帶有小鼠CD40L基因的漢灘病毒糖蛋白表達載體的構建

馮偉，張堯，張曉曉，應旗康，劉梓諭，吳興安，王芳

1.第四軍醫大學 學員旅，陜西 西安 710032；2.第四軍醫大學 微生物學教研室，陜西 西安 710032

帶有小鼠CD40L基因的漢灘病毒糖蛋白表達載體的構建

馮偉1，張堯1，張曉曉2，應旗康2，劉梓諭2，吳興安2，王芳2

1.第四軍醫大學 學員旅，陜西 西安 710032；2.第四軍醫大學 微生物學教研室，陜西 西安 710032

目的：構建漢灘病毒包膜糖蛋白基因的真核表達載體，并加入可增強免疫應答效應的細胞因子CD40L基因，檢測其可否在真核細胞中表達。方法與結果：參照GenBank中漢灘病毒M基因和小鼠CD40L的全基因序列設計引物，通過聚合酶鏈反應（PCR）獲得M和CD40L基因片段，將其與pCI-neo載體相連，測序證實該載體構建成功后，將此真核表達載體以脂質體轉染法轉染至哺乳動物細胞CHO-K1中，利用間接免疫熒光法（IFA）檢測發現M基因和CD40L基因可以同時表達于CHO-K1細胞中。結論：構建了帶有CD40L基因的漢灘病毒包膜糖蛋白重組質粒并獲得表達，為深入研究漢灘病毒感染后包膜糖蛋白引起的特異性免疫應答規律奠定了實驗基礎。

漢灘病毒；包膜糖蛋白；CD40L

漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，為分節段的負鏈RNA病毒，病毒基因組按片段大小分為L、M、S等3個片段，分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-depen?dent RNA polymerase，RdRp）、包膜糖蛋白（glyco?protein，GP）和核衣殼蛋白（nucleoprotein，NP）。GP和NP為結構蛋白，是重要的病毒抗原[1]。GP具有多個中和抗原表位，在機體的保護性體液免疫應答中起主要作用，但其誘導細胞免疫反應的能力較弱；NP具有較強的免疫原性，但其刺激產生中和抗體的能力較弱[2]。

CD40配體（CD40 ligand，CD40L）是常用的免疫刺激分子，其作為佐劑可增強抗原提呈細胞的抗原提呈能力，提高疫苗免疫效果[3]。

我們將漢灘病毒包膜糖蛋白基因與小鼠CD40L基因同時構建入真核表達載體pCI-neo中，并觀察此重組質?？煞裨谡婧思毎斜磉_，從而為進一步的動物免疫奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

哺乳動物細胞CHO-K1、感受態大腸桿菌JM109、含有漢灘病毒76-118株M全長基因序列的質粒pcDNA3.1-M、質粒pCI-neo由本室保存；限制性內切酶、T4DNA連接酶、凝膠回收試劑盒購自大連TaKaRa公司；轉染試劑LipofectAMINE 2000購自Invitrogen公司；抗漢灘病毒GP的特異性抗體由本室制備保存；兔抗小鼠CD40L多克隆抗體購自Abcam公司；FITC標記的羊抗小鼠IgG、Cy3標記的羊抗兔IgG購自康為世紀公司。

1.2 漢灘病毒M基因片段的擴增

參照GenBank中漢灘病毒76-118株M基因核苷酸序列設計并合成1對引物，同時在引物兩端分別加入MluⅠ和 XbaⅠ酶切位點。上游引物為5'-CGACGCGTATGGGGATATGGAAGTGGC-3'，下游引物為5'-GCTCTAGACTATGATTTTTTATGCTT CCTTACGGG-3'。以含有漢灘病毒M基因的質粒pcDNA3.1-M為模板進行PCR擴增（反應條件：95℃ 預 變 性 10min，以 95℃ 30s、54℃ 30s、72℃ 2.5min進行30個循環，72℃延伸10min）。

1.3 CD40L基因片段的擴增

參照GenBank中小鼠CD40L基因序列設計并合成1對引物，在引物兩端分別加入StuⅠ和Csp45Ⅰ酶切位點。上游引物為5'-GAAGGCCTA TGATAGAAACATACAGCCAACCTTCCCCC-3'，下游引物為5'-GGGTTCGAATCAGAGTTTGAGTAAG CCAAAAGATGAGAAG-3'。將CD40L基因從StuⅠ和Csp45Ⅰ兩個位點插入pCI-neo-M載體替換neo基因，確保CD40L基因與M基因在該載體上同時表達。

1.4 pCI-neo-M-CD40L在真核細胞中的表達及鑒定

采用脂質體法將重組質粒于體外轉染至已長至單層的CHO-K1細胞中，轉染后48h取出細胞爬片，沖洗后分別與一抗（抗HTNV GP鼠單克隆抗體，兔抗小鼠CD40L多克隆抗體）及二抗（FITC標記的羊抗小鼠IgG和Cy3標記的羊抗兔IgG）結合，最后與DAPI染液結合（細胞核定位染液），同時設對照組。

2 結果

2.1 重組質粒pCI-neo-M的構建及鑒定

以pcDNA3.1-M質粒為模板擴增M全長基因，純化后的PCR產物與pCI-neo載體相連，挑取陽性克隆提取質粒，經MluⅠ和 XbaⅠ雙酶切后凝膠電泳得到約3400bp的目的片段（圖1），與預期相符，測序證實該載體構建成功。

2.2 重組質粒pCI-M-CD40L的構建及鑒定

圖1 重組質粒pCI-neo-M酶切鑒定結果

從活化的小鼠脾細胞中克隆CD40L基因，純化后的PCR產物與pCI-neo-M載體相連，挑取陽性克隆提取質粒，經StuⅠ和Csp45Ⅰ雙酶切后凝膠電泳得到約783bp的目的片段（圖2），與預期相符，測序證實該載體構建成功。表明構建了帶有小鼠CD40L基因的漢灘病毒糖蛋白真核表達載體（圖3）。

2.3 重組質粒pCI-M-CD40L表達糖蛋白和細胞因子CD40L的檢測

將重組質粒pCI-M-CD40L轉染CHO-K1細胞，48h后用間接免疫熒光法（indirect immuno?fluorescence assay，IFA）檢測目的蛋白的表達，結果如圖4，GP、CD40L均有表達且GP與CD40L可共定位。

圖2 重組質粒pCI-M-CD40L酶切鑒定結果

圖3 重組質粒pCI-M-CD40L構建示意圖

圖4 重組質粒pCI-M-CD40L轉染CHO細胞的間接免疫熒光結果（×400）

3 討論

漢灘病毒在我國主要引起腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS），該病危害極為嚴重，目前尚無特效治療藥物，主要使用疫苗進行預防[4]。

CD40L主要表達于活化的CD4+T細胞表面，而CD40表達于抗原提呈細胞（antigen-presenting cells，ATC）（樹突細胞、B細胞、巨噬細胞等）上。CD40L與CD40的結合，一方面促進APC活化，促進共刺激分子表達和細胞因子的分泌；另一方面，由于APC表達共刺激分子和分泌促進T細胞分化的細胞因子，也促進T細胞的活化，活化的Th細胞表達的CD40L與B細胞表面的CD40結合可促進B細胞的增殖、分化，抗體生成和抗體類別轉換。CD40L已作為一些病毒DNA疫苗的免疫佐劑[5-6]。

漢灘病毒糖蛋白的免疫學特性為其成為漢灘病毒核酸疫苗的候選基因提供了理論依據。因此，我們以pCI-neo為載體構建了含包膜糖蛋白基因的真核表達載體，在該載體中加入了可增強小鼠免疫刺激作用的CD40L基因，從而增強此真核表達載體對動物的免疫效果。實驗結果表明真核表達載體pCI-M-CD40L構建成功，并且漢灘病毒包膜糖蛋白和CD40L可同時在真核細胞中獲得表達，證明了該重組體作為漢灘病毒核酸疫苗的可行性，從而為進一步的動物免疫及漢灘病毒多價核酸疫苗的研制奠定了基礎。

[1] Muyangwa M,Martynova E V,Khaiboullina S F,et al.Hantaviral proteins:structure,functions,and role in Hantavirus infection[J].FrontMicrobiol,2015,6:1326.

[2] Yoshimatsu K,Yoo Y C,Yoshida R,et al.Protective immunity of Hantaan virus nucleocapsid and envelope protein studied using baculovirus-expressed protein[J].Arch Virol,1993,130（3-4）:365-376.

[3] Barr T A,Carlring J,Heath A W.Co-stimulatory ago?nists as immunological adjuvants[J].Vaccine,2006,24（17）:3399-3407.

[4] Jiang H,Du H,Wang L M,et al.Hemorrhagic fever with renal syndrome:pathogenesis and clinical picture[J].Front Cell Infect Microbiol,2016,6:1.

[5] Gupta S,Termini J M,Kanagavelu S,et al.Design of vaccine adjuvants incorporating TNF superfamily li?gands and TNF superfamily molecular mimics[J].Im?munol Res,2013,57（1-3）:303-310.

[6] Kornbluth R S,Stone G W.Immunostimulatory combi?nations:designing the next generation of vaccine adju?vants[J].J Leukoc Biol,2006,80（5）:1084-1102.

CNKI推出《中國高被引圖書年報》

日前，中國知網（CNKI）中國科學文獻計量評價研究中心推出了一套《中國高被引圖書年報》，該報告基于中國大陸建國以來出版的422萬余本圖書被近3年國內期刊、博碩、會議論文的引用頻次，分學科、分時段遴選高被引優秀學術圖書予以發布。據研制方介紹，他們統計并分析了2013-2015年中國學術期刊813萬余篇、中國博碩士學位論文101萬余篇、中國重要會議論文39萬余篇，累計引文達1451萬條。根據統計數據，422萬本圖書至少被引1次的圖書達72萬本。研制方根據中國圖書館分類法，將72萬本圖書劃分為105個學科，分1949-2009年和2010-2014年兩個時間段，分別遴選被引最高的TOP 10％圖書，共計選出70911本優秀圖書收入《中國高被引圖書年報》。統計數據顯示，這7萬本高被引優秀圖書雖然只占全部圖書的1.68％，卻獲得67.4％的總被引頻次，可見這些圖書質量上乘，在同類圖書中發揮了更加重要的作用。該報告還首次發布各學科“學科h指數”排名前20的出版單位的評價指標，對客觀評價出版社的社會效益——特別是學術出版物的社會效益具有重要的參考價值。

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Construction of Hantaan Virus Envelope Glycoprotein Ex?pression Vector Added with Mouse CD40L Gene

FENG Wei1,ZHANG Yao1,ZHANG Xiao-Xiao2,YING Qi-Kang2,LIU Zi-Yu2,WU Xing-An2,WANG Fang2*
1.Cadet,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032;2.Department of Microbiology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032;China
*Corresponding author,E-mail:wangf07@fmmu.edu.cn

Objective:The eukaryotic expression vector of Hantaan virus glycoprotein was constructed and added with mouse CD40L gene that could strengthen mouse immune response,in order to detect whether or not it could express in the eukaryotic cell.Methods&Results:Primers were designed referring to M gene sequence of Hanta?an virus and mouse CD40L gene in the GenBank.Then M gene and mouse CD40L gene were obtained through PCR,and cloned into eukaryotic expressing vector pCI-neo vector.After sequenced,the eukaryotic expressing vec?tor was transfected into eukaryotic cells CHO-K1 with liposome method.It was found that specific fluorescence appeared in the CHO-K1 after transfection by indirect immunofluorescence assay（IFA）.Conclusion:The results showed that the eukaryotic expressing vector of Hantaan virus glycoprotein conjugated with mouse CD40L was suc?cessfully constructed and expressed,to deeply investigate the immune response of Hantaan virus glycoprotein.

Hantaan virus;envelope glycoprotein;CD40 ligand（CD40L）

Q78;R392.1

A

1009-0002（2017）04-0499-04

2017-01-06

國家自然科學基金（31470890，31270978）；軍隊重點課題（BWS13G）；陜西省科技統籌創新工程計劃（2013KTCL03-06）

馮偉（1994- ），男，本科在讀，（E-mail）905597943@qq.com

王芳，（E-mail）wangf07@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.018