廣州地區桑椹菌核病病原鑒定

黃志君，易輝玉，李榮俏，李林山

（1.華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州 510642；2.廣東省蠶業技術推廣中心，廣東 廣州 510640）

廣州地區桑椹菌核病病原鑒定

黃志君1，易輝玉1，李榮俏1，李林山2

（1.華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州 510642；2.廣東省蠶業技術推廣中心，廣東 廣州 510640）

桑椹菌核病是目前危害桑椹的主要真菌性病害，在廣州地區桑園一直都有發生，由多年前主要發生的肥大性菌核病變成小粒性菌核病，其菌核表面為大量的分生孢子和一些分生孢子梗，里面為相互交叉致密的菌絲，培養后的菌核周圍形成一層白色半透明的菌圈。使用真菌通用引物，由桑椹菌核病病果的菌核DNA擴增ITS，測序后進行Nucleotide BLAST和進化分析，發現其與4種桑椹菌核病病原菌中的肉阜狀杯盤菌（Ciboria carunculoides）序列相似度最高、親緣關系最近，確認該小粒性桑椹菌核病病原為肉阜狀杯盤菌。

桑椹菌核病；桑椹小粒性菌核??；形態鑒定；核糖體內轉錄間隔區

桑椹，俗稱桑果，是長橢圓形聚合果，富含果汁，清甜可口，并具有極高的保健和藥用價值，被列為世界第3代水果，具有廣闊的開發利用前景。桑椹含有豐富的果糖、葡萄糖、丁二酸、無機鹽、7種維生素和人體所需的氨基酸等多種營養成分，也含有抗壞血酸、花青素（主要為矢車菊素）、白藜蘆醇和微量元素等活性成分［1-3］。桑椹除鮮食外，還可以制成桑椹酒、桑椹蜜餞、桑椹飲料等保健食品［4］。隨著人們生活水平的提高和追求高品質水果及飲品，桑椹及桑果汁越來越受到人們的青睞；果桑的種植面積迅速發展，成為蠶桑產業發展的一個新亮點。當前正是果桑發展方興未艾之期，2016年廣東果桑種植面積已達1 500 hm2。但是，隨著果桑種植面積的擴大，桑椹的毀滅性病害——桑椹菌核病也在不斷蔓延，該病傳染性極強、危害性大，直接影響桑椹的產量和質量，發病嚴重時可導致全園桑椹絕收，給果桑產業帶來毀滅性的危害［5］。

桑椹菌核病為真菌性病害，俗稱白果病，常見有桑椹肥大性菌核?。╩ulberry sorosus hypertrophic sclerote disease）、桑椹小粒性菌核?。╩ulberry sorosus parvulling sclerote disease）和桑椹縮小性菌核病（mulbery sorosus diminuting sclerote disease）3種。在國外，20世紀20年代Siegler與Jenkins就對桑椹小粒性菌核病的病原進行了鑒定［6-7］；之后，在美國、日本和印度等國家都有桑椹菌核病相關的研究與報道［8-10］。Hong等通過對韓國果桑地的菌核進行培養鑒定，發現了在當地發生的兩種菌核病菌——核盤菌與核地杖菌，并對它們的形態進行深入研究［11］。蒯元璋等對常見且公認的3種桑椹菌核?。ㄉｉ┓蚀笮跃瞬?、桑椹小粒性菌核病和桑椹縮小性菌核?。┘八鼈兊牟≡嵄P菌（Ciboria shiraiana）、肉阜狀杯盤菌（Ciboria carunculoides）和核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）的形態特征進行詳細的描述［5］。胡君歡等結合形態與分子鑒定，發現寧波天宮莊園桑果觀賞基地的菌核病菌除公認的3種外，還有核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）［12］。

桑椹小粒性菌核病除直接危害桑果外，還會交叉感染桑樹其他組織，引起桑枝菌核?。〝嗌也。┑膰乐匕l生。據藍月丘等報道，2007年5月廣西宜州市部分桑園暴發斷梢病，嚴重桑園發病率達80%～100 %，造成桑枝倒伏和干枯，桑葉減產60 %以上，給當地桑蠶帶來極大損害［13］。2014年4月華南農業大學桑園桑枝菌核?。〝嗌也。┮鹕鋫?0品種嚴重倒伏。根據對廣州桑椹菌核病的調查，近年該地區的桑椹菌核病主要為小粒性菌核病，但該菌核病是否有地理的特異性及病原是否有分化尚未有具體的研究。因此，本試驗對華南農業大學桑園桑菌核病病原菌的形態和分子進行鑒定，為對其進行對癥下藥和有效防控提供基礎和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料：在華南農業大學桑園中采集桑椹菌核病病椹典型樣本2份，編號為gz01和gz02，用于直接進行形態學研究或-20 ℃冰箱保存備用。

試驗試劑：2 × Ace Taq Master Mix（Dye Plus）和DL2000 Plus DNA Marker，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）。

1.2 形態學研究

對采集的桑椹菌核病病椹菌核進行切片觀察，并刮取菌核表面菌絲與孢子，進行碘液染色，乳酚油作浮載劑制片，光學顯微觀察病原的形態特征。

對菌核進行PDA培養，觀察菌絲與孢子形態。選擇新鮮菌核，切成大小3～4 mm2組織塊；將材料浸入75%酒精中2～3 s，再轉入0.1%升汞液處理0.5～2 min；然后經無菌水清洗3次；用吸水紙吸干移入平板培養基上。每培養皿放置3～5塊材料，將培養皿翻轉置于25℃恒溫箱內培養。當培養組織塊長出菌絲，用移植針挑取邊緣菌絲制片觀察。

1.3 ITS分子鑒定

總DNA提?。簩⒕朔湃? mL離心管中，在全自動低溫組織勻漿儀上打碎后，用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

rDNA-ITS擴增：用真菌ITS（核糖體內轉錄間隔區，Internal Transcribed Spacer）的通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對菌核總DNA進行PCR擴增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系（50 μL）：2 × Ace Taq Master Mix 25 μL；引物各1 μL；模板DNA 2 μL；加ddH2O至總體積為50 μL。PCR反應條件：95℃熱變性5 min；95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸45 s，此3步進行35個循環；最后72℃延伸5 min。反應終止后，取5 μL產物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，120 V，電泳30 min。將有目的條帶的PCR產物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行純化和測序。

序列比對與系統發育樹的構建：將測得的序列在NCBI上進行BLAST分析，選取并下載相關序列與目的序列一起進行系統進化分析。使用軟件MEGA 7.0，先采用ClustalW對所有序列進行多序列比對分析，對位排列兩段對齊后，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），通過自舉分析（bootstrap）進行置信度檢測，自展次數為1 000，用Kimura 2-parameter計算進化距離，構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 桑椹小粒性菌核病形態

病椹病征顯現初期，病椹仍呈正常淡紫紅色，但感病小果不斷膨大，顏色變淡，接著子房壁和花被由里到外逐漸變得透明，然后變白，而柱頭和萼片邊緣深褐色，最后整個病椹變白（圖1A、C，封三），病小果呈相互分隔澎大狀，容易掉落（圖1A，封三）。如果遇到雨水天氣，有的病椹變褐變黑，甚至腐爛（圖1B、D，封三）。如營養水分不足，病椹小果會顯得干枯和松散（圖1C，封三）。隨著病椹變白的過程，由病小果形成的菌核也不斷形成，剝開外層花被，可見由子房病變而成的黑色硬塊—桑椹小粒性菌核病菌核（圖2A，封三）。刮取菌核表面菌物質觀察，可見大量的分生孢子以及一些分生孢子梗，孢子大小約2～3 μm，孢子梗呈分叉狀（圖2B，封三），對菌核進行切片觀察，可見里面相互交叉致密的菌絲（圖2C、D，封三）。

圖1 桑椹菌核病（白果?。┬螒B

圖2 桑椹小粒性菌核病菌核、孢子及菌核切片形態

通過對菌核的培養，發現在菌核周圍可形成一層白色半透明的菌圈（圖3A，封三），挑取菌落邊緣菌物進行顯微觀察，發現其菌絲密集，菌絲多斷裂成小段，上面也存在著較多的分生孢子（圖3B，封三）。但通過培養沒有看到分生孢子的萌發（圖3B，封三）。

圖3 桑椹小粒性菌核病菌核培養的菌落、菌絲和孢子形態

2.2 ITS擴增產物的電泳檢測

由桑椹小粒性菌核病病果的菌核（gz01和gz02）提取總DNA，以它們為模板，用真菌通用引物ITS1和ITS4擴增得到ITS片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖4）顯示，由菌核gz01和gz02擴增得到的ITS片段大小相近，條帶位于500～750 bp之間，與真菌通用引物擴增的條帶大?。?50 bp左右）相符。將擴增得到的兩條ITS產物送生工生物工程（上海）股份有限公司純化后進行測序。

圖4 ITS擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

2.3 ITS序列及其發育樹的構建

序列比對發現，由gz01和gz02擴增并測序的兩條ITS片段只有3個堿基的差異。在NCBI網站上對它們分別進行Nucleotide BLAST分析，所測得的兩條ITS序列與多株Ciboria carunculoides菌株的ITS序列均有99%的相似性，與3株Ciboria shiraiana菌株的ITS序列有約90%的相似性，而與其它桑椹菌核病病原如Scleromitrula shiraiana的ITS序列則相似性較低。

根據BLAST結果，將所測得的兩條序列與NCBI登錄的桑椹菌核病病原ITS序列進行系統進化分析（圖5），4種桑椹菌核病的病原—桑實杯盤菌（Ciboria shiraiana）、肉阜狀杯盤菌（Ciboria carunculoides）、核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）和核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）均各成分支，Scleromitrula shiraiana與非桑椹菌核病病原—柔膜菌目真菌Cadophora melinii處于一支；其中Ciboria carunculoides和Ciboria shiraiana的親緣關系較近，Sclerotinia sclerotiorum和Scleromitrula shiraiana的關系較近。本實驗研究的桑椹菌核病病原（gz01和gz02）與Ciboria carunculoides同源性最近。

圖5 桑椹菌核病病原菌系統進化分析

3 結論與討論

在植物病原分類鑒定方面，由于植物病原菌形態特征復雜，有些病原菌的形態特征和生理生化指標受環境等外界因素影響而不穩定，傳統的植物病原分類鑒定常引起分類系統的混亂或意見分歧。用于未知菌分類鑒定的核酸序列分析最常選用的是真菌核糖體脫氧核糖核酸（rDNA），rDNA序列保守性強，存在可變區和高變區。真菌基因組中編碼核糖體的基因包括28S、5S、18S和5.8S rDNA，它們在染色體上頭尾相連而串聯排列，相互之間由間隔區分隔；間隔區ITS1和ITS2是位于核糖體大小亞基基因之間的核苷酸序列，通過利用通用引物對間隔區ITS1和ITS2進行克隆及測序分析，可以在種及亞種水平上進行真菌的鑒定［14］。以PCR為基礎的ITS序列分析技術在植物病蟲害的研究上取得了突破性的進展［14-15］。

目前，國內對桑椹菌核病分子水平的研究才剛剛起步，其將是未來重要的研究方向。一般認為桑椹菌核病包括桑實杯盤菌、肉阜狀杯盤菌和核地杖菌3種病原菌，但越來越多的研究表明桑椹菌核病病菌存在多樣性，近年來在形態鑒定的基礎上結合分子鑒定確認其他病原菌如核盤菌等的存在［12，17-18］。賀磊等從發病桑椹上分離純化出一株真菌，結合形態學和分子生物學鑒定，確定此菌株為一種桑椹致病菌—桑莖點霉（Phoma moricola）［16］。李如等從表現桑椹菌核病病癥的桑樹病果中分離到一株優勢真菌菌株，其在PDA平板上培養的菌落外觀特征與在染病桑椹小核果間菌絲發育形成的菌核病菌類似，結合rDNA -ITS檢測分析，初步鑒定該菌株屬于擬莖點霉［17］。對華南農業大學桑園桑菌核病病原菌的形態和分子進行鑒定發現其病原菌主要為肉阜狀杯盤菌，表現為小粒性菌核?。坏蛉〔牡南拗菩?，對其多樣性還有待進一步的調查和研究。

另外，在病原侵染上，一般認為桑椹菌核病菌的子囊孢子成熟噴發形成初次侵染，加上形成病椹后產生大量分生孢子形成再次侵染，侵染期長達1個多月；但我們調查發現，在廣州地區，桑椹菌核病在后開花桑果中的為害較早開花的輕，這與分生孢子形成再次侵染的說法不相符；而且，我們對分生孢子進行PDA、燕麥等培養基培養均不能使孢子萌發。張重梅對油菜的4株核盤菌的研究也發現，在培養基中不能使核盤菌的分生孢子萌發［18］。因此，對桑椹菌核病分生孢子的侵染功能與機制有待進一步研究。

［1］張燕忠，王忠華. 桑果生理活性成分及其產品開發研究進展［J］. 食品工業科技，2009（11）：314-318.

［2］王軍文，黃金枝，石旭平，等. 桑椹在食品加工中的研究進展［J］. 蠶桑茶葉通訊，2016（4）：3-6.

［3］Aramwit P，Bang N，Srichana T. The properties and stability of anthocyanins in mulberry fruits［J］. Food Research International，2010，43：1093-1097.

［4］Perez-Gregorio M R，Regueiro J，Alonso-Gonzalez E，et al. Influence of alcoholic fermentation process on antioxidant activity and phenolic levels from mulberries（Morus nigraL.）［J］. LWT - Food Sci Technol，2011，44（8）：1793–801.

［5］蒯元璋，吳福安. 桑椹菌核病病原及病害防治技術綜述［J］. 蠶業科學，2012（6）：1099-1104.

［6］Siegler E A，Jenkins A E. A new Sclerotinia on mulberry［J］. Science，1922，55： 353-354.

［7］Siegler E A，Jenkins A E.Sclerotinia carunculoides，the cause of a sorious disease of the mulberry（Morus alba）［J］. J Agric Res，1923，10：221-228.

［8］Whetzel H H，Wolf F A. The cup fungus，Ciboria carunculoides，pathogenic on mulberry fruits［J］.Mycologia，1945，37：476-491.

［9］木村勝太郎. 原色日本桑樹病害圖說［M］. 東京：日本建帛社，1979：109-112.

［10］Gray E，Gray R E. Observations on popcorn disease of mulberry in south central Kentucky［J］.Castanea，1987，52（1）：47-51.

［11］Hong S K，Kim W G，Sung G B，et al. Identification and distribution of two fungal species causing sclerotial disease on mulberry fruits in Korea［J］.Microbiology，2007，35（2）：87-90.

［12］胡君歡，蔡岳興，周書軍，等. 寧波桑果基地菌核病菌的多樣性與ITS初步分析［J］. 寧波大學學報（理工版），2011（3）：20-23.

［13］藍月丘. 桑園暴發枝枯菌核病的原因及防治對策［J］. 廣西農學報，2013（4）：37-38.

［14］Schoch C L，Seifert K A，Huhndorf S，et al.Nuclear ribosomal internal transcribed spacer（ITS）region as a universal DNA barcode marker for Fungi［J］. PNAS，2012，109（16）：6241-6246.

［15］Nilsson R H，Hyde K D，Pawlowska J，et al.Improving ITS sequence data for identification of plant pathogenic fungi［J］. Fungal Diversity，2014，67：11-19.

［16］賀磊，胡軍華，徐立，等. 一株桑椹致病菌的鑒定及其生物學特性研究［J］. 西南農業學報，2010（3）：760-763.

［17］如，龍韋韋，陳倩茜，等. 一株擬莖點霉（Phomopsissp. SC1104）菌株的分離鑒定及對桑椹的致病性試驗［J］. 蠶業科學，2016（1）：40-44.

［18］張重梅. 大量產小孢子核盤菌菌株生物學特性及其小孢子萌發特性研究［D］. 武漢：華中農業大學，2011.

Morphological and molecular identification of mulberry fruit sclerotiniose pathogen in Guangzhou

HUANG Zhi-jun1，YI Hui-yu1，LI Rong-qiao1，LI Lin-shan2

（1. College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2. Guangdong Sericulture Technology Extension Center，Guangzhou 510640，China）

Mulberry fruit sclerotiniose is the major fungal disease and becomes a serious threat to mulberry production. It often occurs in mulberry field of Guangzhou areas. And the harmful symptoms show that the major disease may change from mulberry sorosus hypertrophic sclerote disease to mulberry sorosus parvulling sclerote disease. In order to identify the pathogens of this disease，its morphological features were identified and the results showed that the suface of sclerotium had lots of conidia with some conidiophores and there were full of intersecting hyphae inside. When cultured on PDA media，a white and translucent zone was formed around the sclerotium.Moreover，the ITS conserved sequences of mulberry sorosus parvulling sclerote were analyzed and the results showed that the pathogen of mulberry sorosus parvulling sclerote disease wasCiboria carunculoides.

mulberry fruit sclerotiniose；mulberry sorosus parvulling sclerotiniose；morphological identification；internal transcribed spacer（ITS）

S888.71

A

1004-874X（2017）07-0091-05

黃志君，易輝玉，李榮俏，等. 廣州地區桑椹菌核病病原鑒定［J］.廣東農業科學，2017，44（7）：91-95.

2017-04-22

廣東省協同創新與平臺環境建設項目（2015-09-11）

黃志君（1971-），男，博士，高級實驗師，E-mail：hzj@scau.edu.cn

易輝玉（1981-），女，博士，講師，E-mail：yihy@scau.edu.cn

（責任編輯 楊賢智）