3個引進油橄欖品種初榨油多酚類化合物含量及抗氧化活性研究

向春蓉 徐 洲 王寒冬 劉 捷 丁春邦 李 天 楊澤身(四川農業大學生命科學學院，雅安 6504)( 四川農業大學農學院，成都 60)(涼山州中澤新技術開發有限責任公司，西昌 65000)

3個引進油橄欖品種初榨油多酚類化合物含量及抗氧化活性研究

向春蓉1徐 洲1王寒冬1劉 捷1丁春邦1李 天2楊澤身3
(四川農業大學生命科學學院1，雅安 625014)( 四川農業大學農學院2，成都 611130)(涼山州中澤新技術開發有限責任公司3，西昌 615000)

以3個引進油橄欖品種初榨油為材料，測定總多酚含量和各單體酚含量并評價其抗氧化活性，同時采用SPSS應用軟件分析總多酚含量、各單體酚含量與體外抗氧化活性的相關性。結果表明：3個品種總多酚含量分別為21.26、23.31、26.04 μg/g，品種間無顯著差異，而單體酚含量均較少；3個品種中佛奧對DPPH自由基的清除能力最強，而對羥基自由基的清除能力和Fe2+螯合能力則是豆果最強；羥基酪醇含量與DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力和Fe2+螯合能力極顯著負相關或顯著正相關，相關系數分別為-0.956、0.713、0.721；對羥基苯甲酸含量與Fe2+螯合能力顯著正相關；槲皮素含量與DPPH自由基清除能力顯著負相關，與Fe2+螯合能力顯著正相關；而總多酚含量、咖啡酸和表兒茶素含量與體外抗氧化能力的的相關程度較低，因此羥基酪醇、對羥基苯甲酸和槲皮素是主要的抗氧化成分。

初榨橄欖油 多酚含量 抗氧化活性

初榨橄欖油是油橄欖鮮果經物理冷榨而得的植物油，含有豐富的不飽和脂肪酸、α-生育酚、多酚、甾醇以及多種微量元素[1]。多酚類化合物指芳香烴中苯環上一個或多個氫原子被羥基取代所生成的化合物，是植物的重要次生代謝產物，包括黃酮類、單寧類、酚酸類以及花色苷類等，能作為天然的抗氧化劑阻止活性氧和活性氮的增加，調節機體內氧化劑和抗氧化劑的穩態，防止或減弱生物大分子的氧化損傷，從而達到降低許多慢性疾病的發病率以及延緩衰老的作用[2-3]。橄欖油中主要的多酚類化合物有沒食子酸、羥基酪醇、阿魏酸、兒茶素和咖啡酸等，能提高橄欖油的氧化穩定性，延長橄欖油的貨架期，提高橄欖油的色澤、風味等感官特性[4-6]。研究還表明，橄欖油中的多酚類化合物具有抗氧化、抗菌、抗病毒等多種生物活性[7]。

以涼山地區引進的3個油橄欖品種初榨油為對象，利用高效液相色譜(HPLC)技術及SPSS分析軟件，研究其多酚類化合物含量和抗氧化活性以及二者之間的相關性，以期為橄欖油品質分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3個品種初榨橄欖油(佛奧、豆果、城固32)：涼山州中澤新技術開發有限責任公司；各單體酚標準品，2，2-二苯基-1-苦味基肼(DPPH)：美國Sigma公司；甲醇(用于流動相)、異丙醇：色譜純，美國Fisher公司；甲醇、啡啰嗪、水楊酸鈉、H2O2、FeSO4、乙醇、醋酸：分析純，成都科龍化工試劑廠。

GL-2050M高速冷凍離心機：湖南賽特湘儀器；RE-2000B旋轉蒸發儀：上海榮亞生化儀器；Agilent 1260型高效液相色譜系統：美國Agilent公司；Spectramax M2酶標儀：美國Molecular Devices公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 多酚類化合物的制備

多酚類化合物的制備參照Bouarroudj[8]的方法，稍有改動：20.0 g橄欖油溶解于80%甲醇溶液中，振搖1 min，4 000 r/min離心15 min，收集上層液體，重復提取3次后于40 ℃濃縮，80%甲醇溶液定容至25 mL，得樣品溶液。

1.2.2 總多酚含量的測定

總多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteau顯色法[9]，稍加改動：先將樣品溶液稀釋20倍，取20 μL福林酚試劑加入到100 μL稀釋后的樣品溶液中，5 min后加入80 μL 10%碳酸鈉溶液，搖勻，避光反應1 h后于765 nm檢測。以沒食子酸質量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程?？偠喾雍坑嬎愎剑?/p>

式中：C為樣品液中總多酚質量濃度/μg/mL；V為樣品液體積/mL；N為稀釋倍數；M為橄欖油質量/g。

1.2.3 多酚類化合物組成分析及含量測定

標準溶液制備：分別稱取適量的羥基酪醇、對羥基苯甲酸、咖啡酸、表兒茶素和槲皮素，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得標準品溶液。分別吸取一定量的標準品溶液，配成標準品混合液，在該混合液中各單體酚的質量濃度分別為：羥基酪醇11.98 μg/mL、對羥基苯甲酸28.46 μg/mL、咖啡酸11.48 μg/mL、表兒茶素38.95 μg/mL和槲皮素7.99 μg/mL。將標準品混合溶液依次稀釋2.5、5.0、10.0、15.0、20.0倍后進樣分析。以各單體酚液相色譜質量濃度(μg/mL)為橫坐標，峰面積(mAu·s)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。各單體酚含量計算公式：

式中：C為樣品液中各單體酚質量濃度/μg/mL；V為樣品液體積/mL；M為橄欖油質量/g。

液相色譜條件：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5.0 μm)；DAD檢測器；進樣量20 μL；檢測波長280 nm；柱溫35 ℃；流量1.0 mL/min；流動相為0.5%乙酸(A)+甲醇(B)+異丙醇(C)；梯度洗脫順序為0～14 min，92% A，4% B，4% C；14～30 min，92%～82% A，4%～9% B，4%～9% C；31～60 min，82%～70% A，9%～15% B，9%～15% C。

1.3 抗氧化活性測定

1.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參照李小勇等[10]報道的方法，稍加改動：先將待測液分別稀釋1、5、10、15、20倍，取稀釋后的樣品溶液50 μL，加入150 μL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，搖勻，室溫反應30 min后于517 nm測吸光值。DPPH自由基清除率通過公式計算:

式中：As為樣品溶液的吸光值；Ac為乙醇代替樣品溶液的吸光值。

1.3.2 羥基自由基清除能力測定

羥基自由基清除能力的測定參照Xu等[11]的報道，稍加改動：先將待測液分別稀釋1、2、4、6、8倍，取稀釋后的樣品溶液50 μL，加入50 μL 9 mmol/L的水楊酸鈉溶液和50 μL H2O2，搖勻，37 ℃反應30 min后于510 nm測吸光值。羥基自由基清除率通過公式計算:

式中：As為樣品溶液的吸光值；Ac為蒸餾水代替樣品溶液的吸光值。

1.3.3 鐵離子螯合能力的測定

鐵離子螯合能力的測定參照Pinar等[12]的報道，稍加改動：先將待測液分別稀釋1、2、4、6、8倍，取稀釋后的樣品溶液50 μL，加入100 μL 0.012 5 mmol/L的FeSO4溶液和50 μL 1 mmol/L的啡啰嗪溶液搖勻，室溫反應10 min后于562 nm測吸光值。鐵離子螯合能力通過公式計算:

式中：As為樣品溶液的吸光值；Ac為蒸餾水代替樣品溶液的吸光值。

1.4 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 20進行清除率達到50%時的濃度(EC50)的計算，相關性分析及顯著性分析。數據均為3次重復的平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 總多酚和各單體酚的含量

分別以吸光值和峰面積為縱坐標，總多酚及各單體酚的質量濃度為橫坐標進行線性回歸，得線性方程和相關系數(表1)，各物質的吸光值和濃度之間以及峰面積和濃度之間均呈良好的線性關系。3個品種初榨橄欖油的總多酚及各單體酚含量見表1，其中總多酚含量分別為21.26、23.31和26.04 μg/g，品種間無顯著差異。據文獻報道[13]，總多酚含量與橄欖油的抗氧化活性有著密切的聯系。3個品種初榨橄欖油的各單體酚含量均較少，其中咖啡酸的含量最少。佛奧的羥基酪醇含量3.17 μg/g明顯高于豆果和城固32，而表兒茶素的含量則低于豆果和城固32；城固32因較高的表兒茶素含量13.03 μg/g區別于另2個品種；豆果的槲皮素含量0.09 μg/g明顯低于另2個品種。

表1 3個品種初榨橄欖油總多酚及各單體酚的含量、線性方程和相關系數(μg/g；n=3)

注：—表示低于定量限；同一行數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，余同。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH是一種穩定的自由基，能與抗氧化劑結合形成穩定的DPPH分子并伴隨著517 nm處特征峰的消失，因而被廣泛用于多酚以及天然產物的抗氧化活性評價[14-15]。由圖1可以看出，當稀釋倍數小于10倍時，3個品種初榨橄欖油的多酚類化合物對DPPH自由基的清除率與稀釋倍數呈現良好的量效關系，而當稀釋倍數大于10倍時，DPPH自由基清除率隨稀釋倍數增加降低緩慢。3個品種清除DPPH自由基50%的質量濃度即EC50值分別為102.66、120.66和31.33 μg/mL(表2)，表明佛奧中多酚類化合物清除DPPH自由基能力最強，城固32次之，豆果最低。

圖1 3個品種初榨橄欖油多酚類化合物的DPPH自由基清除能力

表2 清除率和螯合力達到50%時各品種的總多酚濃度 (μg/mL；n=3)

2.2.2 羥基自由基清除能力

羥基自由基是生物機體產生的活性高、毒性強的自由基，極易通過細胞膜而損傷脂質、蛋白質和DNA，因此羥基自由基清除率也是評價抗氧化劑的重要指標[16]。如圖2所示，3個品種初榨橄欖油多酚類化合物對羥基自由基有良好的清除效果，當稀釋倍數小于6倍時，佛奧多酚類化合物的羥基自由基清除率明顯高于豆果和佛奧。3個品種清除羥基自由基50%的質量濃度即EC50值分別為24.66、20.00、32.33 μg/mL(表2)，表明豆果中多酚類化合物清除羥基自由基的能力最強，城固32次之，佛奧最低。

圖2 3個品種初榨橄欖油多酚類化合物的羥基自由基清除能力

2.2.3 Fe2+螯合能力

圖3 3個品種初榨橄欖油多酚類化合物的Fe2+螯合能力

多酚類化合物能與Fe2+形成螯合物而減少機體羥基自由基的產生，因此Fe2+螯合能力是評價多酚類化合物抗氧化能力的又一重要指標[17]。由圖3可知，3個品種初榨橄欖油的多酚類化合物對Fe2+螯合率與稀釋倍數呈現良好的量效關系，當稀釋倍數為1倍時，Fe2+螯合率豆果>城固32>佛奧。3個品種Fe2+螯合50%的質量濃度即EC50值分別為10.00、5.66和13.33 μg/mL(表2)，表明豆果中多酚類化合物Fe2+螯合能力最強，城固32次之，佛奧最低。3個品種初榨橄欖油的DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力和Fe2+螯合能力與總多酚含量變化趨勢不一致，可能與單體酚的種類和含量有關[18]。

2.3總多酚和各單體酚含量與體外抗氧化活性的相關性

總多酚和各單體酚含量與體外抗氧化活性的相關性系數見表3，DPPH自由基清除能力與羥基自由基清除能力和Fe2+螯合能力顯著負相關，相關系數分別為-0.719和-0.762。羥基自由基清除能力和Fe2+螯合能力極顯著正相關，相關系數為0.961。羥基酪醇含量與DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力和Fe2+螯合能力極顯著負相關或顯著正相關，相關系數分別為-0.956、0.713和0.721；對羥基苯甲酸含量與Fe2+螯合能力顯著正相關；槲皮素含量與DPPH自由基清除能力顯著負相關，與Fe2+螯合能力顯著正相關?？偠喾雍?、咖啡酸和表兒茶素含量與抗氧化能力相關程度較低。

表3 總多酚、各單體酚含量與體外抗氧化活性的相關性系數

注：-表示負相關；*表示P<0.05；**表示P<0.01。

3 結論

本試驗對3個品種初榨橄欖油的總多酚和各單體酚含量進行了分析測定，評價其體外抗氧化活性，并采用SPSS應用軟件分析總多酚、各單體酚含量與體外抗氧化活性的相關性。結果表明，3個品種初榨橄欖油中存在多種單體酚，其含量品種間差異顯著，而總多酚含量品種間差異較小；佛奧的多酚類化合物對DPPH自由基的清除能力最強，而對羥基自由基的清除能力和Fe2+螯合能力則是豆果最強；羥基酪醇、對羥基苯甲酸和槲皮素含量與抗氧化能力極顯著或顯著相關，而總多酚含量、咖啡酸和表兒茶素含量與體外抗氧化能力的的相關程度較低。因此羥基酪醇、對羥基苯甲酸和槲皮素是初榨橄欖油中的主要抗氧化成分。

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The Content of Polyphenol and Antioxidant Property of Three Vatieties Virgin Olive Oil

Xiang Chunrong1Xu Zhou1Wang Handong1Liu Jie1Ding Chunbang1Li Tian2Yang Zeshen3
(College of Life Science,Sichuan Agricultural University1,Ya′an 625014)(College of Agronomy,Sichuan Agricultural University2,Chengdu 611130)(Liangshan Zhongze New Tech Development Co.,Ltd.,Xichang3615000)

Three varieties of virgin olive oil were studied in order to determine the content of polyphenol and evaluate the antioxidant properties of polyphenol.Besides,the correlation of total polyphenol content,indivadual polyphenol content and antioxidant property was analyzed via IBM SPSS Statistics 20.These results indicated that total polyphenol contents of three oil were 21.26,23.31 and 26.04 μg/g,respectively,not different significantly among varieties,and the contents of individual polyphenol were little.DPPH radical scavenging activity of Frantoio was the highest.However,hydroxyl radical scavenging activity and Fe2+chelating capability of Arbequina were the highest among varieties.The content of hydroxytyrosol was significantly relative or significantly posistively correlated to DPPH radical scavenging activity,hydroxyl radical scavenging activity and Fe2+chelating capability,and the correlation coefficients were-0.956,0.713 and 0.721,respectively;it was also significantly positively correlated to the content of hydroxybenzoic acid and Fe2+chelating capability.Content of quercitin was significantly negatively correlated to DPPH radical scavenging activity,and significantly positively relative to Fe2+chelating capability.Nevertheless,the contents of total polyphenol,caffeic acid and epicatechin were not highly relative to in vitro antioxidant capacity.These results showed hydroxytyrosol,p-hydroxybenzoic acid and quercetin were the major ingredients of antioxidant.

virgin olive oil,polyphenol,antioxidant properties

TS224;TQ646

A

1003-0174(2017)09-0094-05

四川省科技廳科技支撐計劃(2013NZ0047)

2016-06-27

向春蓉，女，1990年出生，碩士，橄欖油品質分析

丁春邦，女，1966年出生，教授，資源植物