特應性皮炎患者血清轉谷氨酰胺酶2特異性IgE水平與病情相關性研究

蘇惠春 孫婧 羅陽 韓悅 劉笑純 張警兮 溫禾 姚煦 王寶璽

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病醫院過敏與風濕免疫科［蘇惠春（現在福建醫科大學附屬第一醫院皮膚科，350004福州）、孫婧（現在北京大學人民醫院皮膚科）、羅陽、韓悅、劉笑純、張警兮、溫禾、姚煦］；中國醫學科學院 北京協和醫學院 整形外科醫院皮膚科（王寶璽）

·論著·

特應性皮炎患者血清轉谷氨酰胺酶2特異性IgE水平與病情相關性研究

蘇惠春 孫婧 羅陽 韓悅 劉笑純 張警兮 溫禾 姚煦 王寶璽

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病醫院過敏與風濕免疫科［蘇惠春（現在福建醫科大學附屬第一醫院皮膚科，350004福州）、孫婧（現在北京大學人民醫院皮膚科）、羅陽、韓悅、劉笑純、張警兮、溫禾、姚煦］；中國醫學科學院 北京協和醫學院 整形外科醫院皮膚科（王寶璽）

目的檢測特應性皮炎（AD）患者血清中轉谷氨酰胺酶2（TG2）特異性IgE（sIgE）的表達水平，并分析與患者病情的相關性。方法共入組77例AD患者，其中，44例≥12歲，33例＜12歲，內源性AD（特異性sIgE陰性，且總IgE＜150 kU/L）20例，外源性AD（一種以上的外源性過敏源sIgE++以上，或總IgE≥150 kU/L）49例。采用免疫捕獲及生物素標記的酶聯免疫分析法檢測77例AD患者、40例成人尋常性銀屑病患者和30例成人健康對照血清中TG2 sIgE水平。記錄AD患者年齡、病程、SCORAD評分、嗜酸性粒細胞計數和總IgE及TG2的sIgE水平。結果≥12歲AD組、＜12歲AD組、銀屑病組和對照組外周血TG2 sIgE水平（A450）分別為1.02±0.2、1.04±0.044、0.93±0.25、0.71±0.13。≥12歲AD、尋常性銀屑病和健康對照組外周血中TG2 sIgE表達水平差異有統計學意義（χ2=37.407，P＜0.001）；兩兩組間比較發現，≥12歲AD組、銀屑病組TG2 sIgE水平均顯著高于對照組（t值分別為7.38、4.83，均P＜0.001）。內源性AD組TG2 sIgE水平（1.16±0.03）高于外源性AD組（1.02± 0.20）（t=2.27，P=0.02）。AD患者組TG2 sIgE水平與年齡、病程、SCORAD評分、嗜酸性粒細胞計數、血清總IgE水平均無顯著相關性（r值分別為0.03、0.14、-0.04、-0.08和0.06，均P＞ 0.05）。結論AD患者血清中TG2 sIgE水平明顯升高，TG2可能是AD患者的一種自身抗原，但TG2 sIgE與患者的病情嚴重程度無明顯相關性。

皮炎，特應性；轉谷酰胺酶；免疫球蛋白E；自身抗原；疾病嚴重程度指數

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）發病機制復雜，皮膚屏障功能缺陷［1］、皮膚微生物菌群失調［2］、Th1/Th2/Th22免疫失調以及自身變態反應均是重要發病機制［3］。自身變態反應是特應性疾病患者針對自身抗原產生特異性IgE（sIgE）抗體的一種異常免疫應答反應［4］。目前已經發現的自身變應原有至少140余種［5］。轉谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）是一種鈣離子依賴性蛋白酶，參與形成表皮屏障等多種生物活動［6］。鑒于大多數AD患者存在皮膚屏障功能異常，我們推測除絲聚合蛋白外，作為皮膚屏障主要蛋白之一的TG2可能也參與AD發病。為此我們檢測AD患者血清中TG2 sIgE，并分析與疾病嚴重度相關指標，探討自身變態反應在AD發病中的作用。

對象與方法

一、研究對象

AD組77例，其中＜12歲33例，≥12歲44例，AD診斷采用Williams標準，所有患者就診前1個月未接受系統糖皮質激素或其他免疫抑制劑治療，2周內未服用抗組胺藥物或外用強效糖皮質激素治療；≥12歲AD組中，男17例，女27例，年齡12～58（25.42±12.48）歲；＜12歲AD組33例中，男15例，女18例 ，年齡1～11（5.63±3.02）歲。尋常性銀屑病組中，男22例，女18例，年齡18～55（27.08±6.08）歲。30例健康對照組中，男8例，女22例，年齡20～55（28.57± 6.30）歲。≥ 12歲AD組、銀屑病組和對照組間性別（χ2=5.878，P=0.053）、年齡（F=1.513，P=0.225）差異均無統計學意義。

根據血清總IgE和sIgE的水平將AD分為內源性AD（特異性sIgE陰性，且總IgE＜150 kU/L）和外源性AD（一種以上的外源性過敏源sIgE++以上，或總IgE ≥ 150 kU/L）［7］，其中內源性AD 20例，女13例，男7例，年齡（19.1±17.71）歲；外源性AD 49例，女25例，男24例，年齡（14.86±12.21）歲。兩組之間性別（χ2=1.12，P=0.29）、年齡（t=0.47，P=0.64）差異均無統計學意義。

記錄AD患者病程、SCORAD評分（包括主客觀評分），測定血清中TG2 sIgE水平，其中66例計數外周血嗜酸性粒細胞，65例檢測血清中總IgE（≥150 kU/L為異常），50例檢測戶塵螨sIgE（ImmunoCAP 250檢測系統，美國賽默飛公司）。檢測銀屑病患者血清中TG2 sIgE水平。本研究已通過中國醫學科學院皮膚病醫院倫理委員會批準（2015快審第KY009號），研究對象均簽署知情同意書。

二、材料和方法

1.材料：組織中TG2溶液（美國Fitzgerald公司，濃度1 g/L，相對分子質量72 000），生物素EZ?Link Sulfo?NHS?Bitotin（美國Thermo Scientific公司），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），包被有抗人IgE抗體的微孔板（德國福克公司）。

2.采用免疫捕獲聯合生物素標記的酶聯免疫吸附法測定血清中TG2 sIgE水平：按說明書標記生物素，取6.5 μl 10 mmol/L生物素加入到1 ml TG2中混勻，冰上放置2 h，用BCA蛋白定量試劑盒測定生物素標記的TG2蛋白濃度。向包被抗IgE抗體的微孔板中加入受試者血清50 μl，同時設陰性、陽性質控及標準品測試孔。每份血清測3個復孔，20～25℃孵育1 h；300 μl清洗液洗滌3次后加入生物素標記4 mg/L的TG2溶液100 μl，陰性及陽性質控孔中加入100 μl塵螨D1液體，封板，室溫孵育1 h；洗滌3次后加入100 μl鏈霉素親和素標記的辣根過氧化物酶結合液，室溫孵育30 min；洗滌3次后每孔加入 100 μl底物 3，3′，5，5′?四甲基聯苯胺（TMB），37℃避光孵育20 min；最后加入100 μl 2 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀450 nm處讀取吸光度（A值）。

3.統計方法：采用GraphPad PRISM軟件作圖及SPSS17.0軟件統計分析，組間性別比較采用卡方檢驗，sIgE水平比較采用多組間非參數Kruskal?Wallis檢驗，并使用Nemenyi進行兩兩比較；內外源性AD組間年齡、sIgE水平比較采用非配對t檢驗；各指標間的相關性分析采用Spearman相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、外周血TG2 sIgE表達水平比較

≥12歲AD組、＜12歲AD組、銀屑病組和對照組外周血TG2 sIgE水平（A450）分別為1.02±0.20、1.04±0.044、0.93±0.25和0.71±0.13。非參數Kruskal?Wallis檢驗發現，≥ 12歲AD組、銀屑病組和對照組外周血TG2 sIgE水平差異有統計學意義（χ2=37.407，P＜ 0.001），Nemenyi兩兩比較發現 ≥12歲AD組、銀屑病組TG2 sIgE水平顯著高于對照組（t值分別為7.38、4.83，均P＜ 0.001），且 ≥ 12歲AD組高于銀屑病組（t=2.66，P=0.008）。

圖1 特應性皮炎（AD）患者外周血血清中轉谷氨酰胺酶2（TG2）sIgE水平與年齡（1A）、病程（1B）、SCORAD 評分（1C）、外周血嗜酸性粒細胞計數（1D）、總IgE（1E）的相關性分析 TG2 sIgE水平與上述指標均無相關性

內源性AD組TG2 sIgE表達水平為1.16±0.30，外源性AD組為1.02±0.20，兩組差異有統計學意義（t=2.372，P=0.02）。

二、AD患者TG2 sIgE水平與病情相關性分析

77例AD患者SCORAD評分39.73±16.11，外周血嗜酸性粒細胞計數（0.34±0.30）×109個/L，總IgE（618.14±1 100.67）kU/L。Spearman相關性分析發現，AD患者外周血TG2 sIgE水平與年齡、病程、SCORAD評分、外周血嗜酸性粒細胞計數（65例）、總IgE水平（66例）均無顯著相關性（r值分別為0.03、0.14、-0.04、-0.08和 0.06，P值分別為 0.78、0.24、0.74、0.54和0.62）。見圖1。

討 論

自身變態反應是近幾年逐漸被關注的AD新發病機制之一，AD的自身變態反應機制研究證據包括：①AD患者血清存在針對某些自身抗原的sIgE抗體，而健康對照組則檢測不出［8?9］；②某些抗自身抗原的sIgE如抗磷脂抗體（ACL）、抗β2糖蛋白、rhMnSOD的sIgE表達水平與AD患者SCORAD評分呈正相關，具有自身抗原sIgE抗體的AD患者病情往往比未檢測到這些抗體的患者更為嚴重，而且AD患者病情發作時常可檢測到自身抗原sIgE升高［10］。

AD患者的自身過敏原大致可分為3類：①與外源性過敏原有交叉過敏的自身過敏原，如與樺樹抗原交叉過敏的肌動蛋白；②與外源過敏原無關的自身過敏原，如Hom1?Hom5；③“經典”的自身抗原：如Dsg1、BP180、核抗原等，這些抗原不僅可以誘發機體產生特異性IgG，還可誘導機體產生sIgE，并且與疾病活動度相關［4］。有研究采用噬菌體表面展示技術構建cDNA文庫，篩選出至少140種可與IgE結合的自身抗原與特應性濕疹相關，TG2屬于其中的一種［5］。Currò等［11］用實時定量 RT?PCR 方法檢測發現，慢性牙周炎患者病變組織TG2基因的表達水平高于健康人。我們發現，AD患者TG2 sIgE水平明顯高于對照組，內源性AD患者TG2 sIgE水平高于外源性AD患者，并且其水平與總IgE及塵螨sIgE水平無關，推測TG2是一種與塵螨抗原無關的自身抗原。銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，有研究發現銀屑病患者針對某些抗原的sIgE水平升高，但低于AD患者TG IgE水平［12］。我們發現尋常性銀屑病患者TG2 sIgE水平高于健康人，表明銀屑病患者體內可能存在針對TG2的自身變態反應。

自身抗原釋放機制包括以下幾個方面［13?14］：①外源性過敏原誘發皮膚炎癥反應和引起表皮免疫損傷，如塵螨抗原中含有破壞皮膚屏障的蛋白酶；②瘙癢所致的搔抓引發皮膚機械性損傷，進而導致細胞內蛋白釋放；③皮損處局部微生物定植異常，導致慢性炎癥和組織損傷致使自身抗原釋放。自身抗原暴露后，刺激機體產生針對自身抗原的變態反應。以往的研究提示，機體針對自身抗原的過敏反應是AD炎癥頑固遷延的一個重要原因，外源性過敏原通過誘導Th2型免疫反應引起急性炎癥，而自身過敏原更趨向于誘導Th1型反應，引起腫瘤壞死因子α、白細胞介素12表達升高，導致慢性炎癥反應［15?16］。TG2主要分布在表皮基底層，推測AD患者表皮屏障破壞導致基底層TG2進入真皮，引起下游免疫反應及IgE抗體釋放，從而參與疾病發生和發展。我們未發現AD患者TG2 sIgE抗體水平與嗜酸性粒細胞計數、SCORAD評分、總IgE等病情嚴重度指標相關，這可能是因為入組的樣本量偏小，或者TG2升高與別的因素相關，后期將進一步擴大樣本量。對于TG2 sIgE陽性患者，我們擬進行隨訪，觀察同一患者病情變化與血清TG2 sIgE水平的關系，尋找其可能的發病機制。

［1］Riethmuller C,McAleer MA,Koppes SA,et al.Filaggrin breakdown products determine corneocyte conformation in patients with atopic dermatitis［J］.J Allergy Clin Immunol,2015,136（6）:1573?1580.e2.DOI:10.1016/j.jaci.2015.04.042.

［2］Kobayashi T,Glatz M,Horiuchi K,et al.Dysbiosis andStaphylococcus aureuscolonization drives inflammation in atopic dermatitis［J］.Immunity,2015,42（4）:756?766.DOI:10.1016/j.immuni.2015.03.014.

［3］Bieber T.Atopic dermatitis［J］.Ann Dermatol,2010,22（2）:125?137.DOI:10.5021/ad.2010.22.2.125.

［4］Weidinger S,Novak N.Atopic dermatitis［J］.Lancet,2016,387（10023）:1109?1122.DOI:10.1016/S0140?6736（15）00149?X.

［5］Zeller S,Rhyner C,Meyer N,et al.Exploring the repertoire of IgE?binding self?antigens associated with atopic eczema［J］.J Allergy Clin Immunol,2009,124（2）:278?285,285.e1?7.DOI:10.1016/j.jaci.2009.05.015.

［6］Kl?ck C,Diraimondo TR,Khosla C.Role of transglutaminase 2 in celiac disease pathogenesis［J］.Semin Immunopathol,2012,34（4）:513?522.DOI:10.1007/s00281?012?0305?0.

［7］Tokura Y.Extrinsic and intrinsic types of atopic dermatitis［J］.J Dermatol Sci,2010,58（1）:1?7.DOI:10.1016/j.jdermsci.2010.02.008.

［8］Schmid?Grendelmeier P,Flückiger S,Disch R,et al.IgE?mediated and T cell?mediated autoimmunity against manganese superoxide dismutase in atopic dermatitis［J］.J Allergy Clin Immunol,2005,115（5）:1068?1075.DOI:10.1016/j.jaci.2005.01.065.

［9］Watanabe K,Muro Y,Sugiura K,et al.IgE and IgG（4）autoantibodies against DFS70/LEDGF in atopic dermatitis［J］.Autoimmunity,2011,44（6）:511?519.DOI:10.3109/08916934.2010.549157.

［10］Tang TS,Bieber T,Williams HC.Does"autoreactivity"play a role in atopic dermatitis?［J］.J Allergy Clin Immunol,2012,129（5）:1209?1215.e2.DOI:10.1016/j.jaci.2012.02.002.

［11］Currò M,Matarese G,Isola G,et al.Differential expression of transglutaminase genes in patients with chronic periodontitis［J］.Oral Dis,2014,20（6）:616?623.DOI:10.1111/odi.12180.

［12］Many N,Biedermann L.Adult celiac disease［J］.Praxis（Bern 1994）,2016,105（14）:803 ?810.DOI:10.1024/1661 ?8157/a002413.

［13］Hradetzky S,Werfel T,R?sner LM.Autoallergy in atopic dermatitis［J］.Allergo J Int,2015,24（1）:16?22.DOI:10.1007/s40629?015?0037?5.

［14］Barnes KC.An update on the genetics of atopic dermatitis:scratching the surface in 2009［J］.J Allergy Clin Immunol,2010,125（1）:16?29.e1?11.DOI:10.1016/j.jaci.2009.11.008.

［15］Balaji H,Heratizadeh A,Wichmann K,et al.Malassezia sympodialis thioredoxin?specific T cells are highly cross?reactive to human thioredoxin in atopic dermatitis［J］.J Allergy Clin Immunol,2011,128（1）:92?99.e4.DOI:10.1016/j.jaci.2011.02.043.

［16］James EA,Kwok WW.Autoreactive CD4（+）T cells in patients with atopic dermatitis［J］.J Allergy Clin Immunol,2011,128（1）:100?101.DOI:10.1016/j.jaci.2011.05.005.

Relationship between the serum level of transglutaminase 2?specific IgE and disease condition in patients with atopic dermatitis

Su Huichun,Sun Jing,Luo Yang,Han Yue,Liu Xiaochun,Zhang Jingxi,Wen He,Yao Xu,Wang Baoxi
Department of Allergy and Rheumatology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Su HC［current affiliation:Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China］,Sun J［current affiliation:Department of Dermatology,Peking University People′s Hospital］,Luo Y,Han Y,Liu XC,Zhang JX,Wen H,Yao X）;Department of Dermatology,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100144,China（Wang BX）

s:Yao Xu,Email:dryao xu@126.com;Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org

ObjectiveTo detect the serum level of transglutaminase 2（TG2）?specific IgE（sIgE）in patients with atopic dermatitis（AD）,and to analyze its correlation with the disease condition.MethodsA total of 77 patients with AD were enrolled into this study,including 44 patients aged≥12 years and 33 patients aged＜12 years.Of the 77 patients,20 were diagnosed with intrinsic AD,which was characterized by the absence of sIgE and total serum IgE values＜150 kU/L,and 49 with extrinsic AD characterized by positive（++）or even strongly positive sIgE for more than 1 kind of exogenous allergens,or total serum IgE values≥ 150 kU/L.Immunocapture?biotinylated detector enzyme immunoassay was performed to detect the serum level of TG2?sIgE in 77 patients with AD,40 adult patients with psoriasis vulgaris（PV）and 30healthy adult controls.Clinical data on the AD patients were recorded,including age,disease duration,SCORAD score,blood eosinophil count,levels of total IgE and TG2?sIgE.Results The serum levels of TG2?sIgE in AD patients aged≥12 years,AD patients aged＜12 years,PV patients and healthy controls were 1.02±0.2,1.04±0.044,0.93±0.25 and 0.71±0.13,respectively.Additionally,the serum level of TG2?sIgE significantly differed among AD patients aged ≥ 12 years,PV patients and healthy controls（χ2=37.407,P＜0.001）,and was significantly higher in both AD patients aged≥ 12 years and PV patients than in the healthy controls（t=7.38,4.83,respectively,bothP＜ 0.001）.Moreover,the intrinsic AD group showed significantly higher TG2?sIgE levels compared with the extrinsic AD group（1.16 ± 0.03vs.1.02 ±0.20,t=2.27,P=0.02）.The TG2?sIgE level was uncorrelated with the patients′age,disease duration,SCORAD score,blood eosinophil count or serum total IgE levels in AD patients（r=0.03,0.14,-0.04,-0.08,0.06,respectively,allP＞ 0.05）.ConclusionThe serum level of TG2?sIgE obviously increases in AD patients,so TG2 may be one kind of autoantigen in AD patients,but there is no significant correlation between the TG2?sIgE level and AD severity.

Dermatitis,atopic；Transglutaminases；Immunoglobulin E；Autoantigens;Severity of illness index

姚煦，Email：dryao_xu@126.com；王寶璽，Email：wangbx@ncstdlc.org

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.07.009

國家自然科學基金（81371735、81573045）；2014年亞美醫學基金會（MMAAP）皮膚病項目基金；江蘇省自然科學基金（BK20150166）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81371735,81573045）;Milstein Medical Asian American Partnership（MMAAP）Foundation Research Project Award in Skin Disease in 2014;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20150166）

2016?10?09）

（本文編輯：尚淑賢）