病證結合帕金森病小鼠模型的構建

梁建慶 何建成

(甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000)

1 上海中醫藥大學基礎醫學院

病證結合帕金森病小鼠模型的構建

梁建慶 何建成1

(甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000)

目的建立一種穩定的、可操作性強的病證結合帕金森病(PD)小鼠模型。方法采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)腹腔注射法構建PD動物模型，同時設立正常對照組、復方地黃方組，從病因、癥狀、客觀指標、藥物反證等方面對PD小鼠模型進行綜合判斷，驗證該模型的中醫證候屬性。結果模型組行為學、氧化應激、酪氨羥化酶(TH)mRNA及蛋白等指標與正常對照組差異顯著(P<0.01)。復方地黃方組可明顯改善PD小鼠的主觀癥狀和客觀指標(P<0.01)。結論MPTP腹腔注射法制作的PD模型中醫證候屬性是陰虛動風證。

病證結合；動物模型；帕金森病

在帕金森病(PD)的研究領域，缺乏病證結合動物模型的支撐阻礙了中醫中藥的干預研究。本研究擬構建病證結合小鼠PD模型。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 C57/BL6小鼠，雌性,體重(21.10±2.01)g，共48只，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號碼：SCXK(滬)2008-0016。SPF級飼養。實驗動物共分為正常對照組、模型組、復方地黃方組，每組16只。

1.2藥物和試劑 復方地黃方藥物組成：熟地20 g、白芍30 g、鉤藤15 g、珍珠母15 g，采用水煎法將藥液濃縮至0.59 g(生藥量)/0.4 ml,相當于成人用量的2倍，4℃冰箱保存備用，由上海中醫藥大學中藥制劑實驗室提供。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP，Lot#SLBC4446V)為Sigma公司產品。考馬斯亮藍法蛋白定量測試盒(批號：20140520)、丙二醛(MDA，批號：20140531)、谷胱甘肽(GSH，批號：20140520)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，批號：20140516)、超氧化物歧化酶(SOD，批號：20140518)檢測試劑盒,購自南京建成生物工程研究所。總RNA提取(Trizol，批號：SK1312)、AMV First Strand cDNA合成酶試劑盒(批號：SK2445),購自生工生物工程上海(股份)有限公司。抗酪氨酸羥化酶〔EP1533Y〕抗體(批號：ab75875),購自美國Abcam公司。辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗(批號：HA1001),購自杭州華安生物技術有限公司。

1.3實驗儀器 多功能酶標儀：Biotek Synergy 2，基因有限公司。熒光定量PCR儀：ABI 7500型，美國應用生物系統中國公司。電熱恒溫水浴箱：HHS-1,上海躍進醫療器械廠。高速冷凍離心機：GTR16-2，Beckman公司。化學發光成像系統：FC-M型，美國ProteinSimple。Western電泳儀：043BR41664，美國Bio-Rad公司。脫色搖床：TS-1型，江蘇海門市其林貝爾儀器有限公司。恒溫磁力攪拌器：81-2型，上海司樂儀器有限公司。超細勻漿機：F6/10，Fluko(上海弗魯克流體機械制造有限公司)。移液器：Eppendorf公司。

1.4病證結合模型制備 48只C57/BL6小鼠，其中16只為正常對照組，其余32只參與模型制備，給MPTP 30 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續注射5 d；予正常對照組腹腔注射等量生理鹽水〔1〕。造模共成功32只，采用隨機數字表法將32只小鼠分為模型組、復方地黃方組。復方地黃方組予復方地黃方灌胃(0.2 ml/10 g)；正常對照組、模型組予生理鹽水灌胃(0.2 ml/10 g)。每日1次，連續治療14 d。小鼠在最后一次行為學評價后斷頭處死，在冰上分離左右黑質，-80℃冰箱保存。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.5病證結合動物模型的診斷標準 根據《中醫內科學》中描述的顫震的證候表現及西醫診斷標準確定〔2,3〕。

1.6行為學評價 各組小鼠于實驗前4 d每天進行2次爬桿、懸掛、游泳行為訓練。在給藥期間到處死動物前，每天于注射MPTP后或給藥后2 h，分別進行爬桿、懸掛、游泳的行為檢測，連續19 d，觀察小鼠肢體運動功能的變化〔4,5〕。具體方法及評分標準：①爬桿實驗。制作一個直徑1 cm,長50 cm的鐵桿,纏上紗布以增加摩擦,將桿豎直放置,然后將小鼠頭朝下放置于桿頂,記錄小鼠從桿頂爬至桿底所用的時間。②懸掛實驗。小鼠用兩前爪懸掛在一水平金屬線上(直徑1 mm,距地面30 cm),記錄懸掛時間及動作。兩后爪都抓金屬線3分,一后爪抓2分,兩后爪都不抓1分,30 s內跌落0分,依動作遲緩酌情加減0.5分。③游泳實驗。將受試小鼠放入一個20 cm×30 cm×20 cm 規格的水箱中,水溫32℃～35℃。在受試時間(10 min)內能連續不斷游泳者計3分,大部分時間游泳偶爾漂浮者計2.5分,漂浮占50%以上者計2分,偶爾游泳者計1.5分,偶爾用后肢游動并漂浮在一邊者計1分。

1.7氧化應激 取小鼠黑質,制備腦組織勻漿液，檢測黑質中MDA、GSH、GSH-Px、SOD含量。按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書步驟進行操作。

1.8TH mRNA 取小鼠黑質，提取總RNA，合成cDNA模板，進行熒光定量PCR反應。TH引物序列(Primer Premier 5.0軟件設計)：正向：5'-GGACGGCGACAG AGTCTCAT-3'，反向：5'-AGCTTCCGACGCTGGCGATA-3'，擴增片段為512 bp。引物β-actin:正向：5'-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT-3'，反向：5'-TTGATGTCACGCACGATTTC-3'，擴增片段為217 bp。PCR擴增條件為94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃延伸7 min。相對定量2-△△Ct法分析各樣本目的基因。

1.9TH蛋白 取小鼠黑質，Western印跡法檢測TH蛋白表達。檢測步驟是：蛋白質抽提、BCA法蛋白濃度測定、電泳、半干轉膜、免疫反應、化學發光法顯影，用AlphaView 圖像分析軟件對掃描圖像的目標條帶進行灰度分析，各目的條帶與β-actin的灰度值比值為目的蛋白的相對表達量。

1.10統計學方法 用SPSS18.0軟件進行t檢驗、方差分析及χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組行為學變化 與正常對照組比較，模型組出現不同程度的肢體運動協調能力下降，爬桿、懸掛及游泳實驗指標均存在顯著差異(P<0.01)；與模型組比較復方地黃方組，可明顯改善各指標(P<0.01)。見表1。

表1 各組行為學變化

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，下表同

2.2各組氧化應激指標變化 與正常對照組比較，模型組MDA明顯升高，GSH、GSH-Px、SOD明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，復方地黃方組MDA、GSH、GSH-Px、SOD均顯著改善(P<0.01)。見表2。

表2 各組氧化應激指標、TH mRNA及蛋白變化

2.3各組TH mRNA及蛋白變化 與正常對照組相比，模型組TH mRNA及蛋白明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，復方地黃方組可明顯改善TH mRNA及蛋白的表達(P<0.01)。見表2。

2.4各組TH 蛋白變化 與正常對照組相比，模型組TH 蛋白明顯下降(P<0.01)；復方地黃方組與模型組比較可明顯改善TH 蛋白的表達(P<0.01)，見表2，圖1。

圖1 各組黑質TH蛋白Western印跡

3 討 論

1983年，Langston報道了人類因一種不完全合成的海洛因中毒后，產生了嚴重的PD臨床表現。后來研究者證明這種藥物的化學成分是MPTP。1986年Bankiewicz等給猴一側頸動脈內注入MPTP，只摧毀同側半球的黑質，研發出了一種半側PD動物模型，每只模型猴都有一個作為對照的未損傷半球和一個同體的用來測試的損傷半球，實現在一只猴子身上既能測試，又有對照〔6〕。這個模型對PD的實驗研究極為有用。現已證實MPTP是一種針對多巴胺(DA)能神經元的神經毒素，對MPTP敏感的動物除靈長類外,嚙齒類特別是某些種屬的小鼠,如C57BL/6,能夠復制出大部分PD生化及病理損害特征,至今仍是PD研究的首選動物模型之一。MPTP有高度的脂溶性，容易透過血腦屏障，進入腦組織后被膠質細胞中的酸性細胞器捕獲,在單胺氧化酶(MAO)-B作用下轉化為離子化的甲基-苯基-雙氫吡啶(MPDP)，進一步轉化為甲基-苯基吡啶離子(MPP+),由DA轉運體載入DA能神經元胞體內，再進入線粒體，抑制線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ的活性，使三磷酸腺苷(ATP)合成減少，自由基生成增加，使細胞內乳酸堆積、Ca2+平衡紊亂、一氧化氮(NO)合成增加、GSH合成減少，這些因素均可增加自由基的大量生成，削弱細胞對自由基損傷的抵抗能力，最終導致DA能神經元變性死亡〔7〕。

按照病證結合動物模型的診斷標準，對照模型組小鼠的臨床癥狀，我們可以推斷PD模型小鼠的證候屬性。每次給小鼠腹腔注射MPTP后數分鐘至半小時，可出現全身抖動、肌肉震顫、豎毛、豎尾征(即尾巴強直上翹)、牙齒顫動、煩躁亂動等癥狀，類似PD患者震顫、肌強直等癥狀，西醫理論認為此種震顫可能與基底節功能受損有關。客觀指標,小鼠毛發干枯，大便干燥呈顆粒狀，小便量少色黃，顯微舌象是紅舌。平均每只小鼠飲水量10 ml/24 h。綜合癥狀體征，中醫解釋為藥邪(MPTP)內侵，斫傷肝腎陰液，繼發水虧火旺，陰不斂陽，筋膜失養，虛風內動，證明該模型的證候屬性是陰虛動風證，相當于西醫的PD。

研究證明，DA能神經元含有神經遞質DA，DA在代謝過程中會產生氧自由基(OFR)，容易使DA能神經元處于氧化應激狀態，極易產生氧化損傷〔8〕。TH是DA合成的限速酶，TH蛋白由兩部分構成，N端為調節區域，C端為催化活性區，其所有的活性催化殘基都位于其C-端的330個氨基酸中〔9〕。如前所述，TH在DA的合成調節中發揮著重要作用。在人體內，一部分DA存在于黑質紋狀體系統中，當TH的質或量發生變化都會干擾L-DOPA的生物合成，導致PD的發生〔10〕。這就表明，PD患者處于氧化應激狀態，TH表達量顯著減少為該病的顯著特征。

復方地黃方由熟地黃、白芍、鉤藤、珍珠母組成，方中熟地性溫味甘，歸肝腎經，善補益腎精、滋陰養血、固本培元，故為君藥。白芍性味苦酸微寒，歸肝脾經，養肝血、滋肝陰、柔肝氣，為養血濡筋、緩急止顫之良藥，為臣藥。鉤藤甘涼，入肝心經，功效熄風定驚，為佐藥。珍珠母性味咸寒，歸肝心經，可滋陰潛陽、定驚止顫、養血舒筋，柔肝與熄風兩者兼顧，滋陰與養血并療，乃平肝潛陽之要藥，為使藥。上述諸藥合用，可補益肝腎、滋陰熄風。根據“方證相應，以方測證”的理論，復方地黃方的適應證應是陰虛動風證。藥物反證,復方地黃方灌胃后PD小鼠的臨床癥狀及客觀指標明顯改善。以方測證，MPTP小鼠PD模型的中醫證候屬性是陰虛動風證。

上世紀60年代鄺安堃教授發現過量腎上腺皮質激素可誘發小鼠呈現類似中醫陽虛癥狀以來，證候動物模型的探索已逾50年〔11〕。本文所建病證結合動物模型具有疾病和證候的雙重特征，為PD動物模型首次提供了證候物質基礎。通過以方測證，進一步證實該模型的合理性，填補了這一研究領域的空白。

1梁建慶.陰虛動風證帕金森病模型鼠神經營養因子與神經遞質表達的變化及復方地黃制劑的干預作用〔D〕.上海:上海中醫藥大學基礎醫學院,2015.

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5Mori A,Ohashi S,Nakai M,etal.Neural mechanisms underlying motor dysfunction as detected by the tail suspension test in MPTP-treated C57BL/6 mice〔J〕.Neurosci Res,2005；51(3):265.

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11魏 盛,孫 鵬,張惠云.證候動物模型質量考核的思路與方法〔J〕.中華中醫藥雜志,2012;27(10):2607-10.

EstablishmentofamicemodelofParkinson'sdiseasewithcombinationofdiseaseandsyndromeforpreliminarystudy

LIANGJian-Qing,HEJian-Cheng.

SchoolofBasicMedicine,GansuUniversityofTCM，Lanzhou730000,Gansu,China

ObjectiveTo establish of a steady and simplify operation mice model of Parkinson's disease(PD) with combination of disease and syndrome,in order to meet the demand of study medication on treatment of PD evaluation.MethodsThe animal model of PD had been induced by intraperitoneal injection of MPTP.At the same time normal control,compound rehmannia prescription groups were set up to estimate PD model from the etiology,symptoms,objective index,drugs prove therapy,in order to investigate the syndrome properties of this mice model.ResultsThere were statistically significant differences in behavior,oxidative stress,TH mRNA and protein between model and normal control groups(P<0.01).Compound rehmannia prescription group could significantly improve the subjective symptoms and objective indexes(P<0.01).ConclusionsThe syndrome property of PD mice model induced by intraperitoneal injection of MPTP is mainly Yin Xu Dong Feng Zheng.

The combination of disease and syndrome；Animal model；Parkinson's disease

國家自然科學基金(No.81573899,No.81670767)；上海市科委新藥開發研究項目(No.12401900302)；甘肅中醫藥大學中青年科研基金(No.ZQ2015-17)；敦煌醫學與轉化省部共建教育部重點實驗室開放課題(No.DHYX151608)

何建成(1966-)，男，教授，博士生導師，主要從事中藥治療帕金森病研究。

梁建慶(1976-)，男，副教授，在讀博士后，主要從事中醫證候動物模型研究。

R742

A

1005-9202(2017)20-4961-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.003

〔2016-11-17修回〕

(編輯 曹夢園)