黑果枸杞多糖對中波紫外線誘導HaCaT細胞光損傷的保護作用

任立汆 加楊娥 燕華玲 王永 郭硯 哈筱梅 朱世文 王剛810000西寧，青海大學附屬醫院皮膚科

·論著·

黑果枸杞多糖對中波紫外線誘導HaCaT細胞光損傷的保護作用

任立汆 加楊娥 燕華玲 王永 郭硯 哈筱梅 朱世文 王剛810000西寧，青海大學附屬醫院皮膚科

目的探討黑果枸杞多糖對HaCaT細胞光損傷的預防作用及機制。方法采用超聲輔助水提法提取柴達木黑果枸杞中的多糖成分。體外培養的HaCaT細胞分為3組，對照組：正常培養，不做其他處理；中波紫外線（UVB）組：30 mJ/cm2UVB照射；實驗組：30 mJ/cm2UVB照射前6 h加入2 g/L黑果枸杞多糖溶液。照射1 h后繼續培養12 h，倒置顯微鏡觀察細胞形態，MTS法測定細胞增殖，流式細胞儀測定細胞凋亡率，酶標法檢測細胞丙二醛和谷胱甘肽過氧化物酶含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力，ELISA法檢測上清液和細胞中白細胞介素1（IL?1）和腫瘤壞死因子α（TNF?α）水平。結果與對照組相比，UVB組細胞形態模糊不清，出現死亡漂浮現象；實驗組細胞腫脹，但形態尚清楚。MTS結果顯示，3組間細胞增殖吸光度值差異有統計學意義（F=48.88，P＜0.01），其中UVB組（1.72±0.12）顯著低于對照組（2.34±0.11），實驗組（2.11±0.10）又顯著高于UVB組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。UVB組細胞凋亡率（82.41%±2.49%）顯著高于對照組（3.98%±0.19%）和實驗組（22.79%±0.97%），實驗組細胞凋亡率明顯高于對照組，各組間比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。UVB組與對照組比較，丙二醛含量明顯上升，SOD活性、谷胱甘肽過氧化物酶含量、CAT活性明顯下降（均P＜0.05）。同時，UVB組較對照組上清液中IL?1和TNF?α含量及細胞中TNF?α含量均明顯升高（均P＜0.05），但細胞中IL?1差異無統計學意義（P＞0.05）。結論黑果枸杞多糖對HaCaT細胞的光損傷有保護作用，其保護機制可能與減少細胞炎癥物質的合成和分泌及減少自由基有關。

枸杞；多糖類；角蛋白細胞；紫外線；氧化性應激；白細胞介素1；腫瘤壞死因子α

柴達木黑果枸杞生長于青海柴達木盆地海拔2 600～3 000 m沙漠地帶，系茄科枸杞屬，可食用可入藥，《晶珠本草》中記載黑果枸杞用于治療心臟病、停經等病癥［1］。已有研究證實［2?6］，黑果枸杞中富含花色素，可以消除自由基，抗氧化。黑果枸杞多糖是黑果枸杞果實中發揮生物學作用的重要成分之一，目前研究大多集中在降血糖、抗疲勞、調節免疫等方面，抗衰老、抗氧化方面研究較少。中波紫外線（UVB）是引起皮膚光老化的主要因素，我們探討黑果枸杞多糖對UVB誘導HaCaT細胞光損傷的保護作用及其機制。

材料與方法

一、主要試劑及儀器

柴達木黑果枸杞（青海某茶行），HaCaT細胞（南京凱基生物科技發展有限公司）。胎牛血清、DMEM［英濰捷基（上海）貿易有限公司］，雙抗、胰酶、MTS比色法試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），細胞丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?Px）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），腫瘤壞死因子α（TNF?α）試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司），人白細胞介素1（IL?1）試劑盒（北京城林生物科技有限公司），X?Mark型BIO?RAD酶標儀（美國BIO?RAD公司），TL20W/12紫外線UVB燈管（荷蘭Philips公司），UVB輻照度監示器（臺灣路昌電子企業股份有限公司）。

二、實驗方法

1.黑果枸杞多糖的提取：稱取干燥后粉碎的黑果枸杞粉末50 g，加三氯甲烷∶甲醇（2∶1）500 ml，60℃回流脫脂2次，每次40 min；過濾后濾渣加入80%乙醇500 ml，70℃回流脫小分子糖、苷類物質及黃酮類物質2 h，重復2次；濾渣中加入蒸餾水（液固比20∶1），72 ℃、200 W超聲30 min，重復3次，收集上清液；旋轉減壓濃縮上清液后加入95%乙醇至濃度為80%，攪拌，4℃過夜。6 000×g離心10 min，將沉淀再溶于蒸餾水中，即得粗多糖溶液。加入粗多糖溶液20%體積的Sevag試劑（三氯甲烷∶正丁醇=5∶1），振蕩20 min，6 000 ×g離心10 min，收集上清液，重復3次。上清液旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥，獲得枸杞多糖粉末。

2.黑果枸杞多糖含量測定：①制備對照品溶液：精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品50 mg，加蒸餾水至50 ml，搖勻，即得1 g/L的對照品溶液；②待測溶液的配制：精確稱取黑果枸杞多糖粉末50 mg，加蒸餾水至50 ml，搖勻，即得待測溶液；③確定最大吸收波長：精確吸取對照品溶液和待測溶液各1.0 ml，加入5%苯酚溶液1 ml，搖勻，迅速加入濃硫酸5 ml，混勻，室溫靜置30 min待其冷卻。以蒸餾水為空白組，在400～600 nm波長范圍內使用酶標儀分別掃描對照品和待測溶液，確定最大吸收波長為485 nm；④繪制標準曲線：分別精確吸取對照品溶液1、2、3、4、5 ml，加雙蒸水至50 ml，在485 nm波長下測各濃度葡萄糖的吸光度（A值），做葡萄糖標準曲線（y=5.96 x+0.1163，R2=0.9978）；⑤測定多糖的含量：分別精確移取枸杞多糖溶液1 ml，蒸餾水定容于25 ml容量瓶，吸取1 ml枸杞多糖溶液，在485 nm下測A值，由回歸方程計算多糖含量為0.3 mg，所得粉末中黑果枸杞多糖含量為30%。以含10%胎牛血清的DMEM培養基為溶劑配制黑果枸杞多糖溶液，并用0.22 μm孔徑過濾器過濾，現配現用。

3.細胞培養及實驗分組：以含10%胎牛血清的DMEM為培養基（含10 U/ml青霉素和10 U/ml鏈霉素），將HaCaT細胞接種于培養瓶后，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中，當細胞達90%融合時傳代，取處于對數生長期的細胞用于實驗。當HaCaT細胞達到85%～90%融合時，將培養瓶內的細胞按每孔1×106個細胞分別鋪板到96孔板或6孔板中繼續培養。當細胞達80%～90%融合時，將HaCaT細胞隨機分為3組，即對照組（正常培養，不做其他處理）、UVB組（30 mJ/cm2UVB照射）和實驗組（2 g/L黑果枸杞多糖溶液+30 mJ/cm2UVB照射）。實驗組于UVB照射前6 h將2 g/L黑果枸杞多糖溶液加入細胞培養基中，對照組用錫紙包住置暗處。照射前，打開UVB組和實驗組的細胞培養板蓋，在預設好的UVB輻射儀中照射1 h，然后用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3遍，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基。

UVB劑量選擇：96孔板內HaCaT細胞達到80% ～90%融合時，在室溫下，分別采用0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 mJ/cm2UVB照射細胞，照射后均培養12 h，MTS檢測細胞增殖率。以未照射組細胞增殖率為100%，計算各組細胞增殖率，增殖率 =［1-（A對照組-A照射組）/A對照組］× 100%，選擇增殖率為50%的實驗組的UVB照射劑量為實驗劑量，即30 mJ/cm2。

黑果枸杞多糖溶液濃度選擇：加入含不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 g/L）黑果枸杞多糖的培養基6 h后，吸出各組培養基，用少量無菌PBS覆蓋，在預設好的UVB輻射儀中照射1 h，然后用PBS洗3遍，加入DMEM培養基繼續培養12 h后進行MTS法檢測細胞增殖率，根據檢測結果，選擇最佳濃度1.6 g/L，此時增殖率最高。再用1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4 g/L黑果枸杞多糖重復上述試驗，根據檢測結果，選擇增殖率最高的2 g/L作為實驗濃度。

4.MTS法檢測細胞增殖：96孔板內HaCaT細胞達到80%～90%融合時，將細胞進行如上分組處理，繼續培養12 h，顯微鏡下觀察。每孔加入MTS溶液20 μl，37 ℃、5%CO2培養箱繼續孵育3 h。終止培養后，酶標儀上選擇490 nm波長測定并記錄各孔A值。每組單獨重復6次。

5.流式細胞儀檢測細胞凋亡：6孔板內HaCaT細胞達到80%～90%融合時，將細胞進行如上分組處理后，繼續培養12 h，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化，提前預冷的PBS洗2次，將細胞重懸于100 μl緩沖液，加入5 μl膜聯蛋白V?異硫氰酸熒光素和5 μl碘化丙錠（PI），輕輕混勻，避光室溫反應15 min，加入400 μl緩沖液，1 h內用流式細胞儀檢測。

6.酶標法檢測丙二醛、SOD、GSH?Px和CAT：6孔板內HaCaT細胞達到80%～90%融合時，對各組細胞處理同上。培養12 h后，收集上清液及細胞，按照試劑盒測定說明檢測SOD和CAT活性、GSH?Px和丙二醛含量。每組單獨重復6次。

7.ELISA法檢測IL?1和TNF?α：6孔板內HaCaT細胞達到80%～90%融合時，將細胞進行如上分組處理。培養12 h后，收集上清液，胰酶消化，PBS洗3次，離心收集細胞，分別按照試劑盒說明檢測上清液及細胞中IL?1和TNF?α水平，每組單獨重復6次。

三、統計學處理

采用SPSS20.0統計學軟件，正態分布的計量資料以±s表示。采用單因素方差分析進行多組間比較，采用Student?Newman?Keuls（SNK）分析進行兩兩組間比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、黑果枸杞多糖預處理對UVB誘導的HaCaT細胞增殖抑制的影響

如圖1所示，與對照組細胞相比，UVB組細胞形態模糊不清，出現死亡漂浮現象；實驗組細胞腫脹，但形態尚清楚。3組間細胞增殖（A值）差異有統計學意義（F=48.88，P＜0.01）。UVB組細胞增殖（A值）（1.72±0.12）顯著低于對照組（2.34±0.11），差異有統計學意義（P＜0.05），實驗組（2.11±0.10）顯著高于UVB組（P＜0.05），但實驗組與對照組間差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗組細胞增殖率（90.38%±0.61%）顯著高于UVB照射組（73.67%±2.25%），差異有統計學意義（t=17.55，P＜0.05）。

圖1 倒置顯微鏡下觀察黑果枸杞多糖和中波紫外線（UVB）對HaCaT細胞形態的影響（×400） 1A：對照組細胞貼壁生長，形態清楚；1B：UVB組細胞形態模糊不清，出現核固縮及死亡漂浮現象；1C：實驗組細胞腫脹，但形態尚清楚

二、黑果枸杞多糖預處理對UVB誘導HaCaT細胞凋亡的影響

如圖2所示，UVB組細胞凋亡明顯高于對照組和實驗組，3組間細胞凋亡率差異有統計學意義（F=4 526.48，P＜0.01）。UVB組細胞凋亡率（82.41%±2.49%）顯著高于對照組（3.98%±0.19%）和實驗組（22.79%±0.97%），實驗組細胞凋亡率明顯高于對照組，各組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。

三、黑果枸杞多糖預處理對UVB照射HaCaT細胞丙二醛、SOD、GSH?Px和CAT表達的影響

如表1所示，UVB組與對照組比較，丙二醛含量明顯上升，SOD活性、GSH?Px含量、CAT活性明顯下降（均P＜0.05）。實驗組與UVB組比較，丙二醛含量明顯降低，SOD活性、GSH?Px含量、CAT活性明顯升高（均P＜0.05）。

四、黑果枸杞多糖預處理對UVB照射HaCaT細胞IL?1和TNF?α表達的影響

如表1所示，UVB組與對照組比較，上清液中IL?1和TNF?α含量及細胞中TNF?α含量均明顯升高（均P＜0.05），細胞中IL?1差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗組與UVB組比較，上清液及細胞中TNF?α含量明顯下降，細胞中IL?1升高（均P＜0.05），上清液中IL?1差異無統計學意義（P＞0.05）。

討 論

枸杞多糖在黑果枸杞中含量較低，但相對分子量大、結構復雜，現研究分離純化的多糖成分有水溶性多糖LRGP1、阿拉伯半乳聚糖蛋白（LRGP3）、LRGP4?A和免疫活性果膠（LRGP5），LRGP4?A1?4為中性多糖，LRGP5為酸性多糖［7］。Lv等［8］在黑果枸杞中分離出LRP4?A，后者主要由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖（1∶7.6∶0.5∶8.6）及微量的木糖構成。Gong等［1］研究顯示，黑果枸杞多糖中的LRGP3可以恢復環磷酰胺處理的小鼠血清中IL?2、IL?6和TNF?α的水平及T細胞和B細胞的免疫應答，說明黑果枸杞多糖具有潛在的免疫作用。

細胞凋亡為細胞對外界損傷的重要防御機制。本研究顯示，UVB輻射HaCaT細胞后，細胞形態模糊不清，可見死亡漂浮細胞，細胞增殖下降，細胞凋亡率明顯升高。黑果枸杞多糖預處理后的實驗組與未經處理的UVB照射組相比，HaCaT細胞形態明顯恢復，細胞增殖率升高，凋亡率也明顯降低。提示黑果枸杞多糖能保護HaCaT細胞抑制UVB誘導的細胞凋亡。

圖2 流式細胞儀檢測各組HaCaT細胞凋亡 UVB組（2B）細胞凋亡率明顯高于對照組（2A）和實驗組（2C）

表1 各組HaCaT細胞丙二醛含量、SOD活性、GSH?Px含量、CAT活性及IL?1和TNF?α水平比較（±s）

表1 各組HaCaT細胞丙二醛含量、SOD活性、GSH?Px含量、CAT活性及IL?1和TNF?α水平比較（±s）

注：n=6。a：UVB組與對照組比較，P ＜ 0.05；b：實驗組與UVB組比較，P ＜ 0.05。SOD：超氧化物歧化酶；GSH?Px：谷胱甘肽過氧化物酶；CAT：過氧化氫酶；IL?1：白細胞介素1；TNF?α：腫瘤壞死因子α

組別對照組UVB組實驗組F值P值丙二醛含量（nmol/g）2.13±0.32 4.01±0.28a 1.07±0.34b 131.93＜0.01 SOD活性（U/mg）27.53±5.98 16.77±3.27a 25.53±5.17b 7.92＜0.01 GSH?Px含量（μmol/g）30.03±4.23 14.25±2.48a 23.06±2.72b 35.83＜0.01 CAT活性（U/ml）25.17±3.32 8.50±2.34a 16.93±2.57b 54.21＜0.01 IL?1（ng/L）上清液11.67±1.76 21.62±2.69a 20.48±5.77 12.23＜0.01細胞24.45±7.10 24.48±8.46 37.10±2.03b 7.61＜0.01 TNF?α（ng/L）上清液13.36±1.84 21.21±2.78a 14.45±2.15b 20.62＜0.01細胞4.30±1.07 11.47±0.96a 5.04±0.78b 104.03＜0.01

UVB對皮膚的損傷主要與其產生的活性氧簇（ROS）造成的氧化應激有關。人體內酶類抗氧化系統主要由SOD、GSH?Px和CAT等體內自生的抗氧化酶組成。當紫外線過量照射時，SOD和CAT活力、GSH?Px含量均下降，細胞對ROS清除能力下降，皮膚內產生較多的ROS，體內的氧化與抗氧化系統平衡遭到破壞，多余ROS可引起皮膚組織內脂質、DNA、蛋白質等成分的損傷，破壞皮膚細胞結構及各種生物代謝功能，從而引起光老化、誘發皮膚癌等［9］。丙二醛是膜過氧化最重要的產物，它的產生還能加劇膜損傷，因此可作為膜受損程度的檢測指標。ROS可觸發線粒體內膜上的小孔道開放，水分子進入線粒體基質使之腫脹，導致外膜破裂，從而導致細胞凋亡［10］。本研究顯示，UVB照射HaCaT細胞后，丙二醛含量明顯上升，SOD活力、GSH?Px含量、CAT活力明顯下降，說明UVB輻射后細胞出現氧化損傷。黑果枸杞多糖預處理后的實驗組較未經處理的UVB照射組SOD活力、GSH?Px含量、CAT活力明顯升高，丙二醛含量明顯下降，提示黑果枸杞多糖可提高細胞清除氧自由基的能力，減輕ROS所致的細胞損傷，說明黑果枸杞多糖通過抗氧化作用保護HaCaT細胞，減輕UVB引起的光損傷。

本研究顯示，UVB輻射細胞后，細胞內IL?1含量無明顯變化，但上清液中IL?1、上清液及細胞中TNF?α含量明顯升高。Marionnet研究顯示［11］，UVB照射對角質形成細胞內IL?1無影響，但可增加IL?1及TNF?α的釋放，本研究結果與之相符。紫外線照射可使角質形成細胞釋放IL?1和TNF?α，這些細胞因子具有介導炎癥反應、調節免疫應答和誘導細胞凋亡等生物學作用［12］。IL?1誘導細胞的凋亡并通過激活JNK和p38MAPK途徑抑制細胞分化［13］。TNF與細胞表面的死亡受體TNFR1結合，TNFR1與銜接蛋白腫瘤壞死因子受體1結合蛋白（TRADD）通過各自的死亡結構域（DD）結合，形成由TNF、TNFR1、TRADD組合的蛋白復合物，該復合物可結合其他銜接蛋白如Fas相關死亡結構域蛋白（FADD）、RIP締合的ICH?1/ced?3同源死亡結構蛋白（RAIDD），最后RAIDD 激活 caspases?8和 caspases?2促進細胞凋亡［14］。本研究中，黑果枸杞多糖預處理的UVB照射組較未經處理的實驗組HaCaT細胞及上清液中TNF?α含量均降低，細胞中IL?1含量升高，上清液中IL?1無明顯變化。提示黑果枸杞多糖可通過降低HaCaT細胞TNF?α合成和釋放及促進IL?1合成來減輕細胞凋亡，從而保護HaCaT細胞免受UVB引起的損傷。

綜上所述，黑果枸杞多糖預處理可減輕UVB輻射對HaCaT細胞的氧化損傷及炎癥反應，從而減少細胞凋亡。但我們未進行凋亡相關蛋白的檢測，未證實黑果枸杞多糖具體通過何種途徑發揮這種作用，這些尚需進一步研究。

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Protective effect of polysaccharides from Lycium ruthenicum Murray against ultraviolet B radiation?induced photodamage in HaCaT cells

Ren Licuan,Jia Yang′e,Yan Hualing,Wang Yong,Guo Yan,Ha Xiaomei,Zhu Shiwen,Wang Gang
Department of Dermatology,Qinghai University Affiliated Hospital,Xining 810000,China

Yan Hualing,Email:yhlckw@163.com

ObjectiveTo evaluate preventive effect of polysaccharides fromLycium ruthenicumMurray against photodamage in HaCaT cells,and to explore its possible mechanism.MethodsUltrasound?assisted extraction was used to extract polysaccharides fromLycium ruthenicumMurray in Qaidam Basin.In vitrocultured HaCaT cells were randomly divided into 3 groups:control group receiving no treatment,ultraviolet B（UVB）group irradiated with 30 mJ/cm2UVB alone for 1 hour,experimental group pretreated with 2 g/LLycium ruthenicumpolysaccharide solution followed 6 hours later by 30 mJ/cm2UVB radiation for 1 hour.At twelve hours after UVB radiation,an inverted microscope was used to observe cell morphology.Then,MTS assay was performed to estimate cell proliferation,flow cytometry to detect cell apoptosis,an enzyme?labeled antigen method to detect levels of malondialdehyde（MDA）and glutathione peroxidase（GSH?Px）,as well as to evaluate the activity of superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）,and enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）to measure levels of interleukin?1（IL?1）and tumor necrosis factor?alpha（TNF?α）in HaCaT cells and their culture supernatant.ResultsCompared with the control group,the UVB group showed obscure cell morphology,cell death and floating phenomenon,while cells became swollen but remained morphologically distinct in the experimental group.MTS assay revealed that the cell proliferative activity significantly differed among the above 3 groups（F=48.88,P＜ 0.01）,and the cell proliferative activity was significantly lower in the UVB group（1.72 ± 0.12）than in the control group（2.34±0.11,P＜0.05）and experimental group（2.11±0.10,P＜0.05）.Moreover,the apoptosis rate was significantly higher in the UVB group（82.41% ±2.49%）than in the control group（3.98% ±0.19%,P＜0.05）and experimental group（22.79% ± 0.97%,P＜ 0.05）,as well as higher in the experimental group than in the control group（P＜ 0.05）.Compared with the control group,the UVB group showed significantly higher levels of MDA,supernatant levels of IL?1 and TNF?α,and intracellular levels of TNF?α,but significantly lower GSH?Px levels and activity of SOD and CAT（allP＜ 0.05）.However,there was no signifi?cant difference in the intracellular level of TNF?α between the UVB group and control group（P＞ 0.05）.ConclusionLycium ruthenicumpolysaccharide has protective effects against photodamage in HaCaT cells,likely by reducing the synthesis and secretion of inflammatory substances as well as free radicals.

Lycium barbarum;Polysaccharides;Keratinocytes;Ultraviolet rays;Oxidative stress;Interleukin?1;Tumor necrosis factor?alpha

燕華玲，Email：yhlckw@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.07.010

青海省科技計劃項目（2014?ZJ?756）

Fund program:Science and Technology Planning Project of Qinghai Province of China（2014?ZJ?756）

2016?09?12）

（本文編輯：周良佳 顏艷）