DDR1在卵巢癌細胞中對轉移侵襲和化療抗性的調控作用

張丹瑜，鄧宇傲，劉新瓊，王玲

（深圳市人民醫院 計劃生育科，廣東 深圳518020）

DDR1在卵巢癌細胞中對轉移侵襲和化療抗性的調控作用

張丹瑜，鄧宇傲，劉新瓊，王玲

（深圳市人民醫院 計劃生育科，廣東 深圳518020）

目的探討盤狀結構域受體1（discoidin domain receptor 1，DDR 1）在卵巢癌細胞中對轉移侵襲和化療抗性的調控作用。方法選取我院2015年8月至2016年8月正在接受化療治療的40例原發性卵巢癌患者作為研究對象，在征得患者知情同意下切取病理組織并獲得卵巢癌細胞后分別通過Talen基因敲除和過表達構建功能喪失和功能獲得模型各40株，隨后在此基礎上進行轉移侵襲功能實驗以及順鉑聯合紫杉醇的化療抗性檢測實驗，以闡明其在卵巢癌細胞中對轉移侵襲和化療抗性的調控作用。結果功能獲得模型的信號通路關鍵因子 IKKbeta、 P50、 P62 的表達水平分別為 833.47 ± 5.33、 796.89 ± 5.77、 685.55 ± 1.35， 功能喪失模型分別為 678.85 ± 5.25、 633.49 ± 5.61、 547.88 ± 1.32， 組間差異有統計學意義 （P ＜0.05）。 功能喪失模型和功能獲得模型給藥前的卵巢癌細胞凋亡率、 增殖抑制率分別為 （2.50 ± 0.50） %、 （7.85 ± 0.25） %以及 （2.91 ± 0.48） %、 （8.94 ± 0.26） %，差異無統計學意義 （P＞0.05）；給藥后功能獲得模型 24 h、48 h、72 h、96 h的細胞凋亡率和增殖抑制率分別為 （20.47±1.13） %、 （47.46 ± 1.34） %、 （95.96 ± 1.38） %、 （20.18 ± 1.32） %和 （19.77 ± 1.23） %、 （27.44 ± 1.56） %、 （36.46 ±1.14） %、 （50.67 ± 1.33） %， 功能喪失模型 24 h、 48 h、 72 h、 96 h 的細胞凋亡率和增殖抑制率分別為 （5.97 ± 1.03） %、（16.88 ± 1.32） %、 （70.10 ± 1.50） %、 （10.85 ± 1.15） %和 （12.44 ± 1.31） %、 （15.89 ± 1.11） %、 （19.98 ± 1.12） %、（21.28±1.22）%，差異有統計學意義 （P＜0.05）。結論DDR 1在卵巢癌細胞中的生物功能主要涉及轉移侵襲和化療抗性調控兩方面，同時IKKbeta、P50、P62為DDR 1靶向信號通路的關鍵因子，揭示卵巢癌全新靶向作用途徑，具有重要的臨床應用價值。

盤狀結構域受體1；卵巢癌；轉移；侵襲；化療抗性

卵巢癌是目前女性最為常見的生殖器官惡性腫瘤之一，其發病率僅次于宮頸癌以及子宮體癌而位居第三位且給患者的生命安全帶來嚴重威脅［1］。由于卵巢的胚胎發育、組織解剖結構、內分泌功能復雜，使得卵巢癌早期缺乏特異性臨床表現，在被明確診斷時往往已經處于中晚期且絕大多數發生擴散轉移，喪失了最佳手術時機［2］?；熓悄壳爸委熢摷膊∽钣行У氖侄沃?，尤其是隨著基因研究的深入開展，通過調控靶向信號通路來提高化療效果成為臨床研究的熱門議題。但是，DDR1在卵巢癌化療治療過程中是否具有調控腫瘤細胞轉移的能力以及失調表達下的DDR1是否會對卵巢癌的化療抗性帶來影響目前尚不得而知。本研究分析DDR1在卵巢癌細胞中對轉移侵襲和化療抗性的調控作用，具體報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取我院2015年8月至2016年8月正在接受化療治療的40例原發性卵巢癌患者作為研究對象，患者年齡38 ～ 59 歲， 平均年齡 （48.45 ± 1.15） 歲； 病程 6 個月 ～ 2.5年，平均病程 （20.24±0.36）個月；癥狀表現：疼痛、壓迫癥狀、胃腸道不適。

1.2 診斷標準 卵巢癌診斷符合中華醫學會婦科腫瘤學分會頒布的 《常見的婦科惡性腫瘤診治指南》以下內容：①影像學檢查提示生殖器官 （包括子宮、卵巢、宮頸及陰道）包塊≥2 cm；②腫瘤標志物檢查：CA125陽性；③婦科檢查：內診發現附件腫物質硬、表面不平、活動度差；④其他檢查：陰道后穹窿穿刺液檢查或腹水細胞學檢查陽性［3］。

1.3 納入標準 ①經病理證實均為卵巢癌者；②無全身其他嚴重器質性疾病者；③無化療治療禁忌者。

1.4 排除標準 ①預期生存周期≤1個月者；②妊娠期、哺乳期患者；③不同意本研究方案者。

2 方法

2.1 卵巢癌細胞原代培養 將新鮮的上皮性卵巢癌細胞于超凈工作臺上采用無菌磷酸鹽緩沖液反復清洗8次后利用眼科剪將周圍壞死組織、血凝塊、脂肪等徹底清除，操作過程中嚴格按無菌操作規范執行。將收集到的細胞轉移至另一無菌培養皿中，利用眼科剪將其徹底剪碎，大小以1 mm×1 mm×1 mm為宜。加入0.2 mg／mL膠原酶A溶液10 mL后吹打均勻，于37℃恒溫搖床消化4 h，常溫下3 000 r／min離心15min，去除上清液后收集沉淀部分并使用無菌磷酸鹽緩沖液重懸處理，以相同離心速度離心3次后加入100 mL胎牛血清，轉移至3.5 cm培養皿中依次加入霍亂毒素 （100 ng／mL）、白血病抑制因子 LIF （25 ng／mL）、 氫化可的松 （15 μg／mL）、 胰島素 （40 μg／mL）及肝素 （4μg／mL）等細胞生長因子，于5%二氧化碳、37℃下靜置3 d后換液，依據卵巢癌細胞生長情況每隔2～3 d換液一次，待其80%匯合時傳代。首先倒掉培養液，加入雙抗生理鹽水或磷酸鹽緩沖液5～10 mL輕輕搖晃均勻后倒掉，加入0.25% ～0.35%胰酶2 mL，促使其均勻分布，待卵巢癌細胞間隙變大后停止消化。加入含有10%血清的培養液5 mL輕柔吹打，按照1∶3比例傳代培養。

2.2 功能模型構建 核酸識別單元為間隔32個恒定氨基酸序列的雙連氨基酸且與A、G、C、T有恒定的對應關系，即NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G。要想獲得卵巢癌細胞功能喪失及功能獲得模型，只需按照靶點序列將相應單元串聯克隆，其中功能喪失模型利用內切酶活性打斷目標基因，將（兩個相鄰）靶點識別模塊 （分別）克隆入真核表達載體，得到Talen質粒對，靶點識別模塊串接成功后需克隆入真核表達載體中，將T alen質粒對共轉入細胞中實現靶基因敲除［4］。而功能獲得模型則是在靶點附近序列由基因組中擴增，克隆至驗證質粒中基因上游并與基因相融合，篩選出穩定功能細胞株。

2.3 卵巢癌細胞轉移侵襲能力實驗 采用Trizol總RNA提取試劑對卵巢癌細胞總RNA進行提取，隨后取1μL滴入到15μL反轉錄反應體系之中，充分混勻后65℃1 min、30℃5 min、65℃ 30 min、98℃ 5 min、4℃ 5 min后形成反轉錄 cDNA。取1μL實施熒光定量PCR擴增，條件為95℃5 s、60℃30 s、72℃15 s，共計40個循環，最后進行mRNA相對定量計算［5］。

2.4 化療抗性檢測試驗 將功能喪失模型與功能獲得模型卵巢癌細胞置于10%牛血清培養基中，溫度37℃，待細胞融合≥80%后制備成為單細胞混懸液［6］。對細胞濃度進行計算后接入細胞培養孔板常溫下孵育24 h，加入順鉑聯合紫杉醇，具體給藥方案如下：順鉑75 mg／m2＋紫杉醇 85 mg／m2，孵育箱中孵育48 h后加入MTT溶液，培養5 h后測定卵巢癌細胞活性［7－8］。去除培養液后加入PBS緩沖液，甲醛固定后加入染色液，染色5min后采用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

2.5 觀察指標 ①DDR1信號通路關鍵因子，包括 IKKbeta、P50、P62，采用Western Blot檢測；②卵巢癌細胞化療抗性，包括給藥前，以及給藥后24 h、48 h、72 h、96 h五個時段，分別采用四唑鹽比色法、流式細胞術進行測定。

2.6 統計學方法 本研究所有數據均采用SPSS 17.0統計軟件進行處理，計量資料以均數 ±標準差 （±s）表示，采用t檢驗，重復測量數據采用方差分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 不同模型下DDR1表達水平比較 功能獲得模型信號通路關鍵因子IKKbeta、P50、P62的表達水平均顯著高于功能喪失模型，差異有統計學意義 （P＜0.05），見表1。提示臨床DDR1在卵巢癌細胞中具有調控轉移侵襲的能力。

表1 不同模型下DDR1表達水平比較 （±s）

表1 不同模型下DDR1表達水平比較 （±s）

分組 n IKKbeta P50 P62功能獲得模型 40 833.47±5.33 796.89±5.77 685.55±1.35功能喪失模型 40 678.85±5.25 633.49±5.61 547.88±1.32 t 17.502 17.948 13.756 P 0.000 0.000 0.000

表2 不同模型下細胞凋亡率及細胞增殖抑制率比較 （±s，%）

表2 不同模型下細胞凋亡率及細胞增殖抑制率比較 （±s，%）

分組 n細胞增殖抑制率功能喪失模型 40功能獲得模型 40 t P細胞凋亡率給藥前 24h 48h 72h 96h 給藥前 24h 48h 72h 96h 2.50±0.50 5.97±1.03 16.88±1.32 70.10±1.50 10.85±1.15 7.85±0.25 12.44±1.31 15.89±1.11 19.98±1.12 21.28±1.22 2.91±0.48 20.47±1.13 47.46±1.34 95.96±1.38 20.18±1.32 8.94±0.26 19.77±1.23 27.44±1.56 36.46±1.14 50.67±1.33 0.672 5.804 9.137 7.484 4.992 1.037 3.068 5.239 6.413 7.008 0.318 0.002 0.000 0.000 0.008 0.064 0.017 0.003 0.000 0.000

3.2 不同模型下細胞凋亡率及細胞增殖抑制率比較 給藥前功能獲得模型的細胞凋亡率以及細胞增殖抑制率稍高于功能喪失模型，但組間差異無統計學意義 （P＞0.05）；給藥后24 h、48 h、72 h、96 h四個時段，功能獲得模型的細胞凋亡率、增殖抑制率均顯著高于功能喪失模型，差異有統計學意義 （P＜0.05）；見表2。提示DDR1具有調控卵巢癌細胞化療抗性的作用。

4 討論

卵巢癌作為目前我國女性最為常見的惡性腫瘤之一，其治療一直是困擾臨床的棘手問題。雖然化療治療能夠取得較為理想的療效，提高了卵巢癌患者的生存率，但是隨著用藥時間的延長，化療抗性問題不可避免地發生，給臨床治療工作的開展帶來嚴重阻礙［9］，如何降低化療抗性，提高臨床療效成為當務之急。

本研究結果顯示，功能獲得模型信號通路關鍵因子IKKbeta、P50、P62的表達水平顯著高于功能喪失模型，組間差異有統計學意義 （P＜0.05）。化療抗性實驗證實給藥前功能獲得模型的細胞凋亡率以及細胞增殖抑制率稍高于功能喪失模型，但組間差異無統計學意義 （P＞0.05）；給藥后功能獲得模型的卵巢癌細胞凋亡率、增殖抑制率均顯著高于功能喪失模型，差異有統計學意義 （P＜0.05）。提示DDR1在卵巢癌細胞轉移侵襲和化療抗性調控中扮演著至關重要的角色，尤其是DDR1功能獲得下化療抗性明顯下降，無論是卵巢癌細胞凋亡率還是增殖抑制率均明顯上升，提示臨床IKKbeta、P50、P62為DDR1重要的靶向信號通路關鍵因子，能夠調節卵巢癌細胞的轉移侵襲以及化療抗性，給臨床治療工作提供了全新的靶向調控思路。原因在于DDR1為受體酪氨酸激酶，胞外區均含有一個由155個氨基酸構成的圓盤狀結構，在其基因組中包含有17個外顯子，可被蛋白酶裂解并與IKKbeta、P50、P62受體相結合，活化誘導卵巢癌細胞表達，繼而增強其活性［10］。在本研究中，DDR1功能獲得模型的IKKbeta、P50、P62表達水平均明顯提高，促使正常卵巢細胞的活性得到增強，抑制癌細胞的轉移和侵襲。而在給藥后由于卵巢癌細胞IKKbeta、P50、P62表達水平降低，其活性受到抑制，化療藥物產生的殺傷效果更佳，因此在細胞凋亡率、增殖抑制率上均優于功能喪失模型，提示DDR1在包括卵巢癌在內的惡性腫瘤生長、浸潤、轉移過程中均發揮了重要的作用。此外，本研究著眼點在于探尋能同時作用于卵巢癌轉移復發和化療抗性的關鍵分子并闡明其上下游分子機制和具體的信號通路，首次研究DDR1在卵巢癌中的生物功能主要涉及轉移侵襲和化療抗性調控兩個方面，闡述DDR1在卵巢癌中轉移和化療敏感功能發生的可能共同信號通路，驗證DDR1在卵巢癌細胞株中的靶向關系，并由此闡明除了膠原激活外DDR1在卵巢癌中失調表達的新分子機制，彌補了此領域研究的空白，具有一定的創新性。

綜上所述，DDR1在卵巢癌細胞中的生物功能主要涉及轉移侵襲和化療抗性調控兩方面，并且IKKbeta、P50、P62為DDR1靶向信號通路關鍵因子，揭示卵巢癌全新靶向作用途徑，具有重要的臨床應用價值。

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Regulation Function of DDR1 on Metastasis,Invasion and Chemotherapy Resistance in Ovarian Cancer Cells

ZHANG Danyu,DENG Yuao,LIU Xinqiong,WANG Ling
(Departmentof Family Planning,Shenzhen People's Hospital,Shenzhen 518020,China)

ObjectiveTo explore the regulation function of discoidin domain receptor 1(DDR1)on metastasis,invasion and chemotherapy resistance in ovarian cancer cells.MethodsFrom August2015 to August2016,40 cases of primary ovarian cancer patients undergoing chemotherapy were selected as the research objects.With patients' informed consent,pathological tissue was cut off to obtain the ovarian cancer cells.Gain-of-function model(40 strains)and loss-of-function model(40 strains)were respectively constructed by over expression and knockout of Talen gene.The metastasis-invasion function test and the resistance test of cisplatin combined with paclitaxel were conducted to clarify the regulation of metastasis,invasion and chemotherapy resistance in ovarian cancer cells.ResultsThe expression levels of signal pathway key factors IK Kbeta,P50 and P62were833.47±5.33,796.89±5.77 and 685.55±1.35 in gain-of-function model,and 678.85±5.25,633.49±5.61 and 547.88±1.32 in loss-of-function model,with statistical differences between two different models(P＜0.05).Before drug administration,no statistical difference was found between loss-of-function model and gain-of-function model in the apoptosis rate of ovarian cancer cell[(2.50±0.50)%vs.(2.91±0.48)%]or the proliferation inhibition rate[(7.85±0.25)%vs.(8.94±0.26)%],P＞0.05;24 h,48 h,72 h and 96 h after drug administration,the cell apoptosis rates of gain-of-function model were(20.47±1.13)%,(47.46±1.34)%,(95.96±1.38)%and(20.18±1.32)%respectively,while the cell apoptosis rates of loss-of-function model were(5.97±1.03)%,(16.88±1.32)%,(70.10±1.50)%and(10.85±1.15)%respectively,with statistical differences between two different models(P＜0.05);24 h,48 h,72 h and 96 h after drug administration,the proliferation inhibition rates of gain-of-function model were(19.77±1.23)%,(27.44±1.56)%,(36.46±1.14)%and(50.67±1.33)%respectively,while the proliferation inhibition rates of loss-of-function model were(12.44±1.31)%,(15.89±1.11)%,(19.98±1.12)%and(21.28±1.22)%respectively,with statistical differences between two different models(P＜0.05).Conclusions The biological function of DDR1mainly involves in metastasis,invasion and chemotherapy resistance in ovarian cancer cells.IKKbeta,P50 and P62 are the key factors of targeting signaling pathway,which suggests a novel targeting pathway for ovarian cancer,and has important clinical application value.

Discoidin domain receptor1;Ovarian cancer;Metastasis;Invasion;Chemotherapy resistance

R737.32

A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.10.1361

2017－07-27

廣東省省級科技計劃項目 “miR－199a啟動子超甲基化誘導DDRI過表達調節卵巢癌轉移侵襲及化療抗性的研究” （項目編號：2014A020212428）

張丹瑜 （1981－），女，廣東梅州人，本科學歷，主治醫師，擅長不孕不育、宮腔鏡及宮腹腔鏡手術。

（責任編輯：常海慶）