仿生礦化PLGA/MWNTs/HA引導組織再生膜的細胞相容性研究

張華林 王凱戎 馬海絨

（寧夏醫科大學口腔醫學院，寧夏銀川750004）

·論 著·

仿生礦化PLGA/MWNTs/HA引導組織再生膜的細胞相容性研究

張華林 王凱戎 馬海絨

（寧夏醫科大學口腔醫學院，寧夏銀川750004）

目的 通過仿生礦化的方法制備PLGA/MWNTs/HA牙周引導組織再生膜并對其細胞相容性進行表征。方法 先將聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]與多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotubes，MWNTs）復合，采用溶液澆鑄法制備PLGA/MWNTs復合膜；再將其仿生礦化，制得PLGA/MWNTs/羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）復合膜，再將人牙周膜干細胞接種于PLGA/MWNTs/HA復合膜上培養，采用掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM）觀察細胞在復合膜上的形貌，四甲基偶氮唑藍（MTT）法分析細胞的增殖情況。結果 PLGA/MWNTs復合膜表面比較均勻、致密；礦化7天后，PLGA/MWNTs復合膜表面有磷灰石晶體形成；人牙周膜干細胞在PLGA/MWNTs/HA復合膜表面生長、增殖良好，HA的加入有利于細胞的粘附和生長。結論 通過仿生礦化法制得的PLGA/MWNTs/HA復合膜具有良好的細胞相容性，有望在牙周引導組織再生領域發揮作用。

仿生礦化；PLGA/MWNTs/HA；引導組織再生膜；細胞相容性

目前，牙周病在世界范圍內患病率較高，嚴重影響人的口腔健康和生活質量[1]。傳統的牙周病治療方法包括刮治術、根面平整、翻瓣術等，主要目的是去除感染、阻止病變進展，卻無法實現牙周組織的再生[2]。因此，重建已喪失的牙周組織的結構和功能是目前口腔醫學領域所面臨的熱點、難點問題。

20世紀80年代初由Nyman等提出的引導組織再生（Guided tissue regeneration，GTR）為牙周組織的再生提供了可能。它是指在齦瓣與根骨面之間放置一種屏障膜，以阻擋牙齦上皮、結締組織與根面接觸，而使具有形成新附著能力的牙周膜前體細胞在愈合過程中沿著根面生長，重新形成牙骨質、牙槽骨以及牙周纖維，建立新附著，進而達到牙周組織再生[3]。在GTR中，GTR膜是決定其手術效果的關鍵因素之一。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]和多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotubes，MWNTs）這兩種生物材料目前在組織工程領域被廣泛應用。可降解高分子聚合物PLGA，具備很好的組織相容性、力學性能和降解性能。MWNTs同時具備高強度、高彈性和高剛度，其超強的力學性能可以極大地改善復合材料的強度和韌性；另一方面，MWNTs在與血液、骨、軟骨和軟組織接觸時，表現出了良好的生物相容性[4]。但這兩種材料均缺乏骨誘導性，而仿生礦化法可以改善此缺點。

本研究將溶液澆鑄法制得的PLGA/MWNTs復合膜進行仿生礦化，制備一種PLGA/MWNTs/HA引導組織再生膜，并研究其細胞相容性，可望得到一種新型的引導組織再生膜，為牙周引導組織再生膜的開發提供基礎研究。

1 材料與方法

1.1 PLGA/MWNTs復合膜的制備：取PLGA 2 g，溶于20 mL的三氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶劑中，待PLGA完全溶解后加入0.2 gMWNTs，充分攪拌30 min后，超聲震蕩60 min使MWNTs分散均勻，然后將混合溶液倒入聚四氟乙烯皿后靜置于通風櫥中，48 h后揭膜。

1.2 過飽和礦化液（SCS）的配置：過飽和礦化溶液按 Li F 的配方由 CaC12、NaH2PO4、NaHCO3配制[5]。三種化合物使用前按比例混合，配成SCS礦化液，pH值為5.96。

1.3 PLGA/MWNTs復合膜的仿生礦化：將干燥的PLGA/MWNTs復合膜浸泡于37℃的恒溫SCS礦化液中，礦化時間為7 d，得到PLGA/MWNTs/HA復合膜。礦化結束后，樣品用蒸餾水漂洗，自然干燥。

1.4 PLGA/MWNTs/HA復合膜的表征：采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察膜及沉積物的表面形貌；采用X射線能量色散譜儀（EDX）檢測沉積物的元素種類和比例。

1.5 人牙周膜干細胞的分離與培養：收集臨床正畸拔除的雙尖牙，年齡12～16歲，所選牙齒均無齲壞、根尖周疾病及牙周炎。拔牙前徹底消毒術區。拔除后將牙齒立即投入DMEM培養液中，用生理鹽水（含青霉素 500 μ/mL，鏈霉素 500 μg/mL）反復浸洗滅菌后，將牙齒移入另一無菌培養皿中，仔細刮取根中1/3的牙周膜組織。將組織塊以均勻間距接種于25 mL培養瓶中，加入5 mLDMEM培養液（含20%胎牛血清，青霉素100 μ/mL，鏈霉素100 μg/mL），將培養瓶置于37℃含5%CO2飽和濕度的培養箱中恒溫培養，觀察細胞游出情況，待細胞爬滿瓶底時，更換液體去除組織塊，每3 d更換一次培養基。待貼壁細胞接近鋪滿瓶底時，0.5%胰蛋白酶消化，按1：2或1：3比例傳代培養。

1.6 細胞形貌觀察：將實驗組（PLGA/MWNTs/HA復合膜）和對照組（PLGA/MWNTs復合膜）的樣品置于6孔板內，加入DMEM培養基，然后將培養的細胞以1×105個/mL的密度接種于放有樣品的培養板內，在倒置相差顯微鏡下觀察樣本側壁及周邊細胞的生長，在培養48h后，從各組分別取出一塊材料，PBS漂洗3遍，2.5%戊二醛固定過夜，乙醇梯度脫水，干燥、噴金后掃描電鏡觀察細胞形態。

1.7 細胞增殖情況測定：將培養的細胞以1×105個/mL的密度接種于放有樣品的培養板內，分別在第 1、3、5、7 天取每組試樣加入 MTT5 mg/mL 溶液40 μL，37℃下繼續培養 4 h，終止培養，小心吸棄孔內的上清液，每孔加入420 μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，使結晶物充分溶解。吸取每孔中液體100 mL到96孔板內，492 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度值，記錄結果。

1.8 統計學處理：采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計量資料用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PLGA/MWNTs復合膜、PLGA/MWNTs/HA復合膜的SEM觀察：PLGA/MWNTs復合膜上方有均勻分布的成簇的結晶礦化物出現，覆蓋復合膜面積的40%～50%。高倍鏡下，可以看到有的礦化物為小球形；有的為盛開的花朵狀。“花朵”中的單個晶體呈葉片狀，錯落有致，相互交織成叢，詳見圖1。

圖1 PLGA/MWNTs復合膜、PLGA/MWNTs/HA復合膜的SEM圖注：（a）PLGA/MWNTs復合膜（×5000）；（b）PLGA/MWNTs復合膜（×100000；（c）礦化后的 PLGA/MWNTs/HA 復合膜（×50）；（d）礦化后的 PLGA/MWNTs/HA復合膜（×500）

2.2 礦化膜的EDX分析采用EDX對礦化的沉積物進行檢測：沉積物以鈣、磷元素為主，Ca/P=1.58，接近羥基磷灰石的Ca/P理論值1.67，詳見圖2。

2.3 人牙周膜成纖維細胞的生長和形態觀察：細胞多呈長梭形，間隙狹窄，緊密排列成束，呈漩渦狀外觀，詳見圖3。

圖2 PLGA/MWNTs復合膜礦化7 d后礦化物的EDX圖

圖3 組織塊法培養21 d的牙周膜干細胞的生長情況（×50）

2.4 細胞與復合膜共培養SEM觀察：培養48 h后，在PLGA/MWNTs復合膜表面，黏附細胞數量較少，部分細胞體呈多邊形，部分細胞體呈細長梭形，面積較小，表明部分細胞尚未發生鋪展。在PLGA/MWNTs/HA復合膜表面，細胞數量明顯較PLGA/MWNTs組多，細胞分布均勻，大部分細胞己經鋪展呈多邊形，部分細胞黏附于礦化物表面。結果表明，礦化后的PLGA/MWNTs/HA復合膜更有利于細胞的初始黏附與生長，詳見圖4。

圖4 人牙周膜干細胞在復合膜上培養48 h的SEM圖注：（a）PLGA/MWNTs復合膜；（b）PLGA/MWNTs/HA 復合膜

2.5 細胞的增殖活性：兩組細胞的數量都隨培養時間的增加而增加。第1天、第3天、第5天和第7天，實驗組細胞的數量比對照組都有顯著的增加，均具有統計學意義（P＜0.05）。這說明實驗組細胞增殖的速度和活性明顯高于對照組。這可能是因為實驗組磷灰石礦化物增加了復合膜的親水性和生物活性，因此，也促進了牙周膜干細胞早期的黏附和增殖，詳見圖5。

圖5 牙周膜干細胞接種于實驗組和對照組表面培養7 d的MTT圖

3 討論

本研究通過仿生礦化法對利用溶液澆鑄法制得的PLGA/MWNTs復合膜進行仿生礦化，可制備得到PLGA/MWNTs/HA復合膜。其表面有均勻分布的成簇的結晶礦化物出現，礦化物以鈣、磷元素為主，Ca/P=1.58。PLGA/MWNTs/HA復合膜對人牙周膜干細胞的黏附和增殖具有良好的作用。該礦化復合膜有可能作為牙周引導組織再生膜材料應用于牙周組織再生領域。

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［4］ Zhang HL.Biomimetic synthesis ofpoly（lactic-co-glycolic acid）/multi-walled carbonnanotubes/apatitecomposite membranes［J］.Express Polymer Letters，2012，6（8）：620-628.

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Study on Cell Compatibility of BiomineralizedPLGA/MWNTs/HAGuided Tissue Regeneration Membrane

Zhang Hualin Wang Kairong Ma Hairong
（College of Stomatology，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China）

Objective To prepare the PLGA/MWNTs/HA guided tissue regeneration membrane by biomimetic mineralization and study its cell biocompatibility.Methods The PLGA/MWNTs composite membrane was prepared by solvent casting method；then，the PLGA/MWNTs composite membrane was immersed in the biomimetic mineralization solution to prepare the PLGA/MWNTs/HA membrane；the human periodontal ligament stem cells were cultured on the PLGA/MWNTs/HA composite membrane.The morphology of the cells was observed by SEM and the proliferation of the cells was analyzed by MTT method.Results The surface of PLGA/MWNTs composite membranewas uniformand dense；after 7 days of mineralization，apatite crystals were formed on the surface of PLGA/MWNTs composite membrane；human periodontal ligament stem cells grew well on the surface of PLGA/MWNTs/HA composite membrane，and the addition of HA crystals was beneficial to cell adhesion and growth.Conclusion The PLGA/MWNTs/HA composite membrane prepared by biomimetic mineralization has good biocompatibility，which is expected to play a role in periodontal guided tissue regeneration.

Biomimetic mineralization；PLGA/MWNTs/HA；Guided tissue regeneration membrane；Cell compatibility

R781.4

A 學科分類代碼： 32044

1001-8131（2017）05-0401-03

寧夏自然科學基金項目（NZ14063）

2017-05-18