結直腸癌中miR-21表達與臨床病理因素及預后的關系

任約翰 葉星照 厲金雷 陳積賢

結直腸癌中miR-21表達與臨床病理因素及預后的關系

任約翰 葉星照 厲金雷 陳積賢

目的 探討結直腸癌組織中miR-21表達與臨床病理因素及預后的關系。方法 取59例結直腸癌組織標本及癌旁正常黏膜組織標本，采用莖環逆轉錄實時熒光定量PCR方法檢測結直腸癌組織及癌旁正常黏膜組織中miR-21的相對表達量，并分析癌組織中miR-21表達與臨床病理因素的關系。用Kaplan-meier法計算生存率，采用log-rank檢驗、Cox比例風險回歸模型分析結直腸癌預后影響因素。結果 結直腸癌組織中miR-21的相對表達量明顯高于其癌旁正常黏膜組織（P＜0.05）。結直腸癌組織miR-21表達水平與腫瘤直徑、淋巴結轉移、臨床分期有關（均P＜0.05）；與性別、遠處轉移、分化程度、浸潤深度和腫瘤位置無關（均PP＞0.05）。遠處轉移、分化程度、miR-21表達水平是影響患者預后的獨立危險因素（均P＜0.05），其RR值及95%CI分別為5.053（1.395～5.787）、3.998（1.395～18.305）、3.837（1.266～11.631）。 結論 miR-21 與結直腸癌患者預后和疾病進展密切相關。

結直腸癌 miR-21 預后 Cox比例風險回歸模型

結直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有120萬人新發結直腸癌，術后5年生存率為60%～70%[1]，嚴重危害人類的健康。微小RNA（microRNA）是新發現的一類內源性、保守性的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA3’UTR互補結合，參與調節細胞周期、凋亡、分化及發育等重要生物學進程，在腫瘤發生過程中扮演著重要角色。miR-21是人類最早發現且唯一在幾乎所有人類惡性腫瘤中表達上調的microRNA[2]。本研究通過檢測結直腸癌組織及對應正常黏膜組織中miR-21表達水平，并結合術后病理資料，分析miR-21表達與結直腸癌臨床病理因素的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2010年6月至2011年2月在溫州醫科大學附屬第三醫院手術切除的59例結直腸癌組織標本及癌旁（距離癌組織＞5cm）正常黏膜組織標本，標本離體后置于RNA樣本保存液，液氮速凍后轉入-80℃冰箱保存。所有患者術前均未進行放化療。在59例結直腸癌患者中，男36例，女23例；腫瘤直徑＜4cm 32例，≥4cm 27例；無淋巴結轉移30例，有淋巴結轉移29例；無遠處轉移51例，有遠處轉移（肝臟轉移）8例；腫瘤位置在結腸17例，直腸42例。依據AJCC/UICC的TNM分期標準進行診斷與分期：高中分化49例，低分化10例；T1～2期 15 例，T3～4期 44 例；Ⅰ～Ⅱ期 22 例，Ⅲ～Ⅳ期37例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，且所有患者簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 總microRNA提取 采用miRcute miRNA提取試劑盒（北京Tiangen公司）提取分離總microRNA，具體步驟參照說明書。使用分光光度計檢測總microRNA的濃度及純度，A260∶A280的比值為 1.8～2.0，瓊脂凝膠電泳檢驗microRNA的完整性，所有RNA樣品保存于-80℃冰箱。

1.2.2 反轉錄及實時熒光定量PCR miR-21采用莖環引物進行逆轉錄反應，總體積20μl：2μl模板RNA，1.5μl莖環引物，0.5μl RNA 抑制酶，0.5μl逆轉錄酶，2μl dNTP，4μl 5×First-Strand Buffer，9.5μl DEPC 處理水。反應條件：16℃ 30min，42℃ 30min，75℃ 15min，4℃保存。U6采用oligodT進行逆轉錄反應，反應體系同上，反應條件：42℃ 60min，75℃ 15min，4℃保存。PCRmix采用SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa），參照說明書配制 25μl體系，反應條件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s，共40個循環。以U6為內參進行相對定量分析，應用2-ΔΔct（腫瘤組基因的表達相對于對照組的變化倍數）方法分析腫瘤組與正常組的差異。其中△Ct=CtmiR-21-Ctu6，△△Ct=△Ct癌組織-△Ct癌旁組織，△Ct越大即表達量越少，反之越多。用5%的聚丙烯酰胺對PCR產物進行核酸電泳，長度為 miR-21：66bp、U6：94bp。引物序列見表1。

表1 RT-PCR的引物序列

1.3 統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件。計量資料若滿足正態分布，用表示，組間比較采用配對t檢驗；若不滿足正態分布，則用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。采用Kaplan-Meier法計算生存率，并用log-rank檢驗進行單因素分析，對單因素分析有意義的變量應用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-21 PCR產物的電泳結果 PCR產物大小與理論值相符，見圖1。

2.2 miR-21在結直腸癌組織及癌旁正常黏膜組織中的表達 59例結直腸癌患者中miR-21表達水平升高41例（69.5%），下降18例（30.5%）。結直腸癌組織中miR-21表達的相對值為2.698±1.973，而正常黏膜組織中的表達相對值為0.653±0.213；癌組織中miR-21表達的相對值是正常黏膜組織的2.399倍，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 miR-21 PCR產物電泳結果（M：標記；1：結直腸癌旁正常黏膜組織的miR-21；2：結直腸癌組織的miR-21；3：結直腸癌旁正常黏膜組織的U6；4：結直腸癌組織的U6）

2.3 結直腸癌組織miR-21表達與臨床病理因素的關系 59例結直腸癌患者中，腫瘤直徑≥4cm、有淋巴結轉移及臨床分期Ⅲ～Ⅳ期的患者miR-21表達水平明顯升高（均P＜0.05）；與性別、遠處轉移、分化程度、浸潤深度和腫瘤位置無關（均PP＞0.05），見表2。

2.4 影響結直腸癌患者預后的單因素分析 對影響預后的相關因素（性別、腫瘤直徑、淋巴結轉移、遠處轉移、分化程度、浸潤深度、臨床分期、腫瘤位置）、miR-21表達水平與患者生存時間進行單因素分析，經Kaplan-Meier法計算生存率、log-rank檢驗結果顯示遠處轉移、分化程度、浸潤深度、miR-21表達水平是影響結直腸癌患者預后的因素（均P＜0.05），而性別、腫瘤直徑、淋巴結轉移、臨床分期、腫瘤位置與結直腸癌預后均無關（均PP＞0.05），見表2。miR-21表達水平越高，患者生存率越低（P＜0.05），見圖2。

表2 結直腸癌組織miR-21表達與臨床病理因素的關系

2.5 影響結直腸癌預后的Cox模型分析 將單因素分析有意義的因素納入Cox模型分析，結果顯示遠處轉移、分化程度、miR-21表達水平是影響患者預后的獨立危險因素（均P＜0.05），其RR值及95%CI分別為5.053（1.395～5.787）、3.998（1.395～18.305）、3.837（1.266～11.631）；而與浸潤深度無關（RR=0.673，95%CI：0.261～1.738，PP＞0.05）。

3 討論

圖2 結直腸癌患者Kaplan-Meier生存曲線

結直腸癌是消化系統常見惡性腫瘤，臨床上采取以手術為主、化放療為輔的綜合治療方法。由于結直腸癌早期多無癥狀，確診時多屬中晚期，往往會喪失最佳的治療時機。因此，早期篩查與診斷是防治結直腸癌的最佳手段。雖然腫瘤生化標志物癌胚抗原、糞便隱血試驗對結直腸癌具有重要的輔助診斷價值，但其靈敏度偏低，對結直腸癌的早期診斷價值不高[3]。因此尋找一種高靈敏度的腫瘤標志物十分重要。

microRNA是一類具有基因調控功能的小分子非編碼RNA，可特異性識別靶向microRNA的3’末端非編碼區并與之結合，導致microRNA的降解或抑制翻譯，在轉錄后水平對靶基因的表達進行調節。近年來研究發現microRNA在多種腫瘤組織或細胞中表達異常，與腫瘤細胞增殖、分化、侵襲以及血管生成等過程有關，是腫瘤形成的重要調節因子[4]。miR-21位于17q23.2染色體FRA17B脆性區域上，該點是多種腫瘤發生的脆性位點，能與靶基因PTEN[5]、PDCD4[6]等結合，并抑制其表達，廣泛參與機體多種生物學過程的調控，在腫瘤發生中起到重要的“癌基因”作用，目前已被證實在多種惡性腫瘤中表達上調。Kannan等[7]發現結直腸癌患者血漿中的miR-21可長期穩定存在，且正確識別結直腸癌的特異度和靈敏度均在90%以上。Wu等[8]利用PCR法檢測了88例結直腸癌患者的糞便樣品，發現結直腸癌患者糞便中miR-21表達水平高于正常人，糞便miR-21作為一個獨立診斷結直腸癌的標志物，其靈敏度為55.7%，特異性為73.3%。本研究通過對59例結直腸癌患者的腫瘤組織及其對應癌旁正常黏膜組織的miR-21表達水平進行比較，發現結直腸癌組織中miR-21的相對表達量明顯高于癌旁正常黏膜組織；這表明具有原癌基因作用的miR-21在結直腸癌患者的血液、糞便和腫瘤組織中呈高表達狀態，且miR-21診斷結直腸癌的靈敏度、特異度均高于傳統腫瘤標志物（如癌胚抗原、糞便隱血試驗）。

研究結直腸癌組織miR-21表達與臨床病理特征的關系發現，miR-21表達水平與結直腸癌的腫瘤直徑、淋巴結轉移和臨床分期有關，與患者性別、遠處轉移、分化程度、浸潤深度和腫瘤位置等均無關；這與Chen等[9]研究結果相似，表明結直腸癌組織中miR-21異常表達與結直腸癌的預后有關。為了進一步證實miR-21是一種重要的預后指標，本研究應用Kaplan-Meier法計算生存率，對59例病理及隨訪資料完整的結直腸癌患者進行預后影響因素分析，應用log-rank檢驗比較其差別；為評價多因素作用結果筆者還應用Cox比例風險回歸模型對影響生存率的因素進行分析，結果發現某些在單因素作用下有意義的變量，在多因素作用下卻變得不顯著。本研究單因素分析結果顯示，遠處轉移、分化程度、浸潤深度和miR-21表達水平是影響預后的因素；而將上述因素作Cox模型分析，結果顯示遠處轉移、分化程度、miR-21表達水平是結直腸癌預后的獨立危險因素，其中miR-21表達水平越高則患者生存率越低。Nugent等[10]研究發現miR-21異常表達與結直腸癌患者無病存活率及總生存期有關，miR-21高表達與腫瘤惡性程度及患者較短存活期呈正相關。

綜上所述，miR-21在結直腸癌組織中表達明顯升高，對結直腸癌的診斷、預后和療效預測均有臨床意義，提示miR-21可作為反映結直腸癌生物學行為的一種新型標志物。

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Expression of miR-21 in colorectal cancer and its clinicopathologic significance

REN Yuehan,YE Xingzhao,LI Jinlei,et al.

Department of Colorectal and Anal Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the expression of miR-21 in colorectal cancer anditsassociation with clinicopathological characteristics and the prognosis of patients. Methods The expression of miR-21 in 59 specimens of colorectal cancer and matched non-tumor adjacent tissue specimens was examined with stem-loop real-time RT-PCR.The relationship between the expression of miR-21 and clinicopathologic featuresof colorectal carcinoma wasanalyzed.Kaplan-Meier survival curves,log-rank test and multivariate Cox regression were used to analyze the factors related to prognosis of colorectal cancer. Results The expression level of miR-21 was significantly higher in colorectal cancer tissue than that in the matched normal colorectalmucosa(2.698±1.973 vs.0.653±0.213,P＜0.05).The expression of miR-21 was positively correlated with tumor size,lymph node metastasis and clinical stage(P＜0.05),but not with sex,distant metastasis,cell differentiation,depth of tumor infiltration and location(PP＞0.05).Kaplan-Meier univariate analysis showed that distant metastasis,cell differentiation,depth of tumor infiltration and miR-21 was the prognostic factor for colorectal cancer(P＜0.05).The Cox regression analysis showed that distant metastasis,cell differentiation and miR-21 was an independent prognostic risk factor of colorectal cancer(P＜0.05),RR value and 95%CI was 5.053(1.395-5.787),3.998(1.395-18.305)and 3.837(1.266-11.631). Conclusion The results indicate that miR-21 serves as a molecular marker for disease progression and prognosis ofcolorectalcancer.

ColorectalcancermiR-21 Prognosis Cox model

2017-01-05）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.18.2017-41

浙江省自然基金項目（Y2100917）

325000 溫州醫科大學附屬第一醫院結直腸肛門外科（任約翰、葉星照、厲金雷）；溫州醫科大學附屬第三醫院腫瘤外科（陳積賢）

厲金雷，E-mail：John1504@163.com