枸櫞酸咖啡因對睡眠呼吸暫停綜合癥大鼠肺功能、VEGF與胰島素樣生長因子影響研究

王麗曄，劉運秋Δ，耿賀梅，鄭麗穎，王瑞霞，修春霞

(河北聯合大學附屬開灤總醫院 呼吸內科，河北 唐山 063000)

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枸櫞酸咖啡因對睡眠呼吸暫停綜合癥大鼠肺功能、VEGF與胰島素樣生長因子影響研究

王麗曄1，劉運秋1Δ，耿賀梅1，鄭麗穎1，王瑞霞1，修春霞1

(河北聯合大學附屬開灤總醫院 呼吸內科，河北 唐山 063000)

目的 探討枸櫞酸咖啡因對睡眠呼吸暫停綜合癥大鼠肺功能、血管內皮細胞生長因子(VEGF)與胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的影響。方法 選取睡眠呼吸暫停綜合癥模型Wistar雄性大鼠80只，隨機選取20只為正常對照組，其余進行呼吸暫停綜合征模型復制，模型復制成功后，隨機分為模型組20只，實驗組20只和陽性藥組20只，實驗組予枸櫞酸咖啡因注射液5 mg/kg腹腔注射，陽性藥組給予氨茶堿3 mg/kg腹腔注射，模型組等量生理鹽水腹腔注射，每天1次，連續1周；干預結束后，比較各組大鼠的肺功能相關指標、血清VEGF、IGF-1含量及睡眠呼吸暫停相關指標。結果 與陽性藥組比較，實驗組大鼠肺功能相關指標明顯升高(P<0.05)；血清VEGF水平明顯降低(P<0.05)；血清IGF-1水平明顯升高(P<0.05)；NREM期及REM期的睡眠呼吸暫停指數明顯下降(P<0.05)。結論 枸櫞酸咖啡因能夠改善睡眠呼吸暫停綜合癥大鼠的肺功能，降低其血清VEGF水平，促進血清IGF-1的生成，使睡眠呼吸暫停指數降低。

睡眠呼吸暫停綜合癥；枸櫞酸咖啡因；肺功能；VEGF；胰島素樣生長因子

睡眠呼吸暫停綜合癥全稱睡眠呼吸暫停低通氣綜合癥(SAHS)是一種存在潛在致死性的睡眠呼吸系統疾病，以打鼾、睡眠中出現呼吸暫停為主要表現，極易誘發高血壓、冠心病、呼吸衰竭等疾病[1]。國外報道其患病率是0.3%～4%，男性高于女性[2]，發病率隨年齡的增加而增加，重度未治療者8年生存率僅為63%，因此早期給予治療干預顯得尤為重要。氨茶堿屬于甲基黃嘌呤類藥物，對中樞神經有興奮作用，能降低中樞化學感受器對CO2的刺激閾，增強由于缺氧引起的呼吸興奮。枸櫞酸咖啡因治療早產兒呼吸暫停，通過降低CO2濃度，興奮中樞神經系統，加快呼吸頻率和每分鐘通氣量，刺激呼吸中樞，增加肺血流，從而減少呼吸暫停發生的次數。研究表明[3]，枸櫞酸咖啡因對原發性的早產兒呼吸暫停有良好的臨床療效，作為搶救措施能夠有效減少患兒的病死率，且不良反應較少。但是由于本藥引進較晚，目前國內相關實驗及臨床研究此，本研究對睡眠呼吸暫停綜合癥大鼠模型進行研究，探討枸櫞酸咖啡因對睡眠呼吸暫停綜合癥大鼠肺功能、VEGF與胰島素樣生長因子的影響，為枸櫞酸咖啡因應用于臨床提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取雄性Wistar大鼠(由河北醫科大學動物實驗室提供，許可證號:130001023)80只，周齡6周，體質量180～220 g。所有大鼠均于室溫20～25 ℃，濕度55%～60%，明暗周期為12 h：12 h的環境中適應性飼養1周，投以標準飼料，大鼠自由活動與進食。

1.2 藥品與儀器 注射用異戊巴比妥鈉(上海新亞藥業有限公司，國藥準字H31021725)，注射透明質酸鈉(上海海研醫學生物技術有限公司，國藥準字S20030057)，枸櫞酸咖啡因注射液[Caffeine Citrate Injection (Peyona)，國藥準字H20130109]，氨茶堿(山東新華制藥股份有限公司，國藥準字H37022906)；泰科電極板E7509(深圳市多樂美途貿易有限公司)，RWD407動物呼吸機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，BUXCO動物肺功能分析系統(美國Buxco)，ELx800全自動酶標儀(美國biotek)。

1.3 方法

1.3.1 造模及實驗方法[4]:選取20只大鼠為正常對照組，其余大鼠適應飼養后，采用0.8%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，仰臥位，在大鼠顱骨表面植入電極板，連接改造過的睡眠呼吸檢測儀，之后暴露口腔，向舌根、咽腭弓和舌腭弓注射透明質酸鈉至大鼠出現呼吸暫停，大鼠清醒后進行分籠飼養。注射1%透明質酸鈉1 mL后，第4周監測分析大鼠清醒及睡眠狀態的呼吸暫停指數(apnea index,AI)和最長呼吸暫停時間(Ltime)，清醒期AI≥7次/h，Ltime≥14 s，睡眠期AI≥15次/h，Ltime≥16 s即為造模成功，本次所選大鼠全部造模成功。將模型大鼠隨機分為模型組、實驗組和陽性藥組各20只。實驗組大鼠給予枸櫞酸咖啡因注射液5 mg/kg腹腔注射治療，1天1次，連續1周，陽性組大鼠給予氨茶堿(山東新華制藥股份有限公司，國藥準字H37022906，生產批號：20021016)3 mg/kg腹腔注射治療，1天1次，連續1周，模型組大鼠同時期給予等量的生理鹽水腹腔注射，連續1周。

1.3.2 肺功能測定:干預后，采用動物肺功能分析系統(美國Buxco)測定各組大鼠的肺功能，計算深吸氣量(IC)、最大呼氣流速(PEF)、第0.3s用力呼氣后的容積(FEV0.3)以及潮氣量和每分鐘呼氣量(VE)。

1.3.3 血清指標檢測:于干預后采取大鼠的尾靜脈血3 mL，3000 r/min離心20 min后取上清液，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)法，通過ELx800全自動酶標儀(美國biotek)，測定血清中血管內皮生長因子(VEGF)與胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的含量。

1.3.4 睡眠呼吸暫停情況檢測:通過改造過的RWD407動物呼吸機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，記錄、分析干預后大鼠在非快速動眼期(NREM期)、快速動眼期(REM期)睡眠呼吸暫停指數(AI)、嘆息后呼吸暫停指數(PSAI)以及自發呼吸暫停指數(SPAI)。

2 結果

2.1 干預后各組大鼠的肺功能比較 干預后，實驗組與陽性藥組大鼠的肺功能均明顯改善(P<0.05)，與陽性藥組比較，實驗組IC 、PEF 、FEV0.3以及VE明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 干預后各組大鼠的肺功能比較±s)Tab.1 Comparison of the lung function before and after the ±s)

*P<0.05，與模型組比較，compared with the model group，#P<0.05，與陽性藥組比較，compared with positive drug group

2.2 干預后各組大鼠血清VEGF水平比較 干預后，實驗組與陽性藥組大鼠的血清VEGF水平均明顯改善，與陽性藥組比較，實驗組血清VEGF水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 干預后各組大鼠血清VEGF水平比較Tab.2 Comparison of VEGF of each groups ±s，pg/mL)

*P<0.05，與模型組比較，compared with the model group，#P<0.05，與陽性藥組比較，compared with positive drug group

2.3 干預后各組大鼠血清IGF-1水平比較 干預后，實驗組和陽性藥組大鼠的IGF-1水平均明顯改善，與陽性藥組比較，實驗組IGF-1水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 干預后各組大鼠血清IGF-1水平比較Tab.3 Comparison of IGF-1of each groups ±s，pg/mL)

*P<0.05，與模型組比較，compared with the model group，#P<0.05，與陽性藥組比較，compared with positive drug group

2.4 干預后各組大鼠睡眠呼吸暫停情況比較 干預后，實驗組和陽性藥組大鼠的睡眠呼吸暫停情況均明顯好轉顯著低于模型組(P<0.05)，與陽性藥組比較，實驗組NREM期及REM期的AI、PSAI、SPAI均較低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 干預后各組大鼠睡眠呼吸暫停情況比較±s，次/h)Tab.4 Comparison of rat sleep apnea ±s，times/h)

*P<0.05，與模型組比較，compared with the model group，#P<0.05；與陽性藥組比較，compared with positive drug group

3.討論

目前，我國睡眠睡眠呼吸暫停綜合癥(SAHS)的發病率為4%左右，由于其打鼾、呼吸暫停、憋醒等臨床表現多發生在夜間，很容易被忽視，一旦發現，多已伴有肺心病、呼吸衰竭、冠心病、心率失常等并發癥，對患者造成很大痛苦[5]。SAHS的病因尚不明確[6]，目前認為大多數與上呼吸道狹窄有關，肥胖、變應性鼻炎、腭垂過長過粗、鼻息肉等均可使上氣道肌肉對低氧和二氧化碳的刺激反應性降低，引起呼吸暫停。研究顯示[7]，SAHS使得機體夜間長期處于低通氣狀態，血樣飽和度不足，氣道阻塞引起呼吸功能障礙，久之可以使得肺功能下降，引起呼吸衰竭，通氣功能受到影響。血管內皮生長因子(VEGF)屬于血小板衍生生長因子家族，具有促進血管內皮增殖、調節血管結構、加速血管生成的作用，在正常人體中表達水平較低。VEGF合成及活性主要受到缺氧的調控，資料顯示[8]，SAHS導致的肺功能降低，機體處于乏氧狀態，能夠刺激VEGF及其受體的生成和表達，加速血管增殖與重建。胰島素生長因子-1(IGF-1)屬于胰島素類多肽，具有促進代謝和組織生長的作用，其合成對氧濃度有依賴性，研究發現[9]，低氧程度增加，血清中IGF-1的水平隨之降低，SAHS患者病情越嚴重，IGF-1水平越低。在本實驗中，選取SAHS模型大鼠進行研究，試圖探討枸櫞酸咖啡因對SAHS的影響極其作用過程，為枸櫞酸咖啡因更好的應用于臨床提供理論依據。

當患者從清醒進入睡眠狀態時，呼吸中樞對高CO2的反應下降，即CO2刺激的反應閥值升高，如果反應閥值足夠高，超過血CO2所能達到的最高水平，即有可能出現呼吸暫停綜合征；隨著呼吸暫停時間的延長，PaCO2逐漸升高，達到一定水平后，呼吸恢復，患者發生短暫覺醒，中樞神經系統對高CO2反應的閥值隨之降低，較高的血CO2水平即引起過度通氣，CO2降至較低水平。重新入睡后，再次發生CSA，周而復始，反復循環。氨茶堿屬于甲基黃嘌呤類藥物，對中樞神經有興奮作用，能降低中樞化學感受器對CO2的刺激閾，增加呼吸中樞對CO2的敏感性，增強缺氧引起的呼吸興奮，興奮吸氣神經元，增加呼吸頻率。

本研究結果發現，實驗組IC 、PEF 、FEV0.3以及VE與陽性藥組比較明顯升高 (P<0.05)，證實了枸櫞酸咖啡因能夠改善SAHS大鼠的肺功能。枸櫞酸咖啡因是咖啡因的一種，屬于甲基黃嘌呤類藥物，能夠興奮中樞神經系統，使神經中樞對二氧化碳的敏感性升高，同時能增加呼吸機的收縮力，促進呼吸運動，改善肺功能。曾有研究報道[10]，應用枸櫞酸咖啡因和氨茶堿對125例診斷為原發性呼吸暫停的早產兒進行治療，結果顯示枸櫞酸咖啡因比氨茶堿具有更好的臨床效果，能夠提高患兒的肺功能，且具有半衰期長、血漿濃度波動小等特點，不良反應較少，與本研究結果相似。

血清VEGF水平與SAHS的嚴重程度有關，其過度表達與慢性缺氧關系密切，同時參與心血管并發癥的發病過程，通常作為衡量SAHS嚴重程度與心血管功能狀態的指標，有研究稱[11]，SAHS患者體內內皮素和氧自由基水平增加，能夠促進VEGF水平的表達。本研究結果顯示，實驗組大鼠的血清VEGF水平與陽性藥組比較明顯降低(P<0.05)，提示枸櫞酸咖啡因能夠改善體內缺氧狀態，抑制VEGF的過度表達，對心血管功能起到保護作用。

IGF-1是促進合成與代謝的激素，研究顯示[12]，其對于心肌、呼吸肌、骨骼肌等多種細胞的凋亡具有抑制作用，但其基因轉錄表達受氧濃度的影響較大，在SAHS導致的低氧環境下，基因表達受到抑制，血清IGF-1水平隨之下降，失去對心肌細胞的保護作用。本研究結果顯示，實驗組大鼠的血清IGF-1水平與陽性藥組比較明顯升高(P<0.05)，這可能與枸櫞酸咖啡因改善肺功能的作用有關，肺功能得到恢復，體內乏氧情況好轉，對IGF-1基因抑制作用減弱，使得血清IGF-1水平升高(P<0.05)，促進DNA、RNA的表達與復制，加速蛋白合成，防止心肌細胞凋亡。

本研究結果顯示，實驗組NREM期及REM期的AI、PSAI、SPAI與陽性藥組比較均明顯下降(P<0.05)，提示枸櫞酸咖啡因能夠降低大鼠睡眠中呼吸暫停發生的頻率，改善SAHS病情。枸櫞酸咖啡因含有50%的咖啡因成分，相對于其他黃嘌呤類中樞興奮藥，具有安全范圍寬、脂溶性高、容易吸收、生物利用度高、不良反應小的優點，更適于臨床應用。

本實驗通過對80例SAHS模型大鼠肺功能相關指標、血清VEGF、IGF-1含量及睡眠呼吸暫停相關指標檢測結果進行分析，證實了枸櫞酸咖啡因具有改善睡眠呼吸暫停綜合癥大鼠的肺功能，降低其血清VEGF水平，促進血清IGF-1的生成，使睡眠呼吸暫停指數降低的作用。在下一步研究中，將進行分子機制方面研究，為本實驗所反映的現象做出進一步論證和分析。

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(編校：譚玲)

Effect of caffeine citrate on pulmonary function, VEGF and insulin-like growth factor in sleep apnea hypopnea syndrome rats

WANG Li-ye1, LIU Yun-qiu1Δ, GENG He-mei1, ZHENG Li-ying1, WANG Rui-xia1, XIU Chun-xia1

(Department of Internal Medicine Respiratory, Kailuan General Hospital of Hebei United University, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo analysis the effect of caffeine citrate on pulmonary function, vascular endothelial growth factor (VEGF)and insulin like growth factor -1 (IGF-1) in the apnea syndrome rats.Methods80 male Wistar rats were selected, 20 were randomly selected to be the control group, the rest of the rats were replicated of apnea syndrome model.The rats were randomly divided into model group, experiment group and positive drug group, 20 of each group.The experimental group was given caffeine citrate injection of 5 mg/kg intraperitoneal injection, the positive drug group was given intraperitoneal injection of aminophylline 3 mg/kg, the model group was given intraperitoneal injection of normal saline, once a day, continuously for 1 week.Pulmonary function, serum VEGF, IGF-1 levels and sleep apnea were compared after the experiment.ResultsCompared with the positive drug group, the related indexes of pulmonary function of the experimental group increased significantly (P<0.05).Serum VEGF levels decreased significantly (P<0.05).The serum IGF-1 level increased significantly (P<0.05).The sleep apnea index decreased significantly during the period of NREM and REM.(P<0.05).ConclusionCaffeine citrate can improve apnea syndrome rats lung function, reduce the serum VEGF level, promote the formation of serum IGF-1, reduce the sleep apnea index.

sleep apnea hypopnea syndrome; caffeine citrate; pulmonary function; VEGF; insulin-like growth factor

王麗曄，女，碩士，副主任醫師，研究方向：呼吸介入，E-mail：lhwliyep@126.com;：劉運秋，通訊作者,男，碩士，主任醫師，研究方向：呼吸介入，E-mail：liu236191769@126.com。

R543

A

1005-1678(2015)07-0047-04