光果甘草查爾酮異構酶基因的克隆及序列分析

張曉冬，尹彥超，周姍，馬永生，胡婷，高智強，劉穎

北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 100102

光果甘草查爾酮異構酶基因的克隆及序列分析

張曉冬，尹彥超，周姍，馬永生，胡婷，高智強，劉穎

北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 100102

目的：對光果甘草黃酮代謝途徑中的關鍵酶查爾酮異構酶（CHI）進行基因克隆和序列分析。方法：取新鮮光果甘草主根，立即投入液氮，作為提取RNA的植物材料；用植物RNA提取試劑盒提取光果甘草總RNA，用逆轉錄試劑盒對其逆轉錄得cDNA；根據文獻報道的烏拉爾甘草CHI序列設計特異性引物，擴增光果甘草CHI基因并測序；用生物信息學軟件對所得序列進行分析。結果：擴增得到22條光果甘草CHI基因cDNA序列，其編碼區全長為690bp，編碼229個氨基酸殘基。DNAMAN比對表明22條光果甘草cDNA序列間存在16個變異位點，一致性為99.67％，可分為7種單倍型，其中單倍型1為主流單倍型，所占比重為45.5％；氨基酸序列間存在10個變異位點，一致性為99.38％。生物信息學分析表明光果甘草CHI基因編碼蛋白為穩定性親水蛋白，相對分子質量為24 000，等電點為5.56～6.76，不含信號肽，無跨膜區，保守結構域包含一個查爾酮超家族結構域，二級結構以α螺旋和無規卷曲為主。MEGA 5.0同源性分析顯示光果甘草7種CHI單倍型間親緣關系良好且與同屬植物烏拉爾甘草的進化關系最近，與蕨類植物香鱗毛蕨的進化關系最遠。結論：克隆了光果甘草CHI基因并對其進行了序列分析，為進一步探究CHI基因對甘草苷生物合成的分子調控機制奠定了基礎。

光果甘草；查爾酮異構酶；甘草苷；克隆；生物信息學分析

甘草是我國最常用的大宗藥材之一，素有“國老”、“十方九草”之稱，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛和調和諸藥等作用[1]。光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）為《中國藥典》規定的甘草藥材三基原之一[1]。本課題組前期對全國四大藥材市場中的甘草藥材進行了調查，發現光果甘草占有30％左右的市場份額[2]，因此光果甘草的質量優劣對于保證甘草藥材的藥效及安全用藥具有重要意義。

2015版《中國藥典》明確規定栽培甘草的檢測指標為甘草酸含量不低于2.0％、甘草苷含量不低于0.5％[1]。大量藥理學研究表明，甘草苷具有抗癌[3]、抗糖尿病[4]、抗病毒[5]、抗抑郁[6]等多種藥理活性，是一種極具開發潛力的黃酮類化合物。但本課題組前期研究顯示栽培甘草中甘草苷的含量普遍偏低[7]。因此，對甘草苷生物合成途徑開展相關研究，對于揭示甘草苷生物合成的分子機制，提高栽培甘草的甘草苷含量具有重要意義。

在甘草苷的生物合成途徑中，查爾酮異構酶（chalcone isomerase，CHI，EC5.5.1.6）是最先被認識的類黃酮物質合成相關酶[8]，其催化分子內的環化反應，使雙環的查爾酮轉化為具有生物學活性的三環（2S）-黃烷酮[9]，再進一步反應生成甘草苷，是甘草苷生物合成途徑中的關鍵酶之一。1987年，研究者利用抗體技術首次從法國豌豆（Pisum sativum L.）中分離得到 CHI基因[10]，隨后陸續從矮牽牛（Petunia hybrida Vilmorin.）[11]、菜豆（Phaseolus vulgaris L.）[12]、玉米（Zea mays）[13]等植物中克隆得到該基因。到目前為止，GenBank數據庫中已注冊1164條植物CHI DNA序列及278條cDNA序列。但尚未見光果甘草CHI基因的相關研究報道。本論文是首次對光果甘草CHI基因進行克隆及生物信息學分析的研究報道。這將為進一步探究CHI對甘草苷生物合成的分子調控機制奠定基礎，并為篩選優良基因以及高品質甘草的分子育種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

取2年生新鮮光果甘草主根，迅速置于液氮中凍存備用。大腸桿菌DH5α感受態細胞、pMD-19T載體、ESPY spin植物RNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、DL2000核酸分子質量標準、M-MLV（Rnase H-）等購于北京博邁德生物技術有限公司；LA-Taq DNA聚合酶、oligo（dT）等購于TaKaRa公司。1-13000型離心機（Sigma公司）；TC-3000 PCR擴增儀（Techne公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；BG-gdsAUTO510型凝膠成像系統（上海培清科技有限公司）；酶標儀（Bio-Tek公司）。

1.2 光果甘草RNA提取及逆轉錄

取光果甘草主根，液氮中充分研磨后，采用ESPY spin植物快速提取試劑盒提取總RNA，經1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用酶標儀測定RNA濃度，采用M-MLV反轉錄試劑盒，以oligo（dT）為引物對所提總RNA進行逆轉錄。

1.3 光果甘草CHI擴增及測序

根據文獻報道的烏拉爾甘草CHI基因序列[14]，用Primer Premier 5.0軟件設計上游引物GF（5′-ATGGCGGGAGCAGCACCAGTA-3′）、下游引物 GR（5′-TCAGTTTCCGTTTCCAAT-3′）。 50μL PCR擴增體系包括2.0μL模板 cDNA、2.0μL正向引物（5μmol/L）、2.0μL 反向引物（5μmol/L）、5.0μL 10×緩沖液、5.0μL dNTP（2.5mmol/L）、1.0μL LA-Taq DNA 聚合酶、33.0μL無 RNase的水。PCR 擴增程序：95℃ 2min；95℃ 20s，58℃30s，72℃ 45s（35個循環）；72℃ 5min，4℃保存。1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，采用膠回收試劑盒對PCR產物進行膠回收純化。將膠回收產物與pMD-19T載體連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂于含50 mg/L氨芐西林（Amp）的LB培養基平板上，于37℃倒置培養12h；隨機挑取單克隆，接種于含50 mg/L Amp的LB液體培養基中，于37℃、200r/min條件下培養12h；對菌液進行PCR擴增，1.0％瓊脂糖凝膠電泳驗證，將陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 光果甘草CHI生物信息學分析

用DNAMAN對所得序列進行比對分析；用Editseq將其翻譯成氨基酸序列；用在線工具Prot?Param分析氨基酸序列的理化性質；用DNASTAR 7.0及SOPMA構建及分析其二級結構；用Swiss-Model構建三級結構；用NCBI CDD數據庫預測保守結構域；用SiganalP 4.1 Server預測信號肽；用TMHMM Server 2.0預測跨膜結構域；用MEGA5.0將所得光果甘草CHI與從NCBI數據庫查找的其他物種CHI進行同源比對并構建系統進化樹。

2 結果

2.1 光果甘草CHI的克隆及序列分析

PCR擴增結果如圖1，得到長度約690bp的序列，與目標條帶長度一致，條帶清晰明亮，可用于后續實驗。

共獲得22條光果甘草CHI基因cDNA序列，測序結果顯示編碼區全長690bp。DNAMAN比對分析結果顯示22條cDNA序列中存在16個變異位點，可分為7種單倍型，其一致性為99.67％（表1）。其中單倍型1的序列數量最多，為10條，在全部單倍型數量中占比45.5％，為主流單倍型，其他各單倍型均為2條，占比9.1％。cDNA序列編碼229個氨基酸殘基，氨基酸序列一致性為99.38％，存在10個變異位點（表2）。在GenBank對所得序列進行注冊，序列登錄號列于表3中。

2.2 光果甘草CHI編碼氨基酸序列的理化性質分析

圖1 光果甘草CHI擴增結果

表1 光果甘草CHI基因cDNA序列變異位點統計表

表2 光果甘草CHI氨基酸序列變異位點統計表

用在線工具ProtParam對7種光果甘草CHI基因單倍型編碼氨基酸序列進行分析，結果見表3。7種單倍型編碼氨基酸序列長度均為229個氨基酸殘基，相對分子質量約為24 000；理論等電點為5.56～6.76，單倍型5等電點最大為6.76；半衰期均為30h；不穩定系數為31.91～34.55，均小于40，說明光果甘草CHI為穩定性蛋白，尤以單倍型5的不穩定系數最小，為31.91；總平均親水性為-0.112～-0.047，均為負值且介于-2.0～2.0，說明光果甘草CHI為親水性蛋白。

2.3 光果甘草CHI的二級結構及三級結構預測

根據表3中的統計結果，7種光果甘草CHI基因單倍型編碼氨基酸序列的性質較為接近，因此選取主流單倍型1及變異位點最多的單倍型5為目標序列，用軟件DNASTAR7.0和ExPASy對其二級結構進行分析，結果如圖2。單倍型1編碼氨基酸序列中α螺旋占34.06％，β轉角占11.79％，延長鏈占21.40％，無規卷曲占32.75％；單倍型5中α螺旋占32.75％，β轉角占12.23％，延長鏈占21.40％，無規卷曲占33.62％。說明光果甘草CHI二級結構以α螺旋和無規卷曲為主。用在線軟件Swiss-Model構建光果甘草CHI蛋白的三級結構模型如圖3，單倍型1與單倍型5的三級結構相同，說明不同單倍型光果甘草CHI三級結構無明顯差異。

2.4 光果甘草CHI信號肽、保守結構域及跨膜結構域預測

圖2、3結果顯示光果甘草中不同CHI單倍型編碼氨基酸序列在二級結構及三級結構上均差異較小，因此在后續的信號肽、保守結構域及跨膜結構域預測中僅對主流單倍型，即單倍型1進行相關分析。用在線預測軟件SignalP 4.1 Server進行信號肽預測，結果如圖4，S值較低，說明光果甘草CHI結構中不含信號肽。用NCBI CDD數據庫預測保守結構域，結果如圖5，顯示光果甘草CHI包含一個查爾酮超家族結構域。用TMHMM Server 2.0進行跨膜結構域預測，結果如圖6，顯示該蛋白存在于膜外且無跨膜區。

表3 光果甘草CHI基因編碼氨基酸理化性質分析表

圖2 光果甘草CHI二級結構預測

圖3 光果甘草CHI三級結構預測

2.5 CHI同源性分析

光果甘草為豆科甘草屬植物。按照親緣關系遠近，分別從NCBI數據庫中挑選出21個物種的23條CHI序列，用MEGA 5.0將這23條序列與本研究擴增獲得的7條光果甘草CHI序列一起構建系統進化樹，結果如圖7。所有30條CHI序列聚為3大支，其中蕨類植物香鱗毛蕨（Dryopteris fragrans）單獨聚為一支，與光果甘草進化距離最遠；豆科植物，包括豌豆、綠豆（Vigna radiata）、菜豆、大豆（Glycine max）及烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis），與本研究擴增獲得的7條光果甘草CHI序列聚為一支，且烏拉爾甘草與光果甘草進化距離最近；其余植物聚為一大支，并依分類地位的不同，同科植物聚為相同的小支。

3 討論

甘草素有“國老”之譽，國內外均有需求，由于過度采挖，野生資源日益匱乏，國務院已明令禁止采挖野生甘草，因此栽培甘草成為商品甘草的主流產品。栽培甘草中甘草苷含量差異十分顯著[8]，而功能基因的多態性對于調控產物的合成具有明確的影響。黃酮類化合物是廣泛存在于藥用植物中的一大類化合物，大多與糖類結合成苷存在。查爾酮異構酶是黃酮類化合物甘草苷代謝途徑中的關鍵酶之一，催化分子內的內環反應[15]。因此，對光果甘草黃酮代謝途徑中查爾酮異構酶基因多態性的探究，對甘草苷生物合成分子機制的闡明及篩選高品質甘草意義重大。

圖4 光果甘草CHI信號肽預測

圖5 光果甘草CHI的保守結構域預測

圖6 光果甘草CHI的跨膜結構域預測

大量研究表明，CHI基因調控黃酮類化合物的生物合成，其不表達或活性缺失會阻礙植物的黃酮合成途徑，而過表達則會使黃酮含量顯著提高[11]。Muir等[16]通過將矮牽牛的CHI基因轉入番茄，獲得了黃酮類化合物含量顯著升高的轉基因番茄；Kim等[17]發現，大麥和洋蔥的CHI基因缺失突變體的黃酮類化合物含量急劇下降。

在本研究中，我們克隆了22條光果甘草CHI，共獲得7種單倍型，其序列一致性較好，其中單倍型1為主流單倍型。對NCBI數據庫中豆科其他物種的CHI基因進行分析，發現已注冊的大豆CHI基因數量最多，有100余條，分別編碼114、130、137個氨基酸殘基。其中114個氨基酸殘基的17條CHI蛋白序列中有13條完全一致（AIE16873）；130個氨基酸殘基的17條CHI蛋白序列完全一致（AIE16905）；137個氨基酸殘基的17條CHI蛋白序列中有13條完全一致（AIE16810），一致序列為大豆的主流單倍型。已注冊的綠豆CHI基因有5條，分別編碼222、389個氨基酸殘基，2條222個氨基酸殘基的序列完全一致，為主流單倍型。因此，推測CHI基因在豆科植物的不同物種中均有多種單倍型，但存在數量占主導地位的主流單倍型，可能與黃酮代謝途徑關系更為密切。本研究為進一步探究CHI基因對甘草苷生物合成的分子調控機制奠定了基礎。

圖7 CHI系統進化樹分析

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Cloning and Sequence Analysis of Chalcone Isomerase Gene from Glycyrrhiza glabra L.

ZHANG Xiao-Dong,YIN Yan-Chao,ZHOU Shan,MA Yong-Sheng,HU Ting,GAO Zhi-Qiang,LIU Ying*
School of Life Science,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China
*Corresponding author,E-mail:liuyliwd@sina.com

Objective:To clone and analyze chalcone isomerase（CHI） gene from Glycyrrhiza glabra L.Methods:RNA was extracted from the fresh root of G.glabra,cDNA was reversely transcripted,and CHI gene was amplified by PCR using specific primers designed on the basis of CHI gene from G.uralensis.The obtained CHI cDNA se?quences were sequenced and analyzed by bioinformatics.Results:Twenty-two CHI cDNA sequences were ob?tained.The open reading frame is 690bp encoding 229 amino acid residues.DNAMAN analysis results showed that 16 variable sites were present in 22 G.glabra CHI cDNA sequences and 7 haplotypes were determined,the similarity of which was 99.67％.Haplotype 1 is the major haplotype（45.5％）.Ten variable sites were found in the G.glabra CHI amino acid sequences and the similarity of which was 99.38％.Bioinformatics analysis showed that CHI is a stably hydrophilic protein.Its molecular weight is 24 kDa and isoelectric point is between 5.56 and6.76.It contains no signal peptides or transmembrane domains and has a conversed domain of chalcone superfami?ly.Its secondary structure mainly constituted of α-helix and random coil.N-J tree indicated that it is closest to G.uralensis and farthest to Dryopteris fragrans.Conclusion:It is the first time to successfully clone CHI gene from G.glabra.We hope this work will contribute to explore the function of CHI and reveal the molecular regula?tion mechanisms of liquiritnin synthesis in G.glabra.

Glycyrrhiza glabra L.;chalcone isomerase;liquiritinin;clone;bioinformatics analysis

Q943.2

A

1009-0002（2017）04-0478-07

2017-01-12

北京中醫藥大學杰出青年人才項目（2016JYBXJQ002）

張曉冬（1994- ），女，碩士研究生，（E-mail）zhangxd1880@163.com

劉穎，（E-mail）liuyliwd@sina.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.014