冷藏對煙蚜繭蜂營養物質積累與轉化的影響

陳華祥　劉春明　倪鳳萍　黃坤　王超　王金　吳道琴　李宏光

摘要：指出了煙蚜繭蜂（Aphidius gifuensis Ahsmaed）是一種蚜蟲的專性寄生蜂，能夠顯著地控制蚜蟲的種群數量，其滯育機制對煙蚜繭蜂產品化生產具有重大意義。為進一步了解低溫冷藏對云南煙蚜繭蜂體內代謝物質及其羽化率的影響，通過低溫（8±0.5 ℃）冷藏寄生蚜，形成僵蚜后將其轉至3 ℃條件下分時段冷藏，最后測定了煙蚜繭蜂（蛹）體內代謝物質的變化及其與羽化率的關系。結果表明：冷藏初期煙蚜繭蜂大量積累糖類和脂肪，消耗蛋白；隨著冷藏時間的延長，糖類優先被利用，大量分解轉化為蛋白質，脂肪含量有所下降；冷藏后期隨著糖類的消耗殆盡，蛋白大量分解轉化為糖類和脂肪；冷藏10 d、20 d、30 d和40 d羽化率分別為86.67%、49.33%、15.33%和12.67%，顯著低于未冷藏煙蚜繭蜂羽化率94.00%。研究認為，冷藏期間煙蚜繭蜂體內營養物質存在明顯的積累和轉化關系，羽化率隨冷藏時間的延長而降低。

關鍵詞：煙蚜繭蜂； 營養物質； 羽化率

中圖分類號：S572

文獻標識碼：A文章編號：16749944（2017）18002805

1引言

煙蚜繭蜂（Aphidius gifuensis Ahsmaed）屬膜翅目（Hymenoptera）、蚜繭蜂科（Aphidiidea）、蚜繭蜂屬（Aphdius），是蚜蟲的重要寄生性天敵昆蟲。隨著煙蚜繭蜂在農業生產中的廣泛運用，其商品化生產逐漸成為一種趨勢，也是目前大多數學者研究的重點。北方地區，煙蚜繭蜂主要以僵蚜形態越冬，在南方地區，煙蚜繭蜂無越冬現象、不滯育＼[1～5＼]。研究南方非滯育型煙蚜繭蜂在低溫條件下營養物質的積累和轉化，可為設計冷藏方法、延長煙蚜繭蜂產品貨架期提供理論依據。近年來，國內外學者對煙蚜繭蜂生物學與生態學、規模繁殖和釋放技術研究較多，而對其冷藏及生理生化的研究報道較少＼[6～9＼]。在低溫條件下，昆蟲體內營養物質的含量隨滯育時間的延長而不斷變化＼[10～12＼]，Hahn＼[13＼]研究發現昆蟲滯育期間會大量積累碳水化合物、脂肪和蛋白質。在北方低溫季節煙蚜繭蜂田間滯育率在60%～80%之間，滯育持續期維持在4～5個月，但在南方（玉溪）煙蚜繭蜂無越冬現象、不滯育＼[2＼]。李玉艷＼[14＼]認為人工誘導煙蚜繭蜂（北京）滯育的最佳條件為 8℃、L∶D=8∶16，滯育率可達54.35% ，并對不同滯育期煙蚜繭蜂（北京）代謝物質含量做了研究。截止目前關于冷藏后煙蚜繭蜂（南方種群）體內代謝物質是如何積累和轉化的研究尚未見報道，也未有人對南北方煙蚜繭蜂相關代謝物質做過比較。張紅梅等＼[15＼]曾提出質疑—低溫能否誘導云南的煙蚜繭蜂進入滯育。本文通過低溫冷藏處理，探索煙蚜繭蜂（南方種群）冷藏后其體內營養物質的積累和轉化及其羽化率，進一步與北方種群做比較，從而為判斷煙蚜繭蜂（南方種群）滯育提供生理指標，尋找最佳的冷藏條件提供理論依據，促進云南煙區煙蚜繭蜂商品化生產。

2材料與方法

2.1實驗材料

2.1.1供試蟲源

種蚜、種蜂在云南省紅河州彌勒縣新哨三角地煙蚜繭蜂繁育基地在溫室內飼養。

2.1.2試劑

（1）脂肪測定所用試劑。膽固醇、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、三氯甲烷、甲醇、濃硫酸、香蘭素。

（2）總蛋白測定所用試劑?？捡R斯亮蛋白測定藍試劑盒（100T，南京建成生物工程研究所），現配現用，氯化鈉、蒸餾水。

（3）糖類測定所用試劑。濃硫酸、葡萄糖、蒽酮、三氯乙酸、氫氧化鉀、無水乙醇、蒸餾水等。以上所用化學試劑均為國產分析純。

2.1.3儀器

制冰機、冷藏柜、恒溫水浴鍋、多功能臺式高速冷凍離心機、T6新世紀紫外可見分光光度計、酶聯免疫檢測儀、移液槍、5mL具塞玻璃管、容量瓶、燒杯、玻璃棒、研磨棒。

2.2試驗方法

將種蚜接種到5葉1心煙苗上，任其繁殖2 d后去除母蚜。待煙蚜發育至2～3齡進行接蜂，當寄生蚜大量形成時，將寄生蚜葉片采摘置于8 ℃±0.5 ℃恒溫箱中，冷藏5 d后清除未形成僵蚜的煙蚜和寄生蚜，將僵蚜葉轉移至3 ℃（吳興富＼[5＼]等研究發現煙蚜繭蜂蛹期的最佳冷藏溫度為3～5℃）冷藏箱中，每隔10 d、20 d、30 d、40 d取出，測定不同冷藏期煙蚜繭蜂（蛹）營養物質的變化及其羽化率。以未冷藏煙蚜繭蜂（蛹）為對照，每處理3個重復。

2.2.1脂肪的測定

參照Handel＼[16＼]和Pennington＼[17＼]的方法，做了部分修改。

（1）標準曲線的制作。取7支具塞玻璃管編號1～7，分別加入2.5 mg/mL膽固醇標準溶液0、5、10、20、40、60和100 μL，每支玻璃管加100 μL氯仿甲醇溶液100 μL抽提5 min。加500 μL濃硫酸，沸水浴10 min流水冷卻后加香蘭素試劑1000 μL，充分混勻，黑暗顯色30 min后酶標儀490 nm波長下測定吸光值，以膽固醇含量為橫坐標，吸光值為縱坐標做標準曲線如圖1。

圖1煙蚜繭蜂脂肪含量測定標準曲線

（2）脂肪的提取。取煙蚜繭蜂（蛹）20頭于0.5 mL EP管中稱重（蛹重），按重量體積比1∶9加入PBS緩沖液充分研磨后于4 ℃下1000 r/min離心10 min。取中間澄清液，再以4 ℃、1000 r/min離心10 min，取上清液20 μL。

取上清液5 μL于另一只1.5 mL EP管中，加入氯仿甲醇溶液1000 μL抽提5 min后加濃硫酸500 μL，沸水浴加熱10 min，流水冷卻至室溫。加香蘭素試劑1000 μL，黑暗顯色20 min。取300 μL于酶標孔中，490 nm下測其吸光值。每處理3個重復。endprint

（3）數據處理。根據處理液的吸光值，在標準曲線上查得相應脂肪含量，按下列公式計算蟲體實際糖含量。運用SPSS17.0統計軟件進行差異性顯著分析。

2.2.2總蛋白的測定

（1）測定方法。參照Bradford＼[18＼]的方法，進行了部分修改。

（2）總蛋白的提取。準確稱取發育進度一致的煙蚜繭蜂（蛹）于1.5 mL EP管中，按重量體積比1∶9加生理鹽水后4 ℃下3000 r/min離心10 min。取上清液于1.5 mL EP管中，加生理鹽水補足1 mL，待測。

按考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒說明書操作表要求吸取上清液50 μL，加入考馬斯亮蘭3 mL，搖勻，室溫下靜置10 min，595 nm波長處進行比色測定，記錄吸光度值。每處理3個重復。

（3）數據處理。按考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒說明書上蛋白含量的計算公式得出樣品的蛋白含量，進一步計算蟲體蛋白含量。計算公式：

樣品蛋白含量（μg/mL）=測定管OD值-空白管OD值標準客OD值-空白管OD值×標準品濃度 0.563 mg/mL）；

蟲體蛋白含量（μg/mg）=樣品蛋白含量（μg/mL）×樣品稀釋量（mL）蟲體重量（mg）。

2.2.3糖類的測定

滯育昆蟲糖類的研究目前主要集中在總糖、糖原和海藻糖的變化＼[19＼]。本文參照馮慧＼[20＼]的方法測定煙蚜繭蜂（蛹）的糖含量，并對其方法進行部分修改。

（1）標準曲線的制作。取6支具塞玻璃管編號1～6，分別加入糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，前5支玻璃管加10%三氯乙酸補足1 mL。分別向6支玻璃管中加4 mL 0.2%蒽酮試劑，混勻后于沸水浴中加熱10 min，流水冷卻至室溫。平衡20min后用（型號）紫外可見分光光度計620 nm波長下進行比色分析，用空白管調零點，記錄吸光值，每處理3個重復。以吸光值為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標繪制標準曲線如圖2。

（2）總糖的提取和測定。取煙蚜繭蜂（蛹）20頭于0.5 mL EP管中稱重（蛹重）后加入20 μL蒸餾水，充分研磨后用380 μL 10%三氯乙酸分兩次沖洗研磨棒。20 ℃下5000 r/min離心5 min，移上清液于5 mL具塞玻璃管中，沉淀再加入400 μL三氯乙酸離心后合并上清液，并加蒸餾水200 μL，使提取液補足1 mL。向具塞玻璃管中加4 mL 0.2%蒽酮試劑，混勻后于沸水浴中加熱10 min，流水冷卻至室溫。平衡20 min后于620 nm下進行比色分析，記錄吸光值。每處理3個重復。

（3）海藻糖和糖原的提取和測定。取煙蚜繭蜂（蛹）20頭于0.5 mL EP管中稱重（蛹重）后加入20 μL三氯乙酸，充分研磨。用40 μL 10%三氯乙酸分兩次沖洗研磨棒。4 ℃下5000 r/min離心10 min后移上清液于1.5 mL EP管中，沉淀再加入40 μL三氯乙酸離心一次，合并上清液，棄沉淀。上清液加入無水乙醇400 μL，置于4 ℃冰箱中16 h。

16 h后，將冰箱中的上清液取出于4℃下10000 r/min離心20 min，移上清液于5 mL具塞玻璃管中，加入0.15 mol/L H2SO 1000μL，沸水浴加熱10 min冷卻后加入30%KOH 1000 μL再次加熱10 min冷卻測海藻糖用。離心后的沉淀加入1000 μL蒸餾水溶解，轉移至5 mL具塞玻璃管中測糖原用。

上述各處理中加4 mL 0.2%蒽酮試劑，混勻后于沸水浴中加熱10 min，流水冷卻至室溫。平衡20 min后于620 nm下進行比色分析，記錄吸光值。每處理3個重復。

（4）數據處理。根據處理液的吸光值，在標準曲線上查得相應糖含量，按下列公式計算蟲體實際糖含量。運用SPSS17.0統計軟件進行差異性顯著分析。

蟲體糖含量（μg/mg）=測定樣品糖含量（μg/mL）×樣品稀釋量（mL）蟲體重量（mg）

2.2.4冷藏后羽化率測定

挑取每處理中的僵蚜50頭，于25 ℃±1 ℃條件下每天定時統計羽化數，當連續5 d無成蜂羽化時，進行解剖查明其存活狀況，每處理3個重復。運用SPSS17.0統計軟件進行差異性顯著分析。

羽化率（%）=羽化數（頭）總僵蚜量（頭）×100%。

3結果與分析

3.1脂肪和蛋白含量

煙蚜繭蜂（蛹）脂肪和蛋白含量測定結果（圖3和表1）表明，蛋白是煙蚜繭蜂（蛹）體內主要的營養物質，其含量顯著高于脂肪含量。未冷藏煙蚜繭蜂（蛹）的蛋白含量116.25 μg/mg顯著高于冷藏10 d蛋白含量76.5 μg/mg（P<0.05），而脂肪含量與冷藏10 d相比差異較為顯著（P<0.05），說明煙蚜繭蜂冷藏初期是一個消耗蛋白大量積累脂肪的生理過程。冷藏10 d后，由于糖

類優先被利用，大量分解轉化為蛋白質，至冷藏20 d時，蛋白含量逐漸上升至139.57μg/mg，顯著高于冷藏10 d蛋白含量（P<0.05），而脂肪含量下降至32.94 μg/mg，顯著低于冷藏10 d脂肪含量，說明該階段大量消耗脂肪。冷藏20 d后，由于糖類代謝物質消耗殆盡（圖4和表2），為維持煙蚜繭蜂（蛹）的持續發育，其體內蛋白大量分解轉化為脂肪和糖類物質，所以含量持續下降，至冷藏30 d蛋白含量僅為51.88 μg/mg，顯著低于冷藏20 d蛋白含量139.57 μg/mg（P<0.05）。伴隨

蛋白的分解轉化，脂肪含量大幅上升，至冷藏30 d時，脂肪含量46.48 μg/mg高于20 d。冷藏40 d時，蛋白含量51.88 μg/mg和脂肪含量46.48 μg/mg與30 d相比，差異較為顯著（P<0.05）。endprint

3.2糖類含量

結合圖4和表2，可看出煙蚜繭蜂（蛹）體內的糖類代謝物質隨著冷藏時間的延長而不斷變化，在冷藏10天時總糖、海藻糖和糖原的含量均最高，分別為9.24 μg/mg、12.59 μg/mg和2.03 μg/mg，均顯著高于未冷藏（蛹）糖含量（P<0.05）。糖類作為昆蟲的能源物質，優先被利用，隨冷藏時間的延長而持續下降，至冷藏20 d時總糖、海藻糖和糖原含量僅為為3.68 μg/mg、3.46 μg/mg和1.47 μg/mg，均顯著低于冷藏10 d糖含量（P<0.05）。隨著冷藏時間的延長，糖類代謝物質消耗殆盡，冷藏20 d后，由于蛋白質的大量分解轉化，糖類代謝物質逐漸積累，至冷藏30 d時海藻糖含量7.23 μg/mg顯著高于冷藏20 d（P<0.05），而總糖和糖原含量分別為4.38 μg/mg和1.59 μg/mg與冷藏20 d糖含量無顯著差異（P>0.05）。冷藏30 d后，糖類含量隨著蛋白的持續分解而不斷升高，至冷藏40 d時，總糖和海藻糖含量升高至6.54 μg/mg和8.07 μg/mg顯著高于冷藏30 d（P<0.05），而糖原含量1.31 μg/mg與冷藏30 d無顯著差異（P>0.05）。

3.3羽化率

實驗結果（圖5和表3）表明，未經冷藏的煙蚜繭蜂羽化率為94.00%，顯著高于冷藏10 d 86.67%、20 d 49.33%、30 d 15.33%和40 d 12.67%的羽化率（p<0.05），隨著冷藏時間的延長其羽化率逐漸降低，且差異顯著。羽化率（y）與冷藏時間（d）之間呈負相關，線性相關方程式為y=-23.4d+121.8。

低溫冷藏對煙蚜繭蜂有一定的致死效應，在同等溫濕度條件下，死亡率隨冷藏時間的延長而升高，而羽化率則隨冷藏時間的延長而降低。

4結論與討論

4.1冷藏煙蚜繭蜂（蛹）營養物質的積累和轉化

關于寄生蜂低溫貯藏后其品質的評價主要集中在羽化率、成蜂壽命、寄生能力、飛行能力層面，本研究對冷藏后煙蚜繭蜂（蛹）營養物質進行測定，從生化角度去分析冷藏對煙蚜繭蜂的影響。研究結果表明，南方非滯育型煙蚜繭蜂（蛹）在冷藏初期大量積累和儲存糖類消耗蛋白，脂肪的儲存則是煙蚜繭蜂（蛹）的御寒機制；隨著冷藏時間的延長，為維持發育，糖類作為煙蚜繭蜂低溫發育的重要能源物質而優先被利用，大量轉化為蛋白，而脂肪含量則隨冷藏時間的延長而降低，即隨著低溫暴露時間的延長煙蚜繭蜂（蛹）脂肪含量呈下降趨勢； 冷藏后期蛋白質大量分解轉化為糖類和脂肪，這一階段消耗蛋白，積累糖類和脂肪，由于滯育會誘導昆蟲體內生物脂膜的重新構建＼[19＼]，因此在冷藏后期煙蚜繭蜂體內脂肪含量有所上升。即南方非滯育型煙蚜繭蜂（蛹）冷藏后營養物質的積累和轉化趨勢與北方滯育型煙蚜繭蜂（蛹）是一致的，但各類物質的含量有一定差異。這是否表明不同地域煙蚜繭蜂（蛹）營養物質含量與其滯育有關，有待進一步研究。

4.2冷藏時間與羽化率的關系

寄生蜂的低溫貯藏一直以來都是制約其商品化生產的瓶頸，也是近年來國內外學者研究的焦點。低溫冷藏寄生蜂不僅可以延緩其發育，達到延長產品貨架期的目的，而且還可以根據害蟲發生期進行貯藏期調控，利于把握生物防治與害蟲發生同步進行。趙利偉＼[22＼]和孫守慧等＼[23＼]對白蛾周氏嚙小蜂進行冷藏后發現，老熟幼蟲在3 ℃冷藏60～70 d仍可保持95%以上的出蜂率。但對煙蚜繭蜂而言，其自然出蜂率也就在95.1%左右＼[24＼]。本研究結果表明：云南地區煙蚜繭蜂自然羽化率為94.0%。

由于煙蚜繭蜂對極端低溫的適應性較差，唐文穎＼[25＼]研究發現溫度過低其羽化率顯著降低，隨著低溫貯藏時間的持續，低溫對煙蚜繭蜂存活率的影響明顯增加，致死率明顯升高。本研究結果與其相符，即在3℃條件下，冷藏時間越長死亡率越高，羽化率越低。

低溫貯藏時，煙蚜繭蜂體內水分隨冷藏時間的延長而降低，甚至脫水，從而使煙蚜繭蜂不能繼續完成發育或羽化＼[26、27＼]。此外低溫貯藏期間能量的消耗對煙蚜繭蜂存活率存在很大影響，持續低溫產生的低溫傷害積累直接影響煙蚜繭蜂體內生理過程，可能產生代謝紊亂，使其不能正常發育＼[28＼]。結合相關研究看來，低溫處理后不同地域煙蚜繭蜂羽化率有一定差異，相同處理10℃冷藏后，北京和江西兩個地區煙蚜繭蜂羽化率分別為84.98%和70.63%＼[14、29＼]。這是否表明與北方滯育型煙蚜繭蜂相比，南方非滯育型煙蚜繭蜂耐寒能力更差，故低溫冷藏后其羽化率更低。

基于前人研究結果，對云南煙區煙蚜繭蜂（蛹）體內營養物質的積累與轉化做進一步探討。結果表明，冷藏初期煙蚜繭蜂大量積累糖類和脂肪，消耗蛋白；隨著冷藏時間的延長，糖類優先被利用，大量分解轉化為蛋白質，脂肪含量有所下降；冷藏后期隨著糖類的消耗殆盡，蛋白大量分解轉化為糖類和脂肪。冷藏期間，蛋白質與脂肪存在此消彼長的關系，而糖類與蛋白質、脂肪之間又存在明顯的相互轉化現象，明確冷藏過程中煙蚜繭蜂（蛹）營養物質和轉化和積累可為后期設計冷藏方案提供理論參考，但至于這些代謝物質是如何調控煙蚜繭蜂的生理過程以及與其滯育機理是否有關還需進一步研究。研究還表明，僵蚜羽化率隨冷藏時間的延長而不斷降低。

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A Preliminary Study on the Nutriment Accumulate Translation and Eclosion Rate of Cold Storage on the Pupae of Aphidius gifuensis Ahsmaed

Chen Huaxiang1， Liu Chunming2， Ni Fengping2， Huang Kun2， Wang Chao3， Wang Jin3， Wu Daoqing3， Li Hongguang2

（1. Southwest Forestry University， Yunnann 560224， China；

2. Honghe Branch of Yunnan Tobacco Company， Mile， Yunnan， 652300， China；

3. Runcai Agricultural Science and Technology Development Company Limited in Kunming， Yunnan 650224， China）

Abstract： Aphidius gifuensis Ahsmaed is a solitary endoparasitoid of aphid， which can control aphid observably. The research on diapause of A.gifuensis has great significance for factory-like multiply A.gifuensis. In order to understand the effects of the cold storage for its metabolites and eclosion rate， the aphid mummies were transferred in refrigerator at 3℃ after they were formed under the conditions of （8±0.5） ℃. Then the content change of metabolites in aphid mummies and their correlation with eclosion rate were measured. Regression analysis showed that that the sugar and axunge content of aphid mummies reduce gradually， but the protein content increased slowly at the refrigeration early. Sugar was exploited preferentially and converted into protein， at the same time the axunge content decreased increasingly with the extension of stored time. A large number of proteins were converted into sugars and axunge when the sugar was exhausted at the late stored storage. In addition to this， the eclosion rates were 86.67%， 49.33%， 15.33% and 12.67% after stored 10d， 20d， 30th and 40d， which was lower than that of the contrast significantly. There was a phenomenon that the nutrient substance in A.Gifuensis were accumulated and transformed with the extension of storage time. The rate of emergence linear equation relationship with time in temperature 3℃.

Key words： Aphidius gifuensis ahsmaed； Nutrients； Eclosion ratesendprint