結核分枝桿菌38kD蛋白真核表達載體的構建及其在HEK293T細胞中的分泌性表達

白娜，毛瑩瑩，顏仁和，林明，陳興露，李青青，陳惠瑩，劉軍，李紅衛

1.南方醫科大學 檢驗與生物技術學院生物治療研究所，廣東 廣州 510515；2.云南省玉溪市人民醫院 核醫學科，云南 玉溪 653100；3.廣州伯尼茲生物科技有限公司，廣東 廣州 510663

結核分枝桿菌38kD蛋白真核表達載體的構建及其在HEK293T細胞中的分泌性表達

白娜1，2，毛瑩瑩1，顏仁和3，林明2，陳興露1，李青青1，陳惠瑩1，劉軍1，李紅衛1

1.南方醫科大學 檢驗與生物技術學院生物治療研究所，廣東 廣州 510515；2.云南省玉溪市人民醫院 核醫學科，云南 玉溪 653100；3.廣州伯尼茲生物科技有限公司，廣東 廣州 510663

目的：構建含結核分枝桿菌38kD蛋白基因的真核表達載體并轉染HEK293T細胞，高效表達分泌性38kD蛋白。方法：設計合成的結核分枝桿菌38kD基因被克隆到T載體，然后亞克隆到真核表達載體pcDNA3.0，經酶切鑒定正確后，PEI轉染法導入293T細胞，換不含血清的DMEM培養基培養3d后收集細胞及上清，采用Western印跡檢測38kD蛋白的表達。結果：酶切結果顯示，獲得正確的含38kD基因的重組表達載體；Western印跡結果顯示表達載體導入293T細胞中后能在細胞及上清中檢測到38kD蛋白表達。結論：構建了含重組結核分枝桿菌38kD蛋白基因的真核表達載體pcDNA3.0-38kD，該載體可在哺乳動物細胞HEK293T中高效分泌性表達38kD蛋白，為結核病診斷試劑盒研發奠定了基礎。

結核分枝桿菌38kD蛋白；真核表達載體；分泌表達；HEK293T細胞

近年來由于人口劇增、移民增加、旅游業發展、耐藥性產生、人類免疫缺陷病毒感染流行、吸毒、酗酒與貧困等原因，結核病在全球范圍內死灰復燃，呈回升趨勢[1-2]。我國結核病疫情目前依然很嚴重，是世界上結核病高負擔第二大國，僅次于印度[3-4]。結核桿菌的檢測方法主要有細菌學、免疫學及分子生物學方法等，前者是結核病控制、流行病學調查和臨床醫生用于診斷及鑒別診斷結核的金標準，但因其耗時長，陽性率低而受限；分子生物學技術雖然檢查快速、靈敏，但也存在對技術及人員素質要求高、操作復雜等問題；免疫學診斷方法操作簡便、快速，便于推廣，且有良好的特異性和敏感性，具有血清學診斷價值，成為結核病診斷的良好輔助方法[5-7]。研究表明，38kD抗原上具有結核復合體特異的T淋巴細胞抗原決定簇，可以誘導強烈的抗體和T淋巴細胞反應，部分對抗結核分枝桿菌感染作用[8]。在本研究中，我們利用基因工程技術構建了含結核分枝桿菌38kD蛋白基因的表達載體，并以PEI轉染法導入HEK293T細胞，高效分泌表達38kD蛋白，為結核病診斷試劑盒研發奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞系HEK293T、表達載體pcDNA3.0為本實驗室保存；大腸桿菌DH5α、報告基因增強型綠色熒光蛋白（EGFP）購自天根生化科技（北京）有限公司；pcDNA3.0-EGFP由本實驗室構建；限制性內切酶NheⅠ、MluⅠ、EcoRⅤ和DL2000 DNA marker購自 TaKaRa公司；Blunting酶、1mmol/L dNTP購自New England Biolabs公司；限制性內切酶ApaⅠ購自Thermo scientific公司；T4DNA連接酶購自Roche公司；蛋白marker、質粒快速小提試劑盒購自GeneStar公司；瓊脂糖凝膠片段回收試劑盒購自Magen生物公司；DNA清潔回收試劑盒購自Axygen公司；脫脂奶粉、PVDF膜購自Bio-Rad公司；抗6×His單克隆抗體購自天根公司；羊抗小鼠IgG-HRP購自Solarbio公司；細胞基礎培養基DMEM、胎牛血清（FBS）、胰酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）粉末購自Hyclone公司。

1.2 重組表達載體pcDNA3.0-38kD的構建及鑒定

根據結核分枝桿菌國際標準強毒株H37Rv（GenBank Accession：AL123456.3）的基因組序列，設計合成編碼38kD嵌合蛋白的cDNA片段，序列經過優化（http://www.jcat.de）以適于在哺乳動物細胞中表達（圖1）。

合成的cDNA片段被克隆到T載體獲得重組質粒pMD19T-38kD[通用生物系統（安徽）有限公司]，用NheⅠ、MluⅠ雙酶切獲得38kD基因片段約1152bp，進行補平、清潔處理；真核表達載體pcDNA3.0用EcoRⅤ單酶切后去磷酸化處理。將pcDNA3.0酶切回收產物與38kD基因片段用T4DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細菌，挑過夜培養的LB平板上的單克隆接種到5mL含100μg/mL氨芐西林的LB液體培養基中，37℃搖床培養過夜，提取質粒，得到重組載體質粒pcDNA3.0-38kD。用ApaⅠ酶切pcDNA3.0和重組質粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

圖1 結核分枝桿菌38kD嵌合蛋白cDNA編碼核苷酸序列

1.3 重組載體質粒轉染HEK293T細胞

用含10％FBS的DMEM培養基常規培養HEK293T細胞，轉染前1d胰酶消化、傳代細胞，鋪于6孔板中，細胞匯合度約80％時即可用PEI法將pcDNA3.0-EGFP及pcDNA3.0-38kD重組載體質粒進行轉染[9-10]。轉染24h后將培養基換成無血清的DMEM培養基，轉染48h后觀察細胞熒光，判斷轉染效率。

1.4 Western印跡檢測38kD蛋白的表達

換液后第3d收集細胞上清，4℃、13 000r/min離心5min；每孔細胞用PBS洗滌2次后加入含1％PMSF的RIPA裂解液200μL，冰上裂解30min，收集細胞黏液于滅菌EP管中，加入50μL 5×還原上樣緩沖液，金屬浴煮沸10min裂解細胞，4℃、13 000r/min離心 5min，取上清進行SDS-PAGE，用濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上，用10％脫脂奶粉液室溫搖床溫和振蕩3h封閉，用1∶5000稀釋的His一抗于4℃孵育過夜；用1×TBST洗膜4次，每次 7min；用 1∶10 000稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠二抗室溫搖床溫和振蕩孵育 50min，用 1×TBST洗膜4次，每次7min；每張膜加500μL發光液，暗室中用感光膠片顯色。

2 結果

2.1 結核分枝桿菌38kD蛋白基因重組真核表達載體的鑒定

pcDNA3.0和pcDNA3.0-38kD的ApaⅠ酶切鑒定結果見圖2。重組質粒pcDNA3.0-38kD第2、10、12號酶切后獲的的小片段條帶位置與預期大小相符（正向連接小片段為984bp），表明38kD重組表達質粒pcDNA3.0-38kD構建成功。

2.2 重組質粒轉染HEK293T細胞

分別用pcDNA3.0-EGFP和pcDNA3.0-38kD重組載體轉染HEK293T細胞，48h時在熒光顯微鏡下觀察，判斷轉染效率。pcDNA3.0-EGFP轉染的細胞有較強的熒光，pcDNA3.0-38kD轉染后細胞無熒光，與預期結果相符，說明轉染成功（圖3）。

2.3 Western印跡檢測38kD蛋白在細胞中的表達

重組質粒轉染HEK293T細胞24h后，換為不含血清的DMEM培養基，換液后第3d收取細胞及上清蛋白，樣品處理后，用Western印跡在細胞及上清中均可檢測到38kD蛋白的表達，而轉染pcDNA3.0-EGFP的對照組沒有相應條帶（圖4）。

圖2 重組質粒pcDNA3.0-38kD的單酶切鑒定

圖3 重組質粒轉染HEK293T細胞48h的熒光情況

圖4 Western印跡鑒定細胞及上清中38kD蛋白的表達

3 討論

結核病的快速準確診斷是全球控制結核病的重要措施。1998年，Cole等分離和鑒定出一些極具輔助診斷潛力的特異性蛋白質抗原[11]，為結核病特異性診斷奠定了基礎。結核桿菌分泌蛋白38kD的免疫學活性最強，其用于單項診斷結核病的效果優于其他單一抗原[12-14]。38kD蛋白又名蛋白抗原b（Pab），是一種磷酸鹽轉運蛋白，是結核桿菌分泌較多的抗原，日益成為研究熱點[15]。38kD蛋白屬于分泌蛋白，結核病患者體內抗38kD蛋白的抗體水平較高，是結核桿菌最主要的免疫原[16]，目前被證明是最有效的單個血清學診斷抗原。有關學者對CFP10-ESAT6、38kD、Ag85B和HspX等4種結核相關抗原的研究顯示，單一抗原中38kD的診斷性能最佳，特異度和靈敏度均較高[16]。38kD蛋白廣泛用于結核病的血清學診斷試驗，檢測的敏感性和特異性均較高[17]。

哺乳動物細胞能夠正確有效地識別真核蛋白的合成、加工和分泌信號，識別并去除基因中的內含子，再經過剪切加工成為成熟的mRNA，并準確地完成糖基化、磷酸化及蛋白水解等翻譯后加工過程，產生具有生物學活性，最接近天然蛋白的重組產物[18]。對比于胞質內表達，分泌表達有眾多優勢：簡化蛋白產物的檢測與純化，降低生物處理工藝的復雜性，減少細胞相關蛋白的降解，提高蛋白產物的產量與質量等[19]。

為了使重組結核分枝桿菌38kD蛋白在哺乳動物細胞中高水平、分泌性表達，我們設計合成了含小鼠Igk信號肽38kD嵌合蛋白的cDNA片段，并將其克隆到真核表達載體pcDNA3.0中，通過PEI方法導入哺乳動物細胞HEK293T，在轉染細胞及其培養上清中都能檢測到38kD蛋白，說明構建了含結核分枝桿菌38kD蛋白的重組真核表達載體，且能在哺乳動物細胞293T中高效表達并分泌到細胞外。另外，由于嵌合蛋白C端含有6×His標簽而可使用鎳柱進行純化。總之，我們構建了結核分枝桿菌38kD蛋白重組真核表達質粒，可將其用于轉染293T細胞大量生產純化38kD蛋白，從而為結核病診斷試劑盒研發奠定了基礎。

[1] Mwinga A,Fourie P B.Prospects for new tuberculosis treatment in Africa[J].Trop Med Int Health,2004,9（7）:827-832.

[2]吳燕,朱中元.結核分支桿菌免疫學診斷抗原的研究進展[J].中國熱帶醫學,2006,6（2）:338-339.

[3] 王黎霞,成詩明,陳明亭,等.2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告[J].中國防癆雜志,2012,34（8）:485-508.

[4] 韓洪祥.活動性肺結核密切接觸者發病影響因素的Me?ta分析[J].黑龍江醫藥,2016,38（3）:168-170.

[5] 泮結超,石君帆,丁建祖,等.結核分枝桿菌融合蛋白ELISA方法檢測[J].中國公共衛生,2012,28（4）:418-420.

[6] 鄒自英,朱冰,湯雪晴,等.結核桿菌的細菌學、分子生物學和免疫學檢測方法評價[J].四川醫學,2011,32（5）:756-758.

[7]李常教.結核病實驗室診斷技術的進展[J].現代預防醫學,2006,33（11）:2068-2070.

[8] 吳燕,朱中元,王海波.結核分支桿菌38kD蛋白基因克隆及在大腸桿菌中的表達[J].中國熱帶醫學,2005,5（9）:1786-1789.

[9] 陳曉,蔣捍東,路新枝,等.一種用磷酸鈣法高效轉染HEK293T細胞方法的建立[J].中國海洋大學學報（自然科學版）,2005,35（5）:807-810.

[10]Segura I,González M A,Serrano A,et al.High trans?fection efficiency of human umbilical vein endothelial cells using an optimized calcium phosphate method[J].Anal Biochem,2001,296（1）:143-147.

[11]Cole S T,Brosch R,Parkhill J,et al.Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from thecom?plete genome sequence[J].Nature,1998,6685（393）:537-544.

[12]Bothamley G H,Rudd R,Festenstein F,et al.Clini?cal value of the measurement of Mycobacterium tuber?culosis specific antibody in pulmonary tuberculosis[J].Thorax,1992,47（4）:270-275.

[13]Wilkinson R J,Zhu X,Wilkinson K A,et al.38 000 MW antigen-specific major histocompatibility complex class I restricted interferon-y-secreting CD8+T cells in healthy contacts of tuberculosis[J]. Immunology,1998,95:585-590.

[14]Andersen P.Effective vaccination of mice against My?cobacterium tuberculosis infection with a soluble mix?ture of secreted mycobacterial proteins[J].Infect Im?mun,1994,62（6）:2536-2544.

[15]趙海,李艷,朱虹.結核分枝桿菌重要診斷用抗原研究進展[J].生物技術通訊,2009,20（3）:436-438.

[16]林楠.四種結核分枝桿菌特異蛋白抗原的克隆表達和血清學評價[D].北京:中國疾病預防控制中心,2014:67.

[17]石磊,陳蘇紅.結核分枝桿菌抗原及其研究進展[J].醫學綜述,2012,18（11）:1609-1611.

[18]畢永春,張建瓊,利用哺乳動物細胞表達外源蛋白的研究進展[J].國外醫學分子生物學分冊,2001,23（5）:299-301.

[19]Choi J H,Lee S Y.Secretory and extracellular produc?tion of recombinant proteins using Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2004,64（5）:625-635.

Construction of Eukaryotic Expression Vector of Mycobacte?rium tuberculosis38kD Protein and its Secretory Expres?sion in HEK293T Cells

BAI Na1,2,MAO Ying-Ying1,YAN Ren-He3,LIN Ming2,CHEN Xing-Lu1,LI Qing-Qing1,CHEN Hui-Ying1,LIU Jun1,LI Hong-Wei1*
1.School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou 510515;2.Department of Nuclear Medicine,Yuxi People's Hospital of Yunnan Province,Yuxi 653100;3.Guangzhou Bioneeds Biotechnology Co.,Ltd,Guangzhou 510663;China.

Objective:To construct a robust expressing vector of Mycobacterium tuberculosis 38kD protein,which is able to induce high efficient and secretory expression of 38kD protein in transfected HEK293T cells.Methods:The 38kD gene of M.tuberculosis was synthesized and cloned to T-vector,and then subcoloned into the pcDNA3.0 vector.The recombinant pcDNA3.0-38kD was verified by enzyme digestion,and then transfected into HEK293T cells by polyethylenemine（PEI）-based transfection.The transfected cells and supernatants were collected separately for the detection of 38kD protein by Western blot after the media were changed to serum-free DMEM media for 3 days.Results:We have obtained a robust M.tuberculosis 38kD protein expressing vector,pcDNA3.0-38kD,which can elicit the expression of high level of 38kD protein in both cell supernatants and lysates in transfectedHEK293T cells.Conclusion:High level of secretory M.tuberculosis 38kD protein was expressed in mammalian cells,and it can be potentially used in the development of serological diagnostic kit for tuberculosis.

Mycobacterium tuberculosis 38kD protein;eukaryotic expression system;secretory expression;HEK293T cells

Q78

A

1009-0002（2017）04-0451-04

2017-02-27

白娜（1984- ），女，檢驗技師，碩士研究生，（E-mail）bn_281525013@163.com；毛瑩瑩（1988- ），女，博士，（E-mail）maoyy2011@163.com；二者為并列第一作者

李紅衛，（E-mail）hongweil@yahoo.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.009