神經菌毛素1b結構域的克隆及表達

孔苗苗，戴長松，葛凡，張海霞，沈穎，戴華

揚州大學 江蘇省非編碼RNA基礎與臨床轉化重點實驗室，江蘇省中西醫結合老年病防治重點實驗室，醫學院，江蘇 揚州 225001

神經菌毛素1b結構域的克隆及表達

孔苗苗，戴長松，葛凡，張海霞，沈穎，戴華

揚州大學 江蘇省非編碼RNA基礎與臨床轉化重點實驗室，江蘇省中西醫結合老年病防治重點實驗室，醫學院，江蘇 揚州 225001

目的：制備重組人神經菌毛素1（NRP1）b結構域蛋白。方法：采用PCR技術，從pGEM-NRP1克隆載體中擴增人NRP1b結構域（HuNRP1b）cDNA，并將其克隆入pColdTF，構建重組原核表達質粒pCold-HuNRP1b并轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態，制備重組大腸桿菌BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b），低溫條件下用IPTG誘導重組菌的表達，制備重組蛋白TF-HuNRP1b。結果：酶切、測序結果表明pCold-HuNRP1b構建成功，經SDS-PAGE分析，重組質粒轉化表達菌后重組蛋白TF-HuNRP1b獲得表達，融合蛋白相對分子質量約90×103。結論：獲得原核表達的重組HuNRP1b蛋白，為該蛋白的規模化生產及其單克隆抗體的制備提供了有效的生物材料。

神經菌毛素1；cDNA；克隆；重組蛋白

神經菌毛素 1（neuropilin 1，NRP1）是一種多功能的非酪氨酸激酶受體，其最初作為軸突導向因子 3（semaphorin 3，Sema3）的受體在神經系統發育中具有調控神經元細胞的導向以及軸突生長的功能[1]。進一步的研究發現，NRP1在血管內皮細胞及多種腫瘤細胞表面高表達，是血管內皮細胞生長因子 165（VEGF165）的共受體[2]。NRP1 的相對分子質量為 130×103～140×103，由胞內區、跨膜區及較長的胞外區組成，其胞外區又分a1/a2、b1/b2、c等3個結構域[3]。NRP1通過其胞外區b結構域與VEGF165結合，顯著提高VEGF165與血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR2，KDR）的結合能力，促進血管發育生成[4-5]。阻斷VEGF165與NRP1的結合，不僅能直接抑制腫瘤細胞的遷移，抑制移植瘤的形成，而且還能抑制腫瘤局部血管生成，間接抑制腫瘤生長[6-7]。由于其在腫瘤發生發展中所起的病理性促進作用，NRP1逐漸成為繼VEGFR后抗腫瘤治療的新靶標。我們采用基因工程技術克隆得到人NRP1b結構域（HuNRP1b）cDNA，并對其進行表達、純化，以期獲得重組HuNRP1b蛋白，為研發抗HuNRP1抗體，進一步研究NRP1的功能提供有效的生物材料。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞購自Trans?Gen Biotech公司；大腸桿菌DH5α感受態細胞由本實驗室制備、保存；克隆載體pGEM-NRP1（含HuNRP1全長cDNA）購自Sino Biological公司；質粒pColdTF，限制性核酸內切酶NdeⅠ、XhoⅠ購自TaKaRa公司；T4DNA連接酶購自Fermentas公司；超濾離心管購自Millipore公司；Axygen小量提取質粒試劑、AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒均購自愛思進生物技術有限公司；其他國產分析純試劑均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 HuNRP1b編碼基因的克隆

根據GenBank公布的HuNRP1基因mRNA序列，采用Primer Premier 5.0軟件輔助設計上下游引物，以pGEM-NRP1為模板，擴增HuNRP1b區cDNA，同時引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點。

引物為 P1（5'-GGGCATATGAAATGTATGGA AGCTCTGGGCAT-3'，下劃線為NdeⅠ酶切位點）和 P2（5'-ATTCTCGAGACAGCCCAGCAGCTCCAT TCT-3'，下劃線為XhoⅠ酶切位點）。PCR擴增條件：94℃ 5min；94℃ 50s，65℃ 40s，72℃ 40s，共30個循環；72℃延伸10min。將擴增的PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳后，切取目的條帶，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收，回收產物用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，并同時雙酶切載體pColdTF，37℃酶切過夜。次日，雙酶切產物經1％瓊脂糖凝膠電泳后，分別切取載體及目的片段條帶，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收，-20℃保存。用T4DNA連接酶連接經雙酶切的pColdTF載體、HuNRP1bcDNA片段，4℃連接過夜。次日，取5μL連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將轉化菌涂布含氨芐西林（Amp）的LB平板，37℃培養過夜。次日隨機挑選單菌落，37℃搖床220r/min振蕩培養8h，同上步驟進行菌液PCR，同時以HuNRP1全基因cDNA為陽性對照，篩選陽性克隆子。將菌液PCR產物條帶與陽性對照組條帶位置一致的細菌，用Axygen小量提取質粒試劑盒提取質粒，雙酶切鑒定。將雙酶切鑒定正確的菌株送上海生工生物工程有限公司測序，測序正確的質粒命名為pCold-HuNRP1b。

1.3 重組大腸桿菌 BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）的誘導表達及純化

1.3.1 重組大腸桿菌 BL21（DE3）（pCold-HuN?RP1b）的誘導表達 將重組質粒pCold-HuNRP1b、空載體質粒pColdTF分別轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態，涂布含Amp的LB平板，37℃過夜培養。次日挑取單菌落，接種于5mL含Amp的LB培養基，37℃、220r/min振蕩過夜培養，將新鮮培養的重組菌按1∶50的比例接種于含Amp的LB培養基中，37℃、220r/min振蕩培養，待其D600nm達0.4左右，轉入16℃搖床培養0.5h，分別加入0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mmol/L IPTG進行誘導，16℃連續培養24h，收取菌液。分別取1.0mL菌液，12 000r/min離心，PBS洗2次，用100μL PBS重懸，加入25μL 5×SDS 上樣緩沖液，煮沸 10min。12％SDS-PAGE，上樣量為 15μL，考馬斯亮藍染色0.5h后，脫色液脫色過夜，分析結果。

1.3.2 重組蛋白TF-HuNRP1b的可溶性表達分析取獲得的誘導表達菌 BL21（DE3）（pCold-HuN?RP1b）、BL21（DE3）（pColdTF）各 1mL，同上離心洗滌后，超聲波破碎細菌，離心收集細菌裂解上清及沉淀進行SDS-PAGE分析。

1.3.3 重組蛋白TF-HuNRP1b的大量誘導表達、濃縮 如上條件大量制備BL21（DE3）（pCold-HuN?RP1b）表達菌2 L，PBS洗滌后，用30mL的PBS重懸菌體沉淀，超聲波破碎，同上離心，收集超聲波裂解上清，采用Ni金屬螯合層析柱（Bio-Scale Mini Profinity IMAC）純化重組蛋白。采用30 kDa的超濾離心管，4℃、5500r/min離心，截流蛋白溶液體積至2mL左右，濃縮、提高純化蛋白的濃度。繼續采用4℃超濾離心法，用PBS緩沖液交換濃縮蛋白溶液中含有的高濃度咪唑，使得目的蛋白溶解于PBS緩沖液中，超濾離心管中加入10mL PBS，混勻，4℃、5500r/min離心，截流至2mL左右，重復此步驟5次。收集超濾離心管中的溶液，檢測蛋白濃度，-70℃保存，用于后續免疫及檢測。

2 結果

2.1 HuNRP1b編碼基因cDNA的擴增及序列分析結果

以pGEM-NRP1為模板，擴增HuNRP1b基因cDNA，PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳后可見900bp左右的特異性條帶，與GenBank公布的HuNRP1b區編碼序列大小一致（圖1）。

2.2 重組質粒pCold-HuNRP1b的構建

pColdTF、HuNRP1bcDNA片段經NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切、切膠回收、連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態，涂布Amp+平板。次日，從轉化的平板中隨機挑取5個單菌落進行菌液PCR，圖2第4、5、6泳道均出現900bp左右的條帶，其大小與預期相符。取菌液PCR鑒定正確的菌液，用Axygen小量提取質粒試劑盒提取質粒，雙酶切后電泳鑒定重組質粒，在約6kb及900bp位置出現2條清晰的條帶，大小分別與質粒及目的片段大小一致（圖3），測序結果表明重組質粒pCold-HuNRP1b構建正確（序列略）。

圖1 HuNRP1b基因PCR擴增產物

2.3 重組大腸桿菌 BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）的誘導表達及重組蛋白TF-HuNRP1b的可溶性分析

將鑒定正確的pCold-HuNRP1b轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態，重組菌 BL21（DE3）（pColdTMHuNRP1b）經 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mmol/L IPTG 誘導，經SDS-PAGE分析，在相對分子質量90×103處出現特異性條帶，與預期目的蛋白一致，而且同樣誘導的空載體表達菌 BL21（DE3）（pColdTF）在這一位置未見條帶，僅在55×103處表達其標簽蛋白，表明融合蛋白TF-HuNRP1b得到成功表達，且重組菌在0.4mmol/L IPTG下誘導，目的蛋白獲得最佳表達（圖4）。將誘導表達后的重組菌BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）超聲波裂解、離心，分別取上清、沉淀進行SDS-PAGE分析，結果表明融合蛋白主要以可溶蛋白的形式表達（圖5）。

2.4 純化重組蛋白TF-HuNRP1b

圖2 菌液PCR分析重組菌

圖3 重組質粒pCold-HuNRP1b的雙酶切鑒定

重組菌 BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）經 0.4mmol/L IPTG大量誘導后，超聲波破碎，離心后收集上清進行Ni金屬螯合層析柱純化，純化蛋白經截流、交換后經SDS-PAGE分析，表明目的蛋白得到有效純化（圖6）。

3 討論

NRP1作為VEGF165的共受體，通過其b結構域與VEGF165結合，可明顯增強VEGF165與VEGFR2的結合能力。阻斷由VEGF165介導的NRP1與VEGFR2的結合，能提供最高效的拮抗VEGF165-VEGFR2信號轉導的能力[8-9]。研究發現，NRP1可介導機體腫瘤細胞的免疫逃逸作用，其作用的發揮與b結構域密切相關，如Treg細胞表面的NRP1能夠作為Sema4A、TGF-β的受體，促進Treg細胞的存活和功能，介導Treg細胞以趨化VEGF165的形式富集到腫瘤部位，抑制機體抗腫瘤能力以及對抗腫瘤治療的效果。

大腸桿菌作為外源蛋白表達的宿主菌，具有遺傳背景清晰、培養條件簡單，生長速度快，表達產量高等優點。但其表達的外源蛋白容易聚集而產生沒有活性的包涵體沉淀，包涵體需要經過復雜的溶解、復性、純化才能獲得有活性的蛋白，使得包涵體復性工作量大而復性蛋白得率低。本研究中采用了冷休克蛋白表達載體pColdTF，構建重組表達菌BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）后，經低溫誘導，獲得可溶性表達的融合蛋白TFHuNRP1b，且該表達系統帶有組氨酸標簽，便于目的蛋白的純化。

綜上，本研究為大量制備重組HuNRP1b提供了可能，為制備針對這一結構域的抗體及進一步研究HuNRP1蛋白的生物學功能提供了有效的生物材料。

圖4 SDS-PAGE分析TF-HuNRP1b的表達

圖5 SDS-PAGE分析重組蛋白TF-HuNRP1b的可溶性表達

圖6 SDS-PAGE分析純化的重組蛋白TF-HuNRP1b

[1] Tordjman R,Lepelletier Y,Lemarchandel V,et al.A neuronal receptor,neuropilin-1,is essential for the ini?tiation of the primary immune response[J].Nat Immu?nol,2002,3（5）:477-482.

[2] Neufeld G,Cohen T,Shraga N,et al.The neuropil?ins:multifunctionalsemaphorin and VEGF receptors that modulate axon guidance and angiogenesis[J].Trends Cardiovasc Med,2002,12（1）:13-19.

[3] Roth L,Nasarre C,Dirrig-Grosch S,et al.Transmem?brane domain interactions control biological functions of neuropilin-1[J].Mol Biol Cell,2008,19（2）:646-654.

[4] Pellet-Many C,Frankel P,Jia H,et al.Neuropilins:structure,function and role in disease[J].Biochem J,2008,411（2）:211-226.

[5] Carmeliet P.Blood vessels and nerves:common sig?nals,pathways and diseases[J].Nat Rev Genet,2003,4（9）:710-720.

[6] Starzec A,Vassy R,Martin A,et al.Antiangiogenic and antitumor activities of peptide inhibiting the vascu?lar endothelial growth factor binding to neuropilin-1[J].Life Sci,2006,79（25）:2370-2381.

[7] Soker S,Takashima S,Miao H Q,et al.Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an iso?form-specific receptor for vascular endothelial growth factor[J].Cell,1998,92（6）:735-745.

[8] Sarris M,Andersen K G,Randow F,et al.Neuropilin-1 expression on regulatory T cells enhances their in?teractions with dendritic cells during antigen recogni?tion[J].Immunity,2008,28（3）:402-413.

[9] Delgoffe G M,Woo S R,Turnis M E,et al.Stability and function of regulatory T cells is maintained by a neuropilin-1-semaphorin-4a axis[J].Nature,2013,501（7466）:252-256.

Cloning and Expression of Human Neuropilin 1b Domain

KONG Miao-Miao,DAI Chang-Song,GE Fan,ZHANG Hai-Xia,SHEN Ying,DAI Hua*
Jiangsu Key Laboratory of Experimental&Translational Non-Coding RNA Research,Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Senile Diseases,Medical School,Yang?zhou University,Yangzhou 225001,China
*Corresponding author,E-mail:daihua@yzu.edu.cn

Objective:To develop recombinant human neuropilin 1b domain（HuNRP1b）.Methods:cDNA of HuNRP1bwas amplified by PCR technique from pGEM-NRP1 cloning vector and then subcloned into plasmid pColdTF.After screening and sequencing,the constructed recombinant plasmid pCold-HuNRP1bwas transformed into competent cell E.coli BL21（DE3） and expressed by the induction of IPTG.Results:Enzyme digestion and DNA sequencing results showed that pCold-HuNRP1bwas successfully constructed.SDS-PAGE analysis showed that the expressed product was a fusion protein with a molecular weight of 90 kDa.Conclusion:Recombinant protein HuNRP1bwas successfully constructed,which has laid a foundation for the production of recombinant HuNRP1band development of monoclonal antibodies against HuNRP1b.

neuropilin 1;cDNA;cloning;recombinant protein

Q78

A

1009-0002（2017）04-0447-04

2017-01-17

國家自然科學基金（81472815）；江蘇省大學生創新創業實踐訓練計劃（201511117064Y）

孔苗苗（1995-），女，本科生；戴長松（1989-），男，碩士；二者為共同第一作者

戴華，（E-mail）daihua@yzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.008