內皮素拮抗劑對中波紫外線誘導豚鼠色素沉著的觀察

傅祥評 莊永燦 王紅蘭

362000福建泉州，福建醫科大學附屬泉州市第一醫院皮膚科

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內皮素拮抗劑對中波紫外線誘導豚鼠色素沉著的觀察

傅祥評 莊永燦 王紅蘭

362000福建泉州，福建醫科大學附屬泉州市第一醫院皮膚科

目的探討內皮素拮抗劑對紫外線誘導豚鼠色素沉著的治療作用。方法用中波紫外線（UVB）照射豚鼠皮膚制作色素沉著模型。模型制作成功后，模型動物分為空白對照組（生理氯化鈉溶液）、內皮素拮抗劑組及熊果苷組（陽性對照）。分別于中波紫外線（UVB）照射前、15 d后及30 d后，用Mexameter?MX 18檢測豚鼠背部皮膚的黑素指數。連續治療30 d后比較黑素指數、表皮內黑素細胞數目和黑素含量等指標。結果UVB照射30 d時，豚鼠背部9塊UVB照射區域的黑素指數顯著高于照射前（P＜0.000 1）。外涂1‰內皮素拮抗劑的照射區域30 d后的黑素指數值明顯降低，和熊果苷組比較，差異有統計學意義（P＜0.000 1）。內皮素拮抗組黑素含量指數1明顯低于空白對照組（P＜0.05）。而3組間黑素含量指數2差異無統計學意義（P＞0.05）。結論外涂內皮素拮抗劑對UVB照射誘導豚鼠的色素沉著有一定治療作用。

紫外線；色素沉著；治療應用；豚鼠；內皮素拮抗劑

過度的紫外線照射會造成皮膚細胞內活性氧自由基增加，損傷皮膚內的脂質、蛋白和核酸，皮膚會出現紅斑、水腫、增生、光老化，最終形成色素沉著。目前的研究表明，皮膚美白物質如熊果苷、曲酸、維生素C衍生物等能減輕紫外線引起的皮膚損傷，抑制黑素細胞合成黑素而減淡膚色［1?3］。研究發現，與非紫外線暴露區皮膚組織相比，紫外線暴露區內皮素和多巴氧化酶的表達較高，而酪氨酸羥化酶較低［4］。因此，我們推測應用內皮素拮抗劑對紫外線誘導所產生的色素沉著可能有治療作用。本研究通過在成年雌性豚鼠皮膚使用中波紫外線（UVB）照射制作色素沉著模型，觀察涂抹內皮素拮抗劑對色素反應程度、表皮內黑素細胞數目和黑素含量等指標的影響，探討局部涂抹內皮素拮抗劑對UVB引起的豚鼠色素沉著的治療作用。

一、材料與方法

（一）主要試劑：內皮素拮抗劑（濃度為1‰）購于上海奧利實業有限公司，熊果苷購于上海奧利實業有限公司。

（二）方法：

1.模型制作及實驗分組：20只250 g成年雌性豚鼠JY2011A16（合格證號0248335）購于福建醫科大學實驗動物中心。紫外光輻照計對UV236B紫外線治療儀進行能量監測，監測結果發現，距離紫外線治療儀5 cm處，紫外線的能量強度為5.5 mW/cm2，該強度用于后續的模型制作。將每只豚鼠背部設定9個相離區域，每個區域為1 cm×1 cm，光斑間隔為0.5 cm。每3個為1組，取平均值（圖1）。每次照射前用剪刀剪除豚鼠背部面積為4 cm×4 cm的長毛，電動剃須刀剃盡短毛。實驗分為空白對照組（生理氯化鈉溶液）、內皮素拮抗劑組及熊果苷組（陽性對照）3個組。先對10只豚鼠背部皮膚進行紫外線照射30 d構建色素沉著模型，后外涂1‰的內皮素拮抗劑或1‰熊果苷及生理氯化鈉溶液30 d，分別從大體和鏡下觀察豚鼠皮膚顏色的變化。

2.黑素指數（melanin index，MI）測定：使用Mexameter?MX 18測量豚鼠背部皮膚的顏色。分別于照射前、照射15 d、照射30 d后測定各部位的色素指數，每個部位測4個點，取平均值作為該點的MI。為了分析內皮素拮抗劑的治療作用，研究中比較各組間MI下降值（MI下降值=MI治療30d-MI治療前）。

3.皮膚取材：20只豚鼠背部的實驗區域A～I分別取相同大小的皮膚進行活檢。分成2份：分別福爾馬林固定后石蠟包埋，立即放入-80℃冰箱凍存。

4.Masson?Fontana銀染色法：觀察3組中黑素顆粒的數量和分布部位，評價黑素合成情況。基本步驟為：豚鼠背部9塊區域皮膚組織各取一小塊經4%甲醛溶液固定，按常規石蠟包埋、切片；將上述切片常規脫蠟；后經氨銀液置室溫下避光浸染16 h；蒸餾水洗2 min。0.2%氯化金水溶液處理8 min；5%硫代硫酸鈉水溶液固定5 min；中性紅液復染。黑素及嗜銀細胞顆粒呈黑色，其他組織呈復染的顏色。黑素合成的評價標準：共分為5級。1級為基底層細胞和棘層偶見黑素顆粒；2級為黑素分布以基底層為主，且黑素顆粒分布不連續；3級為基底層細胞和棘層均可見連續呈帶狀分布的黑素顆粒；4級為基底層棘層可見大量連續呈帶狀分布的黑素顆粒，且角質形成細胞內可見較多黑素帽（帽狀附著于細胞核的黑素顆粒）；5級為表皮全層密布黑素顆粒，可見較多黑素帽。

5.黑素含量指數（melanin content index，MCI）測定：用Image J Launcher分析系統對Masson?Fontanas銀染色切片進行MCI計算。MCI?1：選擇10處表皮，測定受檢表皮基底層內黑素顆粒面積占受檢基底層細胞總面積的百分比平均值。MCI?2：選擇10處表皮，測定受檢表皮基底層以上各層黑素顆粒面積占受檢基底層以上各層細胞總面積的百分比均值。

6.統計學方法：采用SAS 6.1.76統計軟件，計量資料數據用±s表示，采用成組t檢驗和方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 實驗設計及分組 將每只豚鼠背部設定9個區域，每個區域為1 cm×1 cm，光斑間隔0.5 cm。每3個1組

二、結果

圖2 UVB照射前（2A），照射30 d（2B）豚鼠背部皮膚顏色變化

1.紫外線誘導色素沉著動物模型的構建及MI測定：10只豚鼠背部皮膚的最小紅斑量200～300 mJ/cm2。肉眼觀察UVB照射前和照射30 d后豚鼠背部皮膚顏色變化，可看到豚鼠背部皮膚顏色明顯加深（圖2）。UVB照射期間未發現明顯不良反應，如水腫、鱗屑、壞死等。分別于UVB照射前、15 d后及30 d后，用Mexameter MX 18檢測豚鼠背部皮膚的色素指數。照射前、15 d、30 d后的MI值不斷上升。

2.內皮素拮抗劑對紫外線誘導色素沉著的治療：30 d UVB照射10只豚鼠成功構建色素沉著模型后，外用1‰內皮素拮抗劑或1‰熊果苷，每日1次，共30 d，比較色素沉著退卻的程度，即計算1‰內皮素拮抗組（A-C區域）外涂前和外涂30 d后豚鼠背部皮膚的MI下降值。結果顯示3組的MI下降值分別為：空白組67.19±49.65；內皮素拮抗劑121.90±64.71；熊果苷組89.10±41.34。內皮素拮抗組的MI下降值和空白組比較，差異有統計學意義（F＝5.71，P＜0.05）。而1‰熊果苷組的MI下降值大于空白組，但差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

3.MCI計數及黑素合成評價：通過切片經Masson?Fontana銀染色（圖3），發現內皮素拮抗劑組中黑素合成等級多為1～2級，表現為基底層細胞和棘層偶見黑素顆粒，黑素分布以基底層為主，且黑素顆粒分布不連續。而熊果苷和空白組的黑素合成等級多為3～4級，表現為基底層棘層可見大量連續呈帶狀分布的黑素顆粒，且角質形成細胞內可見較多黑素帽。MCI?1在各組的數值為：空白組0.48±0.177；內皮素拮抗劑組0.25± 0.084；熊果苷組0.44± 0.112。MCI?2在各組的數值為：空白組0.04±0.039；內皮素拮抗劑組0.03±0.022；熊果苷組0.07±0.039。經方差分析比較，3組間MCI?1的差異有統計學意義（P＜0.05）。內皮素拮抗治療組中MCI?1明顯低于空白對照治療組。但3組間MCI?2差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 豚鼠皮膚Masson?Fontanas銀染色，表真皮交界處黑褐色染色代表黑素（×200） 內皮素拮抗劑組中黑素合成等級多為1～2級，表現為基底層細胞和棘層偶見黑素顆粒，黑素分布以基底層為主，且黑素顆粒分布不連續。而熊果苷組和空白對照組的黑素合成等級多為3～4級，表現為基底層棘層可見大量連續呈帶狀分布的黑素顆粒，且角質形成細胞內可見較多黑素帽

三、討論

皮膚色素沉著的發生主要與以下幾個環節有關：①酪氨酸酶的含量與活性；②黑素體的合成速度與黑化程度；③黑素體向角質形成細胞的轉輸效能；④黑素體在角質形成細胞內的降解速度等［5］。體外惡性黑素瘤細胞培養實驗證明［6］，特異性內皮素B拮抗劑BQ788能夠顯著抑制黑素瘤細胞的增殖并誘導分化。本次實驗所用的是成年雌性豚鼠，棕黃色豚鼠體內黑素細胞、黑素小體在表皮的分布類似于人體［7］，UVB照射豚鼠作為皮膚色素沉著實驗動物模型已被廣泛接受并應用。但有關UVB照射方法與照射量不盡相同，有研究采用一次性大劑量照射［8］，有些為避免急性損傷如紅斑、脫屑等采用小劑量重復照射［9］。本研究通過預實驗最后確定隔日最小紅斑量小劑量照射，既可出現明顯色素沉著，又不造成嚴重急性損傷。我們用UVB照射誘導豚鼠皮膚色素沉著作為動物模型，對內皮素拮抗劑進行了效果觀察，并與傳統美白劑熊果苷進行比較。

熊果苷是1988年日本學者從杜鵑花科植物熊果的葉中分離到的一種具有脫色作用的單體物質，是氫醌的一種天然存在形式。其脫色作用可能與分子結構中存在的氫醌基團有關。有研究表明，熊果苷在人體去色素的機制涉及黑素體中酪氨酸酶活性的抑制，而不是酪氨酸酶的表達和合成［10］。目前它在化妝品中的添加用量約為3%，小于此量對皮膚中酪氨酸酶的催化活性的抑制作用較弱，增白效果不明顯；但是大于此量能抑制或者損傷細胞生長，從而產生細胞毒性。本實驗設定的熊果苷濃度與所用的內皮素拮抗劑一致，從而更好地比較分析兩者對黑素的作用。本研究結果提示：UVB照射30 d后，豚鼠背部UVB照射區域的MI顯著高于未照射區域。與空白對照組和外涂1‰熊果苷組相比，外涂1‰內皮素拮抗劑共30 d（每日1次）后，豚鼠背部皮膚黑素指數明顯降低，說明內皮素拮抗劑對UVB引起的色素沉著有治療作用。取3組皮膚活檢并進行鏡下觀察發現：同其他組比較，內皮素拮抗劑組的MCI?1明顯降低，即內皮素拮抗劑組的表皮基底層內黑素顆粒明顯減少。本研究結果顯示，外涂1‰內皮素拮抗劑對UVB照射誘導的色素沉著有治療作用。但是治療的相關機制需要進一步研究。

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Therapeutic effect of an endothelin antagonist on ultraviolet B?induced pigmentation in guinea pigs

Fu Xiangping,Zhuang Yongcan,Wang Honglan
Department of Dermatology,Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University,Quanzhou 362000,Fujian,China

Fu Xiangping,Email:fxp8398@126.com

ObjectiveTo evaluate the therapeutic effect of endothelin antagonist on ultraviolet B（UVB）?induced pigmentation in guinea pigs.MethodsA skin pigmentation model was established by UVB irradiation in guinea pigs.The modeled animals were divided into 3 groups to be treated with sodium chloride physiological solution（blank control group）,an endothelin antagonist（endothelin antagonist group）and arbutin（positive control group）,respectively.Before the UVB irradiation,as well as after 15?and 30?day UVB irradiation,Mexameter?MX 18 was used to detect the melanin index in the dorsal skin of guinea pigs.After 30?day consecutive treatment,melanin index,the number of melanocytes in the epidermis and melanin content were compared among the above 3 groups.ResultsAfter 30?day UVB irradiation,the melanin index in the 9 UVB?irradiated areas on the dorsal skin of guinea pigs significantly increased compared with that before the radiation（P＜ 0.0001）.After 30?day treatment with the 1‰ endothelin antagonist,the melanin index in the UVB?irradiated areas significantly decreased compared with that in the positive control group（P＜ 0.0001）.Melanin content index?1（MCI?1）was significantly lower in the endothelin antagonist group than in the blank control group（P＜ 0.05）,while no significant difference in MCI?2 was observed among the 3 groups（P＞ 0.05）.ConclusionTopical application of the endothelin antagonist has a certain therapeutic effect on UVB?induced pigmentation in guinea pigs.

Ultraviolet rays;Pigmentation;Therapeutic uses;Guinea pigs;Endothelin antagonist

傅祥評，Email：fxp8398@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.06.011

泉州市財政局科技計劃項目（2013Z70）

Fund program:Science and Technology Planning Project of Quanzhou Municipal Bureau of Finance（2013Z70）

2017?03?01）

（本文編輯：吳曉初）