急性腦梗死患者單核細胞CD14+CD16+亞型的表達變化及臨床意義

王斌達 葉指南 唐維國 劉春艷 周琳 續力云

急性腦梗死患者單核細胞CD14+CD16+亞型的表達變化及臨床意義

王斌達 葉指南 唐維國 劉春艷 周琳 續力云

目的 探討急性腦梗死患者單核細胞CD14+CD16+亞型的表達及其臨床意義。方法 選擇發病＜24h入院的36例急性腦梗死患者為腦梗死組、同期在神經內科治療的32例頭暈患者為對照組，檢測腦梗死組患者入院當天及第2、5、7～10天以及隨訪第90天，對照組入院當天的血清單核細胞計數、單核細胞各亞型百分比，分析單核細胞亞型與病情的關系。 結果 與對照組相比，腦梗死組經典型單核細胞百分比各時間點均無明顯變化（均PP＞0.05）；中間型單核細胞百分比入院當天及第2、5、7～10天均明顯升高（均P＜0.05）；非經典型單核細胞百分比入院第2、5天均明顯下降（均P＜0.05）。腦梗死組入院當天單核細胞計數與NIHSS評分呈正相關（r=0.508，P＜0.05）；3個亞型百分比與NIHSS評分均未見相關（均PP＞0.05）。與未感染者比較，腦梗死感染患者入院第2、5、7～10天單核細胞計數均明顯升高（均P＜0.05），非經典型單核細胞百分比均明顯下降（均P＜0.05）；中間型單核細胞百分比入院當天及第2、5天均明顯升高（均P＜0.05）；經典型單核細胞百分比各時間點比較差異均無統計學意義（均PP＞0.05）。與預后良好組比較，腦梗死預后不良組入院第2、5天單核細胞計數、中間型單核細胞百分比均明顯升高（均P＜0.05），非經典型單核細胞百分比均明顯下降（均P＜0.05）；經典型單核細胞百分比各時間點比較差異均無統計學意義（均P＜0.05）。 結論 急性腦梗死患者單核細胞CD14+CD16+亞型變化有一定的規律，中間型單核細胞、非經典型單核細胞可能與腦梗死相關感染及預后有關。

單核細胞 CD14 CD16 腦梗死

炎癥反應參與腦梗死的缺血損傷，與腦梗死的發生、發展及預后密切相關[1-3]。單核細胞是重要的炎癥反應細胞，在急性腦梗死人群中觀察到單核細胞上高表達的人類白細胞抗原DR位點抗原表達減少，其分泌的TNF-α減少，這表明單核細胞活性下降，可能與腦梗死早期階段免疫抑制有關[4]。目前，人類單核細胞亞型的劃分主要基于脂多糖受體CD14和IgG Fc段受體CD16的表達水平[5-6]。在正常人群中，循環血中80%～90%的單核細胞表達CD14++CD16-（經典型單核細胞），約10%的單核細胞表達CD14+CD16++（非經典型單核細胞）和CD14++CD16+（中間型單核細胞）[5,7]。單核細胞亞型在腦梗死的病理、生理過程中也許具有特定的作用，若其作用機制能被準確闡明，它們有可能成為有效的治療靶點。本文就急性腦梗死患者單核細胞CD14+CD16+亞型的表達變化及臨床意義作一探討，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇舟山醫院2014年2月至2015年4月收治的36例急性腦梗死患者（發病＜24h入院）為研究對象，其中男 20 例，女 16 例；年齡 42～79（69.1±10.1）歲。入組標準：年齡＜80歲；發病時間＜24h；病前改良Rankin量表（mRS）評分≤2分；病后美國國立衛生研究院卒中量表（NIHSS）評分≥3分；符合2014年中國急性腦梗死診治指南的診斷標準，均經頭顱CT或MRI診斷。排除標準：入院時有發熱、感染等癥狀（體溫＞37.8℃，WBC＞11×109個/L 或＜4×109個/L）；入院前 3個月曾使用過抗生素、免疫抑制劑、類固醇激素；入院前3個月有腦出血、腦膿腫、短暫性腦缺血發作、顱內手術及外傷史；既往有血液病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、肝炎、結核病史；準備行溶栓者。選擇同期在舟山醫院神經內科治療的32例頭暈患者進行對照，其中男17例，女15例；年齡49～74（68.7±7.8）歲；均經頭顱CT或MRI排除急性卒中。兩組患者年齡、性別、吸煙、合并基礎疾病等情況比較，差異均無統計學意義（均PP＞0.05），見表 1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 試劑和儀器 FITC標記的單克隆抗體CD14（20μl/支，Cat NO.557153）、PEcy5 標記的單克隆抗體CD16（20μl/支，Cat NO.561313）、陰性對照 IgG（0.1mg,Cat NO.556651；0.1mg，Cat NO.556652） 和 FACS lysis solution（100ml，Cat NO.349202） 均由美國 BD 公司提供；血液自動分析儀為日本希森美抗公司生產的Sysmex XE-2100型，試劑為該公司供給的配套試劑盒；流式細胞儀為美國BD FACSCalibur。

1.3 方法

1.3.1 血清檢測 腦梗死組患者入院當天（用藥前）及第 2、5、7～10 天的 6∶30～8∶00，隨訪第 90 天分別采集靜脈血，并在30min內分離血漿，并保存在-80℃冰箱內。對照組患者于入院當天采集靜脈血。（1）外周血單核細胞計數的測定：采集靜脈血3ml，加入EDTA抗凝管中，由舟山醫院血常規室采用日本希森美抗公司Sysmex XE-2100型血液自動分析儀作統一檢測。（2）單核細胞CD14、CD16的測定：①取2支流式細胞儀管，均加入已分離出血漿的抗凝血細胞80μl；在試管1加入陰性對照IgG，在試管2中加入FITC標記的CD14、PEcy5標記的CD16各4μl；震蕩混勻，保存在4℃暗箱中30min。②加入2ml紅細胞溶解液，震蕩混勻，靜置于37℃溫水浴中10min中，2 500r/min離心5min，棄上清液，殘留物中加200μl PBS，立即上機檢測。

1.3.2 評價標準 入院7d內，每天記錄NIHSS評分；隨訪期間腦梗死后第90天，記錄NIHSS評分、mRS評分。（1）預后良好：腦梗死后第90天NIHSS評分0或1分，且mRS評分≤2分。（2）感染：依據國家衛生部關于醫院感染的診斷標準[8]。①下呼吸道感染：患者出現

咳嗽、痰黏稠、肺部出現啰音并伴隨下列三項中一項（發熱、WBC或中性粒細胞比例增高、X線示有肺部炎癥浸潤性病變）。②尿路感染：患者出現尿路刺激征，或有下腹觸痛、腎區叩痛伴或不伴發熱并具有下列情況之一（尿檢白細胞：男性≥5個/高倍視野，女性≥10個/高倍視野；插導尿管患者結合尿培養）；臨床已診斷為泌尿道感染，或抗菌治療有效而認定的泌尿道感染。

1.4 統計學處理 應用SPSS 21.0統計軟件。計量資料符合正態分布，用表示，組別比較采用獨立樣本t檢驗；組內各時點比較采用方差分析。腦梗死組入院當天單核細胞計數及其亞型與NIHSS評分的關系采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦梗死組基本情況 住院1周內，腦梗死組發生感染9例，占25.0%；包括肺炎8例、泌尿系感染1例。住院期間病死3例；隨訪期間病死3例，失訪4例。

2.2 腦梗死患者入院后不同時點單核細胞計數及其亞型的變化及與對照組比較 腦梗死組入院當天及第2、5天單核細胞計數逐漸增高，之后逐漸恢復；入院當天及第2、5、7～10天與對照組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。腦梗死組入院當天及第 2、5、7～10天經典型單核細胞百分比與對照組比較，差異均無統計學意義（均PP＞0.05）。腦梗死組入院當天及第2、5天中間型單核細胞百分比逐漸增高，第7～10天逐漸恢復；入院當天及第2、5、7～10天與對照組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。腦梗死組入院當天及第2、5天非經典型單核細胞百分比逐漸下降，第5天達最低值，之后逐漸恢復；入院第2、5天與對照組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 腦梗死患者入院后不同時點單核細胞計數及其亞型的變化及與對照組比較

2.3 腦梗死患者入院當天單核細胞計數及其亞型與NIHSS評分的關系 腦梗死組入院當天單核細胞計數與NIHSS評分呈正相關（r=0.508，P=0.002），單核細胞3個亞型百分比與NIHSS評分均無明顯相關性（經典型：r=0.231，P=0.174；中間型：r=0.084，P=0.627；非經典型：r=-0.205，P=0.2297），見圖 1。

2.4 感染與未感染腦梗死患者入院后不同時點單核細胞計數及其亞型的變化與比較 與未感染者比較，腦梗死感染患者入院第2、5、7～10天單核細胞計數均明顯升高，非經典型單核細胞百分比均明顯下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；中間型單核細胞百分比入院當天及第2、5天均明顯升高（均P＜0.05）；經典型單核細胞百分比各時點比較差異均無統計學意義（均PP＞0.05），見表3。

2.5 預后不良與良好腦梗死患者入院后不同時點單核細胞計數及其亞型的變化與比較 與預后良好組比較，腦梗死預后不良組入院第2、5天單核細胞計數、中間型單核細胞百分比均明顯升高，非經典型單核細胞百分比均明顯下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；經典型單核細胞百分比各時間點比較差異均無統計學意義（均P＜0.05），見表 4。

3 討論

本研究發現，腦梗死早期單核細胞計數增高，而后逐漸下降，提示腦梗死后單核細胞處于激活狀態，可能與病后下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸和交感神經系統激活、刺激骨髓池中幼稚的單核細胞釋放入外周血有關[9]。有研究表明經典型單核細胞處于相對低分化的幼稚階段，占外周血單核細胞總數的80%～90%；當機體在炎癥免疫反應的刺激下，開始表達CD16并伴有CD14表達下調，逐漸轉化為中間型單核細胞，最后成熟后呈現CD16高表達、CD14低表達的狀態，即非經典型單核細胞[10]。本研究中腦梗死患者經典型單核細胞變化不大，可能因為幼稚的經典型單核細胞儲備大，占全部單核細胞的大部分，致使少量的經典型單核細胞成熟轉化后在總體上觀察經典型單核細胞仍無明顯變化。此外，中間型單核細胞總的趨勢表現為先增高再逐漸恢復的動態變化過程，提示機體在炎癥免疫刺激下會使單核細胞逐漸分化成熟。而更為成熟的非經典型單核細胞在腦梗死急性期反而下降，原因可能是與其他亞型相比，非經典型單核細胞有更高的遷徙能力，急性應激狀態下能迅速從血管遷徙到損傷組織，導致外周血中非經典型單核細胞不升反而下降[11-12]。

圖1 腦梗死患者入院當天單核細胞計數及其亞型與NIHSS評分的散點圖

表3 感染與未感染腦梗死患者入院后不同時點單核細胞計數及其亞型的變化與比較

表4 腦預后不良與良好腦梗死患者入院后不同時點單核細胞計數及其亞型的變化與比較

研究表明中間型單核細胞具有強大的吞噬活性及抗原提呈作用[13]。在類風濕性關節炎、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等多種慢性炎性疾病進展期，中間型單核細胞明顯升高，且與疾病的進展、預后相關[14-16]。本研究發現腦梗死急性期中間型單核細胞逐漸升高，可能與急性應激狀態下經典型單核細胞逐漸轉化為中間型單核細胞有關。此外，預后不良的腦梗死患者中間型單核細胞升高更為明顯，可能由于急性發病時本身病情重，腦組織損傷范圍廣泛，從而導致中間型單核細胞反應性升高。中間型單核細胞的升高，進一步加重了機體的炎癥免疫反應，增強了單核細胞對損傷腦組織及細胞的清除，造成缺血腦組織的二次損傷。Deng等[17]研究發現中間型單核細胞可促進誘導型一氧化氮合酶的表達，再次對神經組織造成毒性損害。因此，尋求阻斷經典型單核細胞向中間型單核細胞轉化的有效方法，可能為腦梗死的治療提供新方向。Kaito等[5]研究發現非經典型單核細胞較其他亞型具有更高的遷移能力，在腦梗死早期就能迅速遷移到損傷的炎性組織周圍。本研究顯示入院后出現感染的腦梗死患者非經典型單核細胞明顯減少，可能由于腦梗死后大量的非經典型單核細胞迅速從血管中遷徙到損傷組織，導致機體免疫防御功能下降，從而使腦梗死患者更容易發生感染。Auffray等[12]利用感染的大鼠作為模型，發現與人類非經典型單核細胞同源的大鼠Ly6Clow非經典型單核細胞能在感染的數小時內迅速從血管中遷移到感染組織中。本研究發現感染的腦梗死患者非經典型單核細胞進一步下降，可能由于非經典型單核細胞大量遷移到感染組織所致。

綜上所述，急性腦梗死患者單核細胞CD14+CD16+亞型變化有一定的規律，中間型單核細胞、非經典型單核細胞可能與腦梗死相關感染及預后有關。建議進一步研究腦梗死后單核細胞及其亞型的分子機制，可能為腦梗死病情預測及治療提供新策略。

[1] Petrovicdjergovic D,Goonewardena S N,Pinsky D J.Inflammatory disequilibrium in stroke[J].Circulation Research,2016,119(1):142-158.

[2] Ito M,Kondo T,Shichita T,et al.Post-ischemic innate immunity and its application for novel therapeutic strategy targeting brain inflammation[J].Nihon rinsho Japanese journal of clinical medicine,2013,71(7):1291-1301.

[3]Shim R,Wong C H,Ischemia.Immunosuppression and infectiontackling the predicaments of post-stroke complications[J].Internationaljournalof molecular sciences,2016,17(1):551-556.

[4] Zhang D P,Yan F L,Xu H Q,et al.A decrease of human leucocyte antigen-D R expression on monocytes in peripheral blood predicts stroke-associated infection in critically-ill patients with acute stroke[J].European journal of neurology,2009,16(4):498-505.

[5] Kaito M,Araya S,Gondo Y,et al.Relevance of distinct monocyte subsets to clinicalcourse of ischemic stroke patients[J].PloS one,2013,8(8):e69409.

[6] Ziegler-Heitbrock L,Ancuta P,Crowe S,et al.Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood[J].Blood,2010,116(16):e74-80.

[7] Urra X,Cervera A,Obach V,et al.Monocytes are major players in the prognosis and risk of infection after acute stroke[J].Stroke,2009,40(4):1262-1268.

[8] 中華人民共和國衛生部.醫院感染診斷標準(試行)[J].中華醫學雜志,2001,81(5):314-320.

[9] Heidt T,Sager H B,Courties G,et al.Chronic variable stress activates hematopoietic stem cells[J].Nature medicine,2014,20(7):754-758.

[10] Auffray C,Sieweke M H,Geissmann F.Blood monocytes:development,heterogeneity,and relationship with dendritic cells[J].AnnualReview of Immunology,2009,27(1):669-692.

[11] Cros J,Cagnard N,Woollard K,et al.Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors[J].Immunity,2010,33(3):375-386.

[12] Auffray C,Fogg D,Garfa M,et al.Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocyte s with patrolling behavior[J].Science,2007,317(5838):666-670.

[13] Rojas J,Salazar J,Martinez M S,et al.Macrophage heterogeneity and plasticity:Impact of macrophage biomarkers on atherosclerosis[J].Scientifica,2015,(3):851252

[14] Korkosz M,Bukowska-Strakova K,Sadis S,et al.Monoclonal antibodies against macrophage colony-stimulating factor diminish the number of circulating intermediate and nonclassical[CD14(++)CD16(+)/CD14(+)CD16(++)]monocytes in rheumatoid arthritis patient[J].Blood,2012,119(22):5329-5330.

[15] Rong M Y,Wang C H,Wu Z B,et al.Platelets induce a proinflammatory phenotype in monocytes via the CD147 pathway in rheumatoid arthritis[J].Arthritis research&therapy,2014,16(6):478.

[16] Waschbisch A,Schroder S,Schraudner D,et al.Pivotal role for CD16+monocytes in immune surveillance of the central nervous system[J].J Immunol,2016,196(4):1558-1567.

[17] Deng S,Yu K,Zhang B,et al.Toll-like receptor 4 promotes NO synthesis by upregulating GCHI expression under oxidative stress conditions in sheep monocytes/macrophages[J].Oxidative medicine and cellular longevity,2015(5):1-11.

Changes of monocyte CD14+CD16+subtypes in patients with acute cerebral infarction and its clinical significance

WANG Binda,YE

Zhinan,TANG Weiguo,et al.Department of Neurology,Zhoushan Hospital,Zhoushan 316021,China

Objective To investigate the changesof CD14+CD16+monocytes in patients with acute cerebral infarction and clinical significance. Methods Thirty six patients with acute cerebral infarction admitted within 24 h of onset(study group)and 32 patients with dizziness hospitalizedat the same period(control group)were enrolled in the study.The peripheral monocyte count and the percentage of monocyte subtype in study groupwere determined at 0,2,5,7-10d after admission and 90d in the followed up;those were measure at admission in control group.The correlation between monocyte subtypes and the progression of acute cerebral infarction was analyzed. Results Compared with the control group,the percentage of typical monocytes(CD14++CD16-)showed no significant changes at all time points in cerebral infarction group(PP＞0.05).The percentage of intermediate monocytes(CD14++CD16+)was significantly increased at d0,d2,d5,d7 and d10 after admission(P＜0.05),the percentage of non-typical monocytes(CD14+CD16++)was significantly decreased at d2 and d5(P＜0.05).There was a positive correlation between monocyte count and NIHSS score (r=0.508,P＜0.05)at admission,while no correlation between the subtypes of monocytes and NIHSS scores(PP＞0.05).Compared with non-infected patients,the monocyte count in infected cerebral infarction patients was significantly increased(P＜0.05),the percentage of non-typical monocytes was significantly decreased(P＜0.05),the intermediate monocytes were significantly increased(P＜0.05)at d0,d2 and d5 of admission,while the typical monocytes showed no significant differences at all time points(P＜0.05).Compared with the petients with good prognosis,the monocyte count and the percentage of intermediate monocytes were significantly increased at d2 and d5 in patients with poor prognosis(P＜0.05),and the percentage of non-typical monocytes was significantly decreased(P＜0.05),but the percentage of typical monocytes showedno significant difference at all time points(PP＞0.05). Conclusion The CD14+CD16+monocytes change with the progression of the disease in patients with acute cerebral infarction.The changes of intermediate monocytes and non-typical monocytes may be related to the infection and prognosis of cerebral infarction.

Monocytes CD14 CD16 Cerebral infarction

2016-07-09）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.18.2016-1047

舟山市科技局項目（2014C31067）

316021 舟山醫院神經內科（王斌達、周琳、劉春艷、唐維國），細胞分子生物實驗室（續力云）；臺州市立醫院神經內科（葉指南）

續力云，E-mail：xuliyunhappy@126.com