另一個發現為APL本身具有較好的鎮痛作用。此外，APL對增強嗎啡鎮痛作用的效果確切。本研究從另一個方面也表明APL對μ阿片受體參與的信號通路有一定的潛在影響，提示APL可能對包括嗎啡在內阿片類藥物均有較好的鎮痛增強效果。

絲裂原激活的蛋白激酶包括p38 MAPK及ERK等多個成員，p38 MAPK與神經病理性疼痛密切相關，如周圍神經性疼痛時脊髓中的p38 MAPK表達顯著升高〔14〕，且抑制p38 MAPK活化可減輕機械痛敏和熱痛敏癥狀。p38 MAPK及ERK激活在嗎啡耐受時發揮了重要作用，如鞘內持續注射p38 MAPK抑制劑可促進嗎啡耐受的形成〔15〕，而嗎啡耐受大鼠多個腦區和脊髓中ERK激活〔16〕。本研究結果顯示0.5、5 μg APL處理可降低大鼠的p-p38 MAPK和p-ERK水平，且隨著劑量的升高，兩蛋白磷酸化水平越低，表明APL可限制p38 MAPK和ERK的活化，可能為其發揮鎮痛效能的方式之一。

1譚麗艷,齊亞靈,李洪源,等.初診老年肥胖2型糖尿病患者血清nesfatin-1及apelin水平與胰島素抵抗的關系〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(8):2034-5.

2李 衛,周筱筠,盧先州,等.重癥急性胰腺炎大鼠血清Apelin、C反應蛋白及腫瘤壞死因子-α水平變化及臨床意義〔J〕.中國老年學雜志,2016;36(9):2080-2.

3Kumar P,Ashokan A,Aradhyam GK.Apelin binding to human APJ receptor leads to biased signaling〔J〕.Biochim Biophys Acta,2016;1864(12):1748-56.

4Salska A,Chizynski K.Apelin-a potential target in the diagnosis and treatment of the diseases of civilization〔J〕.Acta Cardiol,2016;71(5):505-17.

5Turtay MG,Karabas M,Parlakpinar H,etal.The analgesic effect of apelin-13 and its mechanism of action within the nitric oxide and serotonin pathways〔J〕.Hippokratia,2015;19(4):319-23.

6Canpolat S,Ozcan M,Saral S,etal.Effects of apelin-13 in mice model of experimental pain and peripheral nociceptive signaling in rat sensory neurons〔J〕.J Recept Signal Transduct Res,2016;36(3):243-7.

7李永樂,謝軍明,舒銀銀,等.瑞舒伐他汀部分恢復嗎啡耐受大鼠的嗎啡鎮痛效能〔J〕.中國藥理學通報,2013;29(1):64-8.

8Zhao J,Wang H,Song T,etal.Thalidomide promotes morphine efficacy and prevents morphine-induced tolerance in rats with diabetic neuropathy〔J〕.Neurochem Res,2016;41(12):3171-80.

9Ahmadi S,Rafieenia F,Rostamzadeh J.Morphine-induced analgesic tolerance effect on gene expression of the NMDA receptor subunit 1 in rat striatum and prefrontal cortex〔J〕.Basic Clin Neurosci,2016;7(3):241-8.

10Xu N,Wang H,Fan L,etal.Supraspinal administration of apelin-13 induces antinociception via the opioid receptor in mice〔J〕.Peptides,2009;30(6):1153-7.

11Befort K,Filliol D,Darcq E,etal.Gene expression is altered in the lateral hypothalamus upon activation of the mu opioid receptor〔J〕.Ann N Y Acad Sci,2008;1129:175-84.

12Yang YJ,Lv SY,Xiu MH,etal.Intracerebroventricular administration of apelin-13 inhibits distal colonic transit in mice〔J〕.Peptides,2010;31(12):2241-6.

13Lazarus LH,Okada Y.Engineering endomorphin drugs:state of the art〔J〕.Exp Opin Ther Pat,2012;22(1):1-14.

14Chen NF,Chen WF,Sung CS,etal.Contributions of p38 and ERK to the antinociceptive effects of TGF-β1 in chronic constriction injury-induced neuropathic rats〔J〕.J Headache Pain,2016;17(1):72.

15王 芬,謝 滔,江姿潞,等.鞘內注射重組大鼠脂質運載蛋白-2對大鼠嗎啡鎮痛效能的影響〔J〕.臨床麻醉學雜志,2015;31(9):896-900.

16Wang Z,Ma W,Chabot JG,etal.Cell-type specific activation of p38 and ERK mediates calcitonin gene-related peptide involvement intolerance to morphine-induced analgesia〔J〕.FASEB J,2009;23(8):2576-86.

青海省重大科技專項(2016-SF-A5)

樊海寧(1970-)，男，教授，博士生導師，主要從事肝膽胰疾病的臨床與基礎研究。

郭延洪(1982-)，男，主治醫師，主要從事臨床麻醉研究。

R614

A

1005-9202(2017)20-4966-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.005

〔2017-02-15修回〕

(編輯 徐 杰)