淫羊藿苷對阿爾茨海默病大鼠模型金屬蛋白酶及緊密連接蛋白ZO-1表達的影響

陳仕檢， 石勝良， 劉倩倩， 盧先富， 鄧 珊， 陽 洪

淫羊藿苷對阿爾茨海默病大鼠模型金屬蛋白酶及緊密連接蛋白ZO-1表達的影響

陳仕檢1， 石勝良2， 劉倩倩1， 盧先富1， 鄧 珊1， 陽 洪1

通迅作者：陽 洪，E-mail:yanghong19671130@163.com

目的探討淫羊藿苷對阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)大鼠學習記憶、海馬區基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2及血腦屏障緊密連接蛋白ZO-1表達的影響。方法采用Aβ1-42海馬注射建立AD大鼠模型，使用淫羊藿苷進行干預。以Morris水迷宮檢測大鼠的空間學習記憶能力，采用Western-blot法分析緊密連接蛋白ZO-1的表達，用免疫組織化學法檢測大鼠海馬區MMP-9、MMP-2表達。結果與對照組相比，AD模型組大鼠學習記憶能力明顯減退，ZO-1表達明顯減少(P<0.05)，MMP-9、MMP-2蛋白明顯增加；淫羊藿苷干預后，大鼠學習記憶能力均明顯提高，海馬區MMP-9/MMP-2表達減少(P<0.05)，ZO-1表達明顯增加(P<0.05)，以淫羊藿苷高劑量干予后明顯。結論淫羊藿苷能通過抑制MMP-9/MMP-2表達，減輕血腦屏障破壞，從而改善AD癥狀。

阿爾茨海默病； 淫羊藿苷； 緊密連接蛋白ZO-1； 金屬蛋白酶-9; 金屬蛋白酶-2

阿爾茨海默病(AD)以記憶、認知、情感、智力下降等為主要臨床表現的慢性進行性神經系統退行變性疾病，尚缺乏有效的防治藥物。研究顯示90%以上的AD患者均存在血腦屏障破壞，研究認為Aβ損傷腦微血管內皮細胞而引起血腦屏障破壞可能是AD新的特征性病理改變[1]。研究發現淫羊藿苷在AD或多發性硬化等中樞神經系統疾病中存在抗炎、抗凋亡、免疫調節、改善神經功能等作用，能明顯抑制IL-6、IL-1β和TNF-α的表達[2]。這些炎癥因子均能不同程度地促進基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2表達的作用[3]，金屬蛋白酶與血腦屏障關系密切，這是否涉及淫羊藿苷對AD的保護機制呢? 目前國內外未見報道，亟需進一步研究。本研究使用淫羊藿苷對AD大鼠進行干預，通過Western-blot檢測血腦屏障緊密連接蛋白ZO-1表達;免疫組化法檢測大鼠海馬區MMP-9和MMP-2的表達，研究淫羊藿苷對AD大鼠學習記憶及血腦屏障通透性的影響，探討淫羊藿苷治療阿爾茨海默病的新切入點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和分組 體重為280～300 g清潔級健康SD大鼠，從廣西醫科大學實驗動物中心購買。實驗期間動物自由飲用自來水并進食標準飼料。將SD大鼠隨機分成AD模型組、淫羊藿苷低組、淫羊藿苷高組和正常對照組，每組12只。

1.1.2 主要試劑 淫羊藿苷，純度>98%，由西安小草植物科技有限責任公司。Aβ1-42(美國sigma公司)，兔抗ZO-1單克隆一抗(abcam 公司)，兔抗MMP-9單克隆一抗、兔抗MMP-2單克隆一抗(武漢博士德生物技術有限公司)。熒光二抗(KPL，USA)GAPDH 單抗(碧云天)，蛋白Marker (Fermentas，立陶宛)。SP法免疫組化試劑盒、DAB顯色盒(北京中杉金橋有限公司)。Odessay雙色紅外激光成像系統掃描儀。

1.2 方法

1.2.1 制備模型及藥物干預 術前8 h禁食物，麻醉大鼠后，將大鼠平顱位固定于腦立體定向儀上。以包新民大鼠腦立體定位圖譜為參考，確定兩側海馬坐標:前囟后3 mm，正中矢狀縫左右旁開2 mm，硬腦膜下3.5 mm。按上述定位點鉆孔，每側海馬注射5 μl β淀粉樣蛋白，0.5μl/min，并留針5 min，保證β淀粉樣蛋白充分彌散，然后撤針，清創縫合，保溫蘇醒。并設0.01 mol PBS代替Aβ1-42注射作為對照組。之后開始進行藥物干預。對照組和模型組按0.5 mg/100 g腹腔注射生理鹽水；大鼠AD 模型制備后，次日起淫羊藿苷低組60 mg /kg，淫羊藿苷高組120 mg /kg，連續灌胃30 d。

1.2.2 大鼠行為學觀察 藥物干預30 d后，用Morris水迷宮系統對大鼠進行定向航行試驗和空間搜索實驗，歷時6 d。前5 d每天訓練4次：每只大鼠分別從4個不同象限入水訓練一次，記錄第1天、第3天、第5天大鼠尋找并爬上平臺所需時間(逃避潛伏期)，取平均值作為每天的逃避潛伏期。第6天撤去平臺進行空間搜索實驗,將大鼠放入平臺所在的對角線的象限內,記錄2 min內大鼠穿過平臺所在位置的次數，并以此作為各組大鼠記憶能力的改變。

1.2.3 血腦屏障緊密連接蛋白ZO-1檢測 大鼠麻醉后取大鼠海馬組織用液氮研磨法將組織研成粉，加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑，在4 ℃下12000 r/min 離心20 min，提取上清液轉移至離心管中，然后用BCA法檢測蛋白濃度，以GAPDH為內參。因10%分離膠和5%濃縮膠，進行SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉膜30 min，用TBST配置的5%脫脂奶粉封閉1 h，1∶500一抗4 ℃敷育過夜，脫色搖床上用TBST洗膜5 min×3次，1∶10000紅外熒光二抗室溫敷育1 h后在Odessay雙色紅外激光成像系統掃描成像。

1.2.4 免疫組織化學染色 大鼠麻醉后經心臟依次灌注生理鹽水沖洗和多聚甲醛固定后取海馬，石蠟包埋切片，采用SP法行免疫組織化學染色，DAB顯色。顯微鏡下觀察海馬區MMP-9/MMP-2的表達，陽性表達為胞漿或胞膜染成棕褐色或棕黃色，陰性對照用PBS代替一抗。每個標本取3張切片，隨機選取5個不重疊的海馬視野區高倍鏡下(×400)觀察，應用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件測定每個視野的平均積分光密度值(IOD/area)。

2 結 果

2.1 各組定向航行試驗及空間搜索實驗 前5 d各組大鼠搜索平臺的平均潛伏期逐漸縮短,AD模型組大鼠逃避潛伏期較正常對照組明顯延長(P<0.05)，淫羊藿苷干預組大鼠潛伏期較AD模型組縮短，高劑量組更明顯(P<0.05)。第6天，AD模型組大鼠穿越隱匿平臺的次數比對照組明顯減少(P<0.05)，而淫羊藿苷干預組學習記憶有所改善，淫羊藿高劑量穿越隱匿平臺的次數比AD模型組明顯增加(P<0.05)，與正常對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 各組血腦屏障緊密連接蛋白ZO-1檢測 AD模型組海馬的ZO-1 表達明顯低于正常對照組(P<0.05)。淫羊藿苷低組海馬ZO-1表達高于AD模型組(P<0.05)，淫羊藿苷高組ZO-1表達明顯高于低劑量組(P<0.05)，而較正常對照組降低(P<0.05) (見圖1)。

2.3 免疫組織化學染色MMP-9/MMP-2在海馬中的表達 AD模型組海馬區MMP-9/MMP-2蛋白的表達較其它組均明顯增高(P<0.05),淫羊藿高苷MMP-9表達較淫羊藿苷低組明顯降低(P<0.05),而比正常對照組明顯升高(P<0.05)；淫羊藿高苷MMP-2表達較淫羊藿苷低組明顯降低(P<0.05),而與正常對照組比較無統計意義(P>0.05)(見表2、圖2)。

表1 各組大鼠各時間點逃避潛伏期及跨越平臺次數的比較

與AD模型組比較*P<0.05；與淫羊藿苷低組比較△P<0.05；與正常對照組比較#P<0.05

表2 各組大鼠海馬區MMP-9和MMP-2的表達

與AD模型組比較*P<0.05；與淫羊藿苷低組比較△P<0.05；與正常對照組比較#P<0.05

與AD模型組比較▲P<0.05；與淫羊藿苷低組比較△P<0.05；與正常對照組比較#P<0.05

圖1 Western-blot檢測各組血腦屏障緊密鏈接蛋白ZO-1在海馬的表達

3 討 論

阿爾茨海默病(AD)是老年癡呆的最常見類型， Aβ是各種原因誘發AD的共同通路，是AD形成及發展的關鍵因素，故常用于AD模型的制造[4]。本研究首先Aβ成功制備AD模型，發現給予淫羊藿苷治療后，AD大鼠的學習記憶能力有所改善，這與王梅玲的研究相符[5]。淫羊藿苷是中藥淫羊藿中的有效成分，屬于黃酮類化合物，具有抗腫瘤、增強機體免疫功能、促進造血功能、調節內分泌及抗血栓等功能[2]。Urano等[6]證實，淫羊藿苷能通過抑制炎性因子的表達、降低NO的含量及抑制caspase-3的表達、降低腦組織中AChE活性，并降解Aβ，從而改善AD大鼠學習和記憶障礙。在目前AD的治療中，對BBB保護是治療的新靶點[1]。是否淫羊藿苷通過保護BBB通路促進AD神經功能康復呢？國內外尚缺乏相關報道。

血腦屏障是由不同類型的緊密連接蛋白(TJ)組成，其結構顯著性的變化為將會引起血腦屏障通透性增加。而ZO-1是與 TJ功能相關的最主要的胞質蛋白，連接跨膜蛋白claudins、occludin的 C-末端至肌動蛋白細胞骨架。ZO-1直接參與調節血腦屏障完整性和功能穩定的基礎,ZO-1含量的變化標志著BBB通透性的變化[7]。本實驗中給予淫羊藿苷干預后，ZO-1較AD模型組明顯增加，特別是高劑量組明顯，說明淫羊藿苷能夠維護AD大鼠血腦屏障結構和功能上的完整性而發揮腦保護作用。其機制是什么呢？基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組鋅離子依賴性內肽酶家族，

是公認的介導 BBB破壞有關的最主要效應分子[8]。 MMP-9/MMP-2是其家族中的重要成員，被發現在AD及其動物模型中均有不同程度的升高[9]，其分解底物包括中樞神經系統中血腦屏障ZO-1、IV 型膠原、claudins和occludin 等基質，從而起到破壞血腦屏障的作用。本研究發現在AD模型組ZO-1明顯較少，而MMP-9/MMP-2表達明顯升高，淫羊藿苷干予后MMP-9/MMP-2的表達明顯減少，說明淫羊藿苷能通過抑制MMP-9/MMP-2表達對血-腦屏障保護,從而對AD發揮保護作用。越來越多的證據顯示，Aβ損傷腦血管內皮細胞隨后啟動一系列炎癥反應連鎖效應從而導致血腦屏障破壞可能是AD新的特征性病理改變[1]。現已證實TNF-α、IL -6、炎癥介質(NO)和粘附分子等均能促進金屬蛋白酶活化的作用[2]，而國內外的研究表面淫羊藿苷對TNF-α 、IL -6、NO和粘附分子等親炎癥細胞因子有不同程度的干預作用[6]，提示淫羊藿苷可能通過調控這些炎性因子參與MMP-9/MMP-2調控從而保護AD血腦屏障通透性。

多靶點調節是中藥的主要特點，本研究發現淫羊藿苷通過抑制MMP-9/MMP-2的表達減輕血腦屏障破壞從而保護AD，其機制尚有炎癥反應連鎖效應參與，還需綜合這類因素來研究以進一步完善淫羊藿苷對AD血-腦屏障的保護作用，以期發現其最優療效，并為臨床治療AD提供更有效的理論依據。

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EffectofIcariinonMatrixMetalloproteinasesandbrainbarrierpermeabilityinratswithAlzheimer’sdisease

CHENShijian,SHIShengliang,LIUQianqian,etal.

(DepartmentofNeurology,FourthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Liuzhou545005,China)

ObjectiveTo explore the effect of Icariin on learning and memory,Metalloproteinases(MMPs) expression and brain barrier permeability of hippocampus region in rats with Alzheimer’s disease(AD).MethodsRats models of Alzheimer’s disease were established by direct β-amyloid protein (Aβ1-42)injection method.For Icariin intervention test，the learning and memory ability was observed.The expressions of MMP-9/MMP-2 were analyzed by and Immunohistochemistry.The brain barrier permeability was detected by measured junction protein (ZO-1) expression.ResultsThe learning and memory ability was obviously decreased in AD model rats.The expression of MMP-9/MMP-2 protein level were was higher compared to control group.After Icariin treatment.The the learning and memory ability was improved,and it could also inhibit the MMP-9/MMP-2 activity(P<0.05) compared to AD model rats,the level of ZO-1 expression was significantly reduced.ConclusionOur result suggests that the protective role of Icariin in AD may be inhibit MMPs activity and maintaining BBB integrity could be another interesting therapeutic target at AD.

Alzheimer’s disease; Icariin; Junction protein (ZO-1); MMP-9/MMP-2

圖2 免疫組化檢測MMP-9、MMP-2在海馬的表達

R749.1

A

1003-2754(2017)10-0922-03

2017-08-12；

2017-10-03

國家自然科學基金(81460813)；廣西區計劃項目青年基金(Z2015145)

(1.廣西醫科大學第四附屬醫院神經內科，廣西 柳州 545005;2.廣西醫科大學第一附屬醫院神經內科，廣西 南寧 530021)