不同細菌所致小鼠血流感染模型中MIP-1β、MIP-2和IL-12p70的表達及變化規律

楊 明，麻雅婷，何 賞，段欣欣，王佳楠，荊 穎，張可昕，王成彬

(1 解放軍總醫院，北京 100853； 2 溫州醫科大學檢驗醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

2017-03-30

國家重大科學儀器專項項目任務(2012YQ18011708)

楊明(1990-)，男(漢族)，湖南省益陽市人，碩士研究生，主要從事細菌性血流感染的早期診斷研究。

王成彬 E-mail：wangcb301@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.11.001

·論著·

不同細菌所致小鼠血流感染模型中MIP-1β、MIP-2和IL-12p70的表達及變化規律

楊 明1,2，麻雅婷1,2，何 賞1，段欣欣1，王佳楠1，荊 穎1，張可昕1,2，王成彬1,2

(1 解放軍總醫院，北京 100853； 2 溫州醫科大學檢驗醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

目的探討4種血流感染常見細菌致小鼠血流感染后MIP-1β、MIP-2和IL-12p70的表達及變化規律。方法建立金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌CD-1(ICR)小鼠血流感染模型，采用Luminex液相芯片系統檢測各實驗組和PBS對照組小鼠感染后0.5、1、3、6、12、24和48 h MIP-1β、MIP-2和IL-12p70的含量。結果MIP-1β的濃度在細菌入血后1 h時明顯升高，金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌組和對照組濃度分別為(134.5±18.3)、(61.5±15.4)、(3 354.0±809.0)、(6 888.4±1 100.2)和(28.9±4.6)pg/mL；IL-12p70達峰值時的濃度分別為(389.3±118.1)、(127.6 ±10.0)、(42.2±3.5)、(62.8±8.4)和(4.8±0.3)pg/mL。MIP-1β、MIP-2的濃度在大腸埃希菌組和肺炎克雷伯菌組高于其他實驗組和對照組(均P<0.01)，而IL-12p70的濃度在金黃色葡萄球菌組和糞腸球菌組中高于大腸埃希菌組、肺炎克雷伯菌組和對照組(均P<0.01)。結論大腸埃希菌組和肺炎克雷伯菌組MIP-1β和MIP-2的濃度高于金黃色葡萄球菌組和糞腸球菌組，而金黃色葡萄球菌組和糞腸球菌組IL-12p70的濃度高于大腸埃希菌組和肺炎克雷伯菌組。聯合檢測多種細胞因子或趨化因子在預測革蘭陽性或革蘭陰性菌感染方面有一定價值，且可能為感染早期指導治療提供依據。

血流感染； MIP-1β； MIP-2； 小鼠模型； IL-12p70

[Chin J Infect Control，2017，16(11)：993-998]

血流感染是指病原體侵入血液循環后持續存在，迅速繁殖，引起機體出現寒戰、高熱、皮疹及肝脾大等全身癥狀，預后差，是醫院內常見的感染性疾病之一[1]。其病原體主要包括細菌和真菌等，以細菌性血流感染為主[2-3]。近年來，由于抗菌藥物的濫用，血管內導管的不合理應用和大量侵入性診療技術的開展，細菌性血流感染發病率逐年升高，病情發展迅速，病死率高達30%[4-5]。因此，血流感染的早期診斷和治療尤為重要。現今，血培養是診斷細菌性血流感染的金標準[6]，但需時長、陽性率低，致使大部分患者得不到及時的診斷和治療。除血培養外，血流感染分子診斷方法有實時熒光定量PCR(real-time PCR)、PCR+測序、肽核酸+熒光原位雜交(PNA+FISH)等[7]，但操作復雜、耗時長，給細菌性血流感染的早期診斷帶來困難。細菌感染機體后會促使機體免疫細胞產生一系列的細胞因子、趨化因子和急性時相反應蛋白等血清標志物，如巨噬細胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)、巨噬細胞炎性蛋白-2(MIP-2)，IL-12p70、CRP和PCT等[8]，C反應蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)現已在臨床廣泛使用，但其濃度上升時間較細胞因子晚，特異性差，不能區分革蘭陰性和革蘭陽性菌感染[9]。MIP-1β和MIP-2均屬于趨化因子，當機體受到細菌感染后，MIP-1β和MIP-2能夠趨化單核細胞到達炎癥部位，引起炎細胞的浸潤從而發揮抗炎效應。IL-12p70是一種細胞因子，是由p35和p40兩個亞基通過二硫鍵連接而成，主要由樹突狀細胞、單核巨噬細胞及其他的抗原提呈細胞產生，能促進 CD4+T 輔助細胞(Th1)的增殖和分化，在細菌感染后免疫中起重要作用[10]。關于MIP-1β、MIP-2和IL-12p70在細菌進入血液后，免疫過程中的變化及不同病原菌感染后的差異鮮有報道。本研究以小鼠血流感染模型為基礎，前期工作中建立了單病原菌小鼠血流感染模型并進行了相關評價[11-12]，然后采用Luminex液相懸浮芯片系統同時檢測小鼠血流感染后不同時間段MIP-1β、MIP-2和IL-12p70在金黃色葡萄球菌組、糞腸球菌組、大腸埃希菌組和肺炎克雷伯菌組血清中的濃度，探討MIP-1β、MIP-2和IL-12p70在不同菌感染早期的變化規律及在區分革蘭陽性菌和革蘭陰性菌感染中的價值，為細菌性血流感染的早期診斷和不同菌所致血流感染的鑒別診斷提供輔助依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 SPF級CD-1(ICR)雄性小鼠，購自維通利華(北京)實驗動物科技有限公司[SCXK (京) 2016-0011)]，體重25～27 g。小鼠飼養溫度18℃～25℃，濕度50%～70%，動物在實驗前適應環境1周。

1.2 實驗菌株 金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 25923、大腸埃希菌標準菌株ATCC 25922和糞腸球菌標準菌株ATCC 29212由解放軍302醫院檢驗科惠贈。肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC 700603由解放軍總醫院微生物科惠贈。

1.4 小鼠模型的建立 將175只小鼠隨機分為金黃色葡萄球菌組、糞腸球菌組、大腸埃希菌組、肺炎克雷伯菌組和無菌PBS對照組，每個組分別按標本收集時間不同分為7組，每組5只。通過前期大量摸索實驗條件，各實驗組將細菌均以1/2致死量(LD50)濃度經小鼠尾靜脈注射至小鼠體內，注射劑量為0.1 mL/10 g，對照組尾靜脈注射相應劑量無菌PBS溶液。按感染時間不同分別于感染后0.5、1、3、6、12、24和48 h處死小鼠，收集小鼠血液。

1.5 標本的收集和處理 小鼠眼球取血法收集小鼠全血置于普通EP管中，5 000 r/min，離心20 min后分裝血清，保存于-80℃待檢。

1.7 統計學分析 應用SPSS 17.0軟件進行數據分析，數據服從正態分布，以均值±標準差表示，兩組間數據比較用t檢驗，多組間數據比較用ANOVA，P≤0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 LD50的測定 經過前期的實驗摸索，得出金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的LD50分別約為8.1×108/mL、9.6×108/mL、8.1×108/mL和1.1×109/mL。

2.2 MIP-1β濃度的檢測 金黃色葡萄球菌組小鼠感染后1 h MIP-1β的濃度明顯升高，高于對照組(P<0.01)，感染后6 h達最大值。糞腸球菌組和金黃色葡萄球菌組感染相似，感染后3 h MIP-1β的濃度明顯升高且達峰值。大腸埃希菌組和肺炎克雷伯菌組MIP-1β的濃度在感染后0.5 h即高于對照組(均P<0.01)，且上升的速度和幅度快于金黃色葡萄球菌組和糞腸球菌組，在細菌感染后1 h時大腸埃希菌組和肺炎克雷伯菌組MIP-1β的濃度高于金黃色葡萄球菌組和糞腸球菌組(均P<0.05)。對照組小鼠MIP-1β的濃度在此過程中無明顯變化。見表1。

2.3 MIP-2濃度的檢測 小鼠感染金黃色葡萄球菌后的前12 h內 MIP-2的濃度逐漸上升，12 h時達峰值[(258.8±34.7)pg/mL]，此時高于對照組(P<0.01)。小鼠感染糞腸球菌后與感染金黃色葡萄球菌后相似，12 h達峰值[(437.5±67.4)pg/mL]。大腸埃希菌組或肺炎克雷伯菌組，感染后1～3 h即達峰值，達峰值時濃度分別為(2 080.0±234.2)、(5 471.2±1 147.6) pg/mL，高于金黃色葡萄球菌或糞腸球菌的峰值濃度(均P<0.01)。各組菌感染后2 d，小鼠MIP-2的濃度降至正常水平。見表2。

表1 實驗組和對照組在感染后不同時間段MIP-1β的濃度

*：跟對照組相比，P<0.01

表2 實驗組和對照組在感染后不同時間段MIP-2的濃度

*：跟對照組相比，P<0.01

2.4 IL-12p70濃度的檢測 金黃色葡萄球菌組小鼠IL-12p70的濃度在細菌感染后3 h高于對照組(P<0.05)，感染后6 h達最大值[(389.3±118.1)pg/mL]。糞腸球菌組IL-12p70濃度在感染后3 h高于對照組(P<0.01)，12 h時達最大值[(127.6±10.0)pg/mL]。大腸埃希菌組和肺炎克雷伯菌組小鼠IL-12p70的濃度于感染后1 h開始升高(P<0.05)，感染后3 h達峰值，濃度分別為(42.2±3.5)、(62.8±8.4) pg/mL，升高的幅度低于金黃色葡萄球菌組和糞腸球菌組。對照組IL-12p70的濃度在此過程中無明顯變化。見表3。

2.5 細菌感染后小鼠細胞因子的變化規律 各實驗組細菌感染小鼠后1 h MIP-1β的濃度即明顯升高(見圖1A)，與對照組比較差異有統計學意義(均P<0.05)；在感染早期，2種革蘭陰性(G-)菌組小鼠MIP-1β的濃度較2種革蘭陽性(G+)菌組升高快且明顯。MIP-2的變化規律與MIP-1β相似，感染后1 h時在2種G-菌組小鼠明顯升高(見圖1E)，G+菌組小鼠濃度上升較G-菌組慢。而IL-12p70的濃度在細菌感染1 h時稍升高(見圖1I、1J)，感染6 h時，2種G+菌組小鼠IL-12p70的濃度高于2種G-菌組(見圖1K、1L)。見圖1。

表3 實驗組和對照組在感染后不同時間段IL-12p70的濃度

*：跟對照組相比，P<0.01; #：跟對照組相比，P<0.05

注：橫坐標1—5分別表示金黃色葡萄球菌組、糞腸球菌組、大腸埃希菌組、肺炎克雷伯菌組和無菌PBS對照組。A—D分別表示細菌感染小鼠后1、3、6和12 h 各實驗組和對照組MIP-1β的濃度；E—H分別表示細菌感染小鼠后1、3、6和12 h 各實驗組和對照組MIP-2的濃度；I—L分別表示細菌感染小鼠后1、3、6和12 h 各實驗組和對照組IL-12p70的濃度；#：跟對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)

圖1細菌感染后小鼠血清中MIP-1β、MIP-2和IL-12p70的濃度隨時間變化規律

Figure1Variations of concentrations of MIP-1β, MIP-2, and IL-12p70 in serum of mice infected with bacteria at different time

3 討論

多種原因，如抗生素和血管內導管的不合理使用，大量侵入性診療技術的開展等，使血流感染的發病率逐年上升。現有的血流感染早期快速診斷方法少，主要依賴血培養結果，血培養需時長、陽性率低，不能在血流感染早期提供充足的診斷依據。以往的研究結果顯示，細菌入血后刺激機體產生的細胞因子和趨化因子等血清標志物在輔助診斷血流感染方面具有重要的作用[13-14]。因此，細菌感染尤其是感染早期刺激機體產生的血清標志物有望早期輔助或鑒別診斷病原菌。

不同細菌引起機體產生的免疫反應過程不盡相同。根據細菌在機體內定植部位的不同，可分為胞內菌免疫和胞外菌免疫。且G+菌和G-菌由于其自身結構的不同，促使機體產生的免疫反應過程也不盡相同。本研究以小鼠為實驗模型，通過前期大量的實驗摸索，成功建立了金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌4種血流感染常見菌的單一菌感染小鼠血流感染模型[15-16]，并利用Luminex液相芯片篩查血流感染早期標志物和不同菌感染后的差異標志物，以期發現血流感染早期不同細菌感染的差異性標志物，為細菌性血流感染的早期診斷提供輔助依據，為后續的臨床驗證提供研究基礎。

MIP-1β和MIP-2均屬于趨化因子家族，當機體局部有炎癥時，MIP-1β和MIP-2等趨化因子能夠趨化單核細胞向炎癥部位聚集，從而發揮其抗炎效應。以往關于MIP-1α的研究報道較多，鮮有關于MIP-1β和MIP-2在細菌性血流感染中的相關研究報道。本研究主要探討在不同細菌入血后MIP-1β和MIP-2隨時間變化的規律，結果表明細菌入血1 h時各實驗組MIP-1β的濃度跟對照組相比明顯升高，細菌入血后3 h內，實驗組中大腸埃希菌組和肺炎克雷伯菌組MIP-1β的濃度高于金黃色葡萄球菌組和糞腸球菌組,與徐舒敏等[16]的研究結果相似。細菌入血后早期階段MIP-1β的濃度升高提示可能為細菌感染，MIP-1β的濃度升高越明顯，越有可能為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌等G-菌感染，否則G+菌感染的可能性較大。

各實驗組和對照組小鼠IL-12p70濃度隨時間變化結果表明，當金黃色葡萄球菌或糞腸球菌進入小鼠血液后，前1 h IL-12p70的濃度跟對照組相比無明顯變化；隨著感染時間的增加，IL-12p70的濃度均逐漸上升；細菌感染6 h時，IL-12p70的濃度明顯升高(P<0.01)，為對照組的40～100倍；感染后1 d 兩組小鼠IL-12p70濃度均處于較高水平。當小鼠感染大腸埃希菌或肺炎克雷伯菌1 h后, IL-12p70的濃度升高，跟對照組相比，差異有統計學意義(均P<0.05)。大腸埃希菌組或肺炎克雷伯菌組小鼠IL-12p70達峰值時，其濃度約為對照組的10倍。隨著感染時間的增加，其濃度先增加后下降，感染2 d時，IL-12p70的濃度跟對照組相比無明顯差異。

綜上所述，血流感染發病率居高不下，且血培養不能在感染早期提供有效的診斷依據來指導臨床早期決策和治療。細胞因子和趨化因子在細菌性血流感染早期輔助和鑒別診斷病原菌方面有廣泛的應用前景。但單個時間點或單個生物標志物指標結果對細菌性血流感染的輔助診斷作用較小，加之每種細菌感染小鼠后促使小鼠產生的免疫反應不盡相同，提示我們聯合多種細胞因子和多時間點檢測有助于預測是否為細菌性血流感染或為哪類細菌感染。結合本實驗研究結果提示，若小鼠有立毛、發熱等感染征象，且IL-12p70升高不明顯，但MIP-1β和MIP-2的濃度在感染早期即明顯升高，提示可能為G-菌感染。若有感染癥狀且IL-12p70濃度隨感染時間延長明顯升高，MIP-1β和MIP-2的濃度變化不明顯，則提示可能為G+菌感染。當然，本研究所使用的全部菌株均為標準菌株，同一種細菌的臨床分離菌株和標準菌株的細胞因子譜及濃度是否存在差異，我們也將在后續的研究中進一步進行探討，且將研究更多的細菌性血流感染常見病原菌以探討細菌入血后細胞因子和趨化因子等的變化規律，同期我們也在收集臨床標本進行驗證，以期達到早期輔助診斷和鑒別不同病原血流感染的目的。

[1] 張凱,喻華,黃湘寧,等. 8 548例血流感染病原菌分布及耐藥性分析[J]. 中國執業藥師,2014,11(9):3-8.

[2] 彭敏顏, 吳雪開. 2008—2012年血培養標本中病原菌分布及其耐藥性分析[J]. 現代醫藥衛生,2013,29(12):1789-1790，1792.

[3] 胡付品, 朱德妹, 汪復, 等. 2013年中國CHINET細菌耐藥性監測[J]. 中國感染與化療雜志,2014,14(5):365-374.

[4] 李若倩, 蔣清清, 馬萍, 等. C反應蛋白和中性粒細胞/淋巴細胞比值對血流感染的診斷價值[J]. 檢驗醫學,2016,31(10):902-903.

[5] 吳瓊, 李麗娟, 劉國梁, 等. 中性粒細胞/淋巴細胞比值聯合降鈣素原檢測在血流感染診斷中的價值[J]. 檢驗醫學,2016,31(10):898-901.

[6] 郭建, 吳文娟. 血流感染分子診斷的研究進展[J]. 檢驗醫學,2014,29(6):584-589.

[7] Zhang L, Rickard CM. Non-culture based diagnostics for intravascular catheter related bloodstream infections[J]. Expert Rev Mol Diagn, 2017, 17(2): 181-188.

[8] Tavares E, Maldonado R, Ojeda ML, et al. Circulating inflammatory mediators during start of fever in differential diagnosis of gram-negative and gram-positive infections in leukopenic rats[J]. Clin Diagn Lab Immunol, 2005, 12(9): 1085-1093.

[9] Reinhart K, Meisner M, Brunkhorst FM. Markers for sepsis diagnosis: what is useful?[J]. Crit Care Clin, 2006, 22(3): 503-519.

[10] 陳聰, 劉芳, 張聰, 等. il-12p40、il-12p70在經典型霍奇金淋巴瘤中的表達及意義[J]. 安徽醫科大學學報,2015,50(9):1308-1312.

[11] 謝尹晶, 段晉燕, 張洪瑞, 等. 臨床分離菌株ICR小鼠血流感染模型的建立[J]. 中華醫院感染學雜志,2014,24(3):521-523.

[12] Duan J, Xie Y, Yang J, et al. Variation of circulating inflammatory mediators inStaphylococcusaureusandEscherichiacolibloodstream infection[J]. Med Sci Monit, 2016, 22: 161-171.

[13] Slaats J, Ten Oever J, van de Veerdonk FL, et al. IL-1β/IL-6/CRP and IL-18/ferritin: distinct inflammatory programs in infections[J]. PLoS Pathog, 2016, 12(12): e1005973.

[14] Loonen AJ, de Jager CP, Tosserams J, et al. Biomarkers and molecular analysis to improve bloodstream infection diagnostics in an emergency care unit[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e87315.

[15] 楊明，麻雅婷，何賞，等.經小鼠尾靜脈注射誘導肺炎克雷伯菌血流感染模型的建立及評價[J].中華醫院感染學雜志，2017，27(6)：1206-1210，1214.

[16] 徐舒敏, 謝尹晶, 郭宇妮, 等. MIP-2、MIP-1α和IL-6在小鼠血流感染中的變化規律實驗研究[J]. 北京醫學,2015,37(1):37-40.

ExpressionandvariationofMIP-1β,MIP-2,andIL-12p70inmousemodelswithbloodstreaminfectioncausedbydifferentbacteria

YANGMing1,2,MAYa-ting1,2,HEShang1,DUANXin-xin1,WANGJia-nan1,JINGYing1,ZHANGKe-xin1,2,WANGCheng-bin1,2
(1ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China; 2SchoolofLaboratoryMedicine&LifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China)

ObjectiveTo investigate the expression and variation of MIP-1β, MIP-2, and IL-12p70 in mice with bloodstream infection caused by 4 kinds of bacteria.MethodsCD-1 (ICR) mouse models of bloodstream infection withStaphylococcusaureus(S.aureus),Enterococcusfaecalis(E.faecalis),Escherichiacoli(E.coli), andKlebsiellapneumoniae(K.pneumoniae) were established. After mice in each trial group and PBS control group were infected by bacteria for 0.5h, 1h, 3h, 6h, 12h, 24h, and 48h, concentrations of MIP-1β, MIP-2, and IL-12p70 were detected by Luminex liquid suspension chip system.ResultsConcentrations of MIP-1β increased significantly 1h after bacteria was in blood,S.aureus,E.faecalis,E.coli,K.pneumoniae, and control groups were (134.5±18.3), (61.5±15.4), (3 354.0±809.0), (6 888.4±1 100.2), and (28.9±4.6) pg/mL respectively; the peak values of IL-12p70 were (389.3±118.1), (127.6±10.0), (42.2±3.5), (62.8±8.4), and (4.8±0.3) pg/mL respectively. Concentrations of MIP-1β and MIP-2 inE.coliandK.pneumoniaegroups were significantly higher than other trial groups and control group (allP<0.01), while concentrations of IL-12p70 inS.aureusandE.faecalisgroups were both significantly higher thanE.coli,K.pneumoniae, and control groups (allP<0.01).ConclusionConcentrations of MIP-1β and MIP-2 inE.coliandK.pneumoniaegroups were both significantly higher than those inS.aureusandE.faecalisgroups, while concentrations of IL-12p70 inS.aureusandE.faecalisgroups were both significantly higher than those inE.coliandK.pneumoniaegroups. The combination detection of multiple cytokines or chemokines are valuable in predicting gram-positive or gram-negative bacterial infection, and can provide basis for treatment of early infection.

bloodstream infection; MIP-1β; MIP-2; mouse model; IL-12p70

R446.5

A

1671-9638(2017)11-0993-06

(本文編輯：左雙燕)