阿魏酸鈉對MCAO小鼠腦缺血再灌注損傷神經細胞保護作用

●李廣意 趙娟

阿魏酸鈉對MCAO小鼠腦缺血再灌注損傷神經細胞保護作用

●李廣意 趙娟

目的：觀察阿魏酸鈉對MCAO小鼠缺血再灌注損傷的保護作用Caspase-3表達的影響。方法：采用線栓法阻塞小鼠大腦中動脈（middlcerebralartery,MCAO）建立局灶性腦缺血實驗模型，觀察阿魏酸鈉（sodium ferulate,SF）灌胃及腦缺血再灌注損傷后小鼠的神經行為學評分及腦梗死體積的影響；分別采用TTC染色、FJB染色細胞凋亡的數量改變。結果：TTC染色顯示空白組未見腦梗死灶,模型對照組、阿魏酸鈉組腦梗死體積百分比分別有改善。FJB結果顯示細胞凋亡減少。結論：阿魏酸可降低神經細胞的損傷，降低細胞凋亡的發生，并可通過抗氧化和抗凋亡作用協同起到保護作用。

缺血再灌注；阿魏酸；腦梗死率

由于老齡化人口的增加，腦血管病的發病率急劇增高，腦血管疾病也是危害人類健康的主要疾病之一[1],在腦血管性疾病當中又以缺血性血管疾病最為常見,深入了解缺血性腦血管疾病的病理生理基礎過程及其臨床表現是正確預防和治療腦血管性疾病的前提[2]，根據腦缺血發生的原因不同可以分為腦血栓形成,腦栓塞及血液動力學障礙引起的腦缺血.根據腦缺血的嚴重程度可分為完全性腦缺血和不完全性腦缺血(腦供血不足).充分認識腦血管病的嚴重性，提高腦血管病的治療與預防水平、降低腦中風的發病率、致殘率和死亡率是當務之急[3]。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

健康昆明小鼠（湖南期萊克景達實驗動物公司）提供，TTC（2,3,5—氯化三苯基四氮唑）購自南京建成科技有限公司，阿魏酸(sodiumferulate SF)購自aladdin industrial corporation。用生理鹽水配制成阿魏酸鈉。

1.2 實驗動物分組及給藥方法

分組與模型制備：健康昆明小鼠60只，體重為（28±5）g，雄性，隨機分為3組，即假手術組、模型對照組、阿魏酸鈉組(5ml/kg)、每組20只，模型進行后神經行為學評分分；腦梗死體積的測定；小鼠造模2h后灌胃，灌胃量均為5ml/kg，2次/d，連續7d，而模型對照組給予等體積生理鹽水。

1.3 動物模型制備過程

動物模型制備：取長2cm魚線,在距一端0.7cm處做一標記。采用線栓造模方法并進行部分改良[1]，具體操作步驟如下：用三溴乙醇和阿托品對小鼠進行腹腔注射麻醉，仰臥位固定，再在頸部正中切口。用鑷子剝離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA）。假手術正常組即到此為止。分別用彈性橡皮阻斷CCA和 ECA主干的近心端，阻斷血流，同時在CCA處留一根手術線以備用。在ECA近CCA分叉口處用銀針扎一小口，將預先處理過的魚線插入,用鑷子輕輕將魚線沿ECA、ICA，送入大腦中動脈（MCA）起始部，直至感覺有輕微阻力時停止，此時大腦中動脈主干血流已經中斷。用手術線扎緊以固定魚線。此時魚線插入深度約為0.7cm。用100w的燈泡照射小鼠以保持體溫。缺血1h后，將魚線拔出，恢復血流，實現缺血再灌注。術畢縫合頸部皮膚。

1.4 造模成功指標

待小鼠麻醉清醒后，用按照Longada等的五分制評分標準進行分級評分；無明顯神經損傷癥狀為0分，不能完全伸展對側前爪為1分，向對側轉圈為2分，向對側傾倒為3分，不能自發行走、意識喪失為4分。1-3分者則為造模成功，留用。0分或4分者則為造模不成功。

2 結果

2.1 造模結果

各組小鼠均出現右側Horner征；左側前肢不能前伸，爬行時向左側傾倒或向左側轉圈；排除0分、4分的小鼠，將神經功能缺損評分為1-3分的小鼠保留，納入統計分析。

2.2 對小鼠腦梗死體積的影響

表1 各組小鼠神經功能評分、腦梗死體積的比較(n=10,x±s )

2.3 TTC染色觀察梗死體積

圖1 生理鹽水組

圖2 阿魏酸鈉組

2.4 FJB染色

圖1 生理鹽水組

圖2 阿魏酸鈉組

3 結論

在實驗過程中我們發現，動物的體重應選擇在25g以上健康的小鼠。縮短手術時間和準確掌握魚線進位深度和角度是模型成功的關鍵，該法操作相對簡便，節省了時間。并在Zea Longa法介紹[4]的線栓造模方法進行改良，采用彈性橡皮阻斷CCA 血流，減少對血管的損傷。同時采用銀針扎口，使血管開口口徑小而明顯，便于魚線插入。手術會導致動物活動次數減少、飲食困難，進而使小鼠死亡率上升。在術后給小鼠灌以葡萄糖水，以及時補充能量，提高術后小鼠的存活率。海馬是認知、學習功能的重要腦區，又是腦缺血時損傷最敏感部位[5]。如果能提高SF的濃度，增加其在海馬中的含量，將大大有助于SF發揮中樞神經的保護作用。本實驗通過神經學評分SF對神經損傷的保護作用，結果顯示，阿魏酸鈉組灌胃7d后具有明顯的促進腦缺血后神經功能恢復的作用，并能明顯減小腦梗死體積，對小鼠神經損傷均能起保護作用，其改善缺血再灌注后腦組織梗死神經功能損傷的機制可能與清除氧自由基有關。

（作者單位：長沙醫學院科研實驗中心）

[1]廖維靖,劉淑紅,范明,等.線栓阻斷大鼠總動脈制作缺血性腦損傷模型的改良[J].中華物理醫學與康復雜志,2002,24(6):345-348.

[2].Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without eraniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1);84-91.

[3]李廣意,曾杰,趙娟等小鼠活體灌注顯示細微腦血管的方法[J].解剖學雜志,2013,36(3):20.

[4]迪麗努爾·沙比托夫,朱毅忠紅花黃色素對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國中醫藥信息雜志,2006,13(2):128.

[5]周琴,廖維靖,楊萬同等阿魏酸鈉促進局灶性腦缺血再灌注后神-血管生成作用的研究[J].中國康復醫學雜志,2006,21(3):33.

李妍

李廣意（1977～），女，實驗師，研究方向為神經解剖學。

湘財教指〔2015〕54號15C0146長醫研[2014]2號KY201440

湘財教[2014]85號14C0130