山茱萸炮制過程中美拉德反應底物的含量變化

楊光明 ， 張玉玲 ， 李 萌 ， 潘 揚 *， 蔡寶昌

（1.南京中醫藥大學，江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.國家中醫藥管理局中藥炮制標準重點研究室，江蘇 南京210023；3.國家教育部中藥炮制規范化及標準化工程研究中心，江蘇 南京 210023；4.南京中醫藥大學，藥用菌與中藥生物技術研究所，江蘇 南京 210023）

山茱萸炮制過程中美拉德反應底物的含量變化

楊光明1，2，3， 張玉玲4， 李 萌4， 潘 揚*4， 蔡寶昌1，2，3

（1.南京中醫藥大學，江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.國家中醫藥管理局中藥炮制標準重點研究室，江蘇 南京210023；3.國家教育部中藥炮制規范化及標準化工程研究中心，江蘇 南京 210023；4.南京中醫藥大學，藥用菌與中藥生物技術研究所，江蘇 南京 210023）

采用UPLC-MS/MS法檢測游離氨基酸含量，色譜柱以鍵合相C18硅膠為基質，流動相為水-乙腈，梯度洗脫，流速0.8 mL/min；采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定還原糖含量，研究山茱萸炮制過程中參與美拉德反應的底物游離氨基酸和還原糖質量分數的變化規律。山茱萸中共檢測出15種游離氨基酸。各游離氨基酸的質量分數隨著炮制時間的延長逐漸降低；還原糖質量分數在炮制中趨勢不同于氨基酸，在炮制0～24 h逐漸降低，24～36 h還原糖質量分數有所上升，36 h后其質量分數變化趨于穩定。山茱萸中游離氨基酸和還原糖質量分數的變化與炮制中的美拉德反應密切相關，美拉德反應達到平衡時間與傳統的炮制時間基本一致，這為炮制終點的判定提供了科學依據。

山茱萸；炮制；美拉德反應；游離氨基酸；還原糖

美拉德反應（Maillard reaction）[1-2]是一種非酶褐變反應，由法國化學家Maillard于1912年發現，反應指的是含游離氨基的化合物和羰基化合物在常溫或加熱時，初始階段經過羰氨縮合及分子重排，生成一些香味物質的前體成分；中間階段前體成分通過進一步脫水，縮合或分解生成呈色呈香類物質；最終階段主要是一些復雜高分子色素的形成過程，最終生成類黑精，此階段反應復雜，機制尚不清楚。中藥富含氨基酸、還原糖等美拉德反應底物，因此美拉德反應廣泛存在于中藥炮制和制劑的過程中[3]。有研究者利用還原糖與氨基酸進行了模式美拉德反應的研究[4-6]。也有對中藥紅參中美拉德反應進行研究的報道[7]。

衛生部公布《關于進一步規范保健食品原料管理的通知》中，對藥食同源物品、可用于保健食品的物品和保健食品禁用物品做出具體規定。山茱萸作為常用中藥就列在 “可用于保健食品的物品名單”中。山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉[8]，臨床上多以酒蒸品入藥，具有補益肝腎、澀精固脫的功能。研究表明，山茱萸炮制過程中發生了美拉德反應，炮制后其滋陰補腎的功效有所增強。美拉德反應的進行需要底物氨基酸、還原糖的參與。反應進行的程度與底物的含量密切相關。目前已報道了竹筍、獼猴桃等食品[9-13]和地黃、番荔枝等中藥中氨基酸的測定[14-16]，以及山楂片、瓜蔞等食品和中藥中還原糖的測定[17-21]；對于山茱萸中的氨基酸[22]、多糖也分別有所研究[23-25]，但對于氨基酸含測須經過衍生化處理，過程繁瑣，損耗較大；而還原糖的測定尚未見報道。本實驗中采用UPLC-MS/MS方法觀察山茱萸炮制過程中15種游離氨基酸的含量變化，同時采用

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

JA1103N型電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司產品；202型電熱恒溫箱：上海索普公司產品；臺式高速離心機：無錫瑞江分析儀器有限公司產品；UV-2401PC紫外檢測器：日本島津公司產品；Ultimate3000液相色譜儀：美國戴安公司產品；API 3200 Q-TRAP質譜儀：美國AB公司產品；純水機：南京易普易達科技發展有限公司產品。

氨基酸檢測試劑盒，包含15種氨基酸：天門冬酰胺 （Asn），絲 胺 酸 （Ser），精 氨 酸 （Arg），甘 氨 酸（Gly），天 門冬 氨酸 （Asp），谷氨 酸（Glu），蘇氨 酸（Thr），脯氨酸（Pro），賴氨酸（Lys），酪氨酸（Tyr），纈氨酸（Val），亮氨酸（Leu），苯丙氨酸（Phe），丙氨酸（Ala）和異亮氨酸 （Ile）（液相色譜串聯質譜聯用儀）：北京質譜醫學研究有限公司產品；乙腈為質譜純，其他試劑均為分析純。

山茱萸（生品）由安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司提供，經南京中醫藥大學藥用菌與中藥生物技術研究所潘揚教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc的干燥成熟果肉。

1.2 酒蒸山茱萸樣品的制備

取凈山萸肉，按2010版《中國藥典》酒蒸法加20%黃酒拌勻、潤透，置于蒸鍋中，常壓蒸制，分別于0、2、4、8、12、18、24、36 h 和 48 h 取出，50 ℃干燥，3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定還原糖含量，從新的角度理解山茱萸的炮制過程，研究山茱萸炮制中的美拉德反應與炮制前后成分變化的關系，為判定山茱萸的炮制終點提供了科學依據。也為炮制機理研究提供了新的思路。作為不同炮制時間的酒蒸山茱萸樣品。

1.3 游離氨基酸的質量分數測定

1.3.1 供試品溶液的制備 稱取各酒蒸山茱萸樣品粉末約50 mg，精密稱定，加2 mL水充分溶解，4℃靜置過夜提取。取0.5 mL靜提液14 000 r/min冷凍離心30min，取上清液作為游離氨基酸檢測標本[13]。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：MS Lab HP-C18（150mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：水（A）-乙腈（B）梯度洗脫：0～1 min，5%B；1～9 min，5→70%B；9～9.1 min，70% ～100%B；9.1 ～10 min，100%B；10 ～10.1 min，100%～5%B；10.1～15 min，5%B；柱溫：40 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL。

1.3.3 質譜條件 離子源：ESI電噴霧離子源，正離子模式；掃描方式：MRM多反應監測；CUR：20 psi（氣簾氣）；CAD：Medium（碰撞氣）；IS：+5 500 V（噴霧電壓）；TEM：500 ℃（霧化溫度）；GS1：55 psi（霧化氣）；GS2：60 psi （輔助氣）；EP：10 V （射入電壓）；CXP：2.0 V（碰撞室射出電壓）。

1.4 還原糖的質量分數測定

1.4.1 溶液配制 葡萄糖標準液：精密稱取80℃烘至恒重的葡萄糖100 mg，配制成1 mg/mL的葡萄糖標準液。

3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：將 6.3 g DNS和 262 mL 2 mol/L NaOH（40 g）溶液，加到 500 mL含有182 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結晶酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1 000 mL，貯存于棕色瓶中備用[17]。

1.4.2 樣品中還原糖的提取 精密稱取各酒蒸山茱萸樣品粉末1.0 g，放入100 mL燒杯中，先用少量蒸餾水調成糊狀，再加入50 mL蒸餾水，攪勻，置于50℃恒溫水浴中保溫20 min，使還原糖浸出。將浸出液（含沉淀）轉移到離心管中，于4 000 r/min離心10 min，沉淀用50 mL蒸餾水洗一次，離心，將兩次離心的上清液合并，定容至100 mL，混勻，作為樣品還原糖待測液。

1.4.3 標準曲線 取5 mL具塞刻度試管，編號，分別加入 0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 質量濃度為 1 mg/mL的葡萄糖標準液、加蒸餾水補至1 mL，再加入DNS試劑2 mL，配制成不同質量濃度的葡萄糖反應液，混合均勻，置沸水浴反應10 min，取出，流水冷卻，定容至40 mL，在540 nm波長下測定吸光度。

1.4.4 樣品測定 另取5 mL具塞刻度試管，分別加入上述提取得到的樣品還原糖待測液1 mL，加入顯色劑DNS試劑2 mL，按上述方法進行實驗。測定各樣品的吸光度，根據標準曲線計算出相應的葡萄糖含量，按下式計算出樣品中還原糖的質量百分含量（以葡萄糖計）。

式（1）中：m1為根據標準曲線計算所得葡萄糖的質量，mg；V1為提取液總體積，mL；V0為測定時取用的體積，mL；m0為樣品的質量，mg。

2 結果

2.1 游離氨基酸質量分數變化

山茱萸炮制過程中各氨基酸的質量分數變化見表1、圖1和圖2。共檢測出山茱萸中15種游離氨基酸，隨著炮制時間的延長，各游離氨基酸的質量分數及游離氨基酸總質量分數逐漸降低。炮制前期的12 h下降速率較快，12～24 h速率較慢，24 h后趨于平穩，與本研究前期檢測的美拉德反應理化參數（酸堿度，褐變程度，5-羥甲基糠醛含量）的變化趨勢一致[26]。

表1 山茱萸美拉德反應進程中游離氨基酸質量分數的變化Table 1 Contents of free amino acids in Maillard reaction of fructus corni μg/g

續表

圖1 山茱萸美拉德反應中含量最高的3種游離氨基酸的質量分數變化Fig.1 Three most high contents of free amino acids in Maillard reaction of fructus corni

圖2 山茱萸美拉德反應中游離氨基酸總質量分數變化Fig.2 Total contents of free amino acids in Maillard reaction of fructus corni

2.2 還原糖質量分數變化

2.2.1 葡萄糖標準曲線的制備 結果顯示，以吸光度（A）對葡萄糖質量X（mg）做線性回歸，得到回歸方程：Y=0.850 5X-0.031 1，相關系數 R=0.999 9，表明線性良好。

2.2.2 精密度實驗 取同一葡萄糖標準液連續測定10次，其吸光度平均值為0.483，相對標準偏差RSD為0.21%，說明儀器精確度良好。

2.2.3 重復性實驗 取同一批樣品3份，按照1.4.4項下方法進行重復實驗，結果RSD為0.63%，表明該實驗的重復性良好。

2.2.4 樣品檢測 結果如圖3所示，0～24 h，隨著炮制時間的延長，還原糖質量分數逐漸降低，炮制24h時還原糖質量分數由6.61%降低到5.65%。24 h后隨炮制繼續進行，還原糖質量分數有所上升，36 h后其質量分數變化趨于穩定。

圖3 山茱萸美拉德反應中還原糖的質量分數變化Fig.3 Contents of reducing sugars in Maillard reaction of fructus corni

3 討 論

山茱萸富含氨基酸和糖類，是美拉德反應必不可少的反應底物。本研究中采用UPLC-MS/MS法檢測了炮制前后山茱萸游離氨基酸的質量分數，并采用經典的DNS比色法測定了還原糖的質量分數。結果發現，隨著山茱萸炮制時間的延長，美拉德反應不斷進行，在最初的12 h里，作為反應底物的游離氨基酸和還原糖質量分數較高，美拉德反應速率較快，隨著反應進行底物被大量消耗，質量分數隨之迅速降低。炮制中期的12～24 h因前期的快速反應導致底物含量降低，美拉德反應速率變緩，底物繼續被消耗，質量分數持續降低。炮制24 h時，總游離氨基酸質量分數降低80%以上，部分氨基酸質量分數降低90%以上，還原糖質量分數由6.61%降低到5.65%。炮制后期的24～48 h，游離氨基酸質量分數較低，美拉德反應速度很慢，山茱萸炮制體系基本趨于穩定，游離氨基酸變化幅度很小。與之不同的是，在山茱萸炮制的24～36 h，還原糖又逐漸增加，推測是由于另一反應底物游離氨基酸在24 h內基本消耗結束，美拉德反應達到平衡，不再消耗還原糖；24 h后隨著炮制的繼續進行，多糖及糖苷類成分水解，生成還原糖，使得還原糖的質量分數有所上升，這一變化趨勢在炮制36 h后趨于穩定。

綜上所述，在山茱萸炮制過程中，美拉德反應消耗了氨基酸和還原糖，反應0～24 h游離氨基酸和還原糖質量分數降低，24 h之后質量分數穩定，提示山茱萸酒蒸24 h后，美拉德反應趨于平衡，其美拉德反應產物性質和質量分數均比較穩定，對其炮制終點的判定極具參考價值。

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歐盟發布果膠等作為食品添加劑的安全風險評估報告

2017年7月6日，歐盟委員會發布果膠（E 440i）和酰胺化果膠（E 440ii）作為食品添加劑的安全風險評估報告，食品添加劑和營養來源（ANS）評估小組認為：

1.兩種果膠不太可能被完整吸收，而是被腸道微生物群發酵形成與果膠衍生物酸性寡糖（pAOS）相似的物質；

2.對果膠和酰胺化果膠沒有遺傳毒性的跡象；

3.在人體內6周的劑量為36 g/d（相當于515 mg/kgbw/d）沒有不利影響，對于95%幼兒來說暴露量每天可達442 mg/kg bw/d。

小組得出結論：對于使用兩種果膠作為一般人群的食品添加劑，無需指定每日攝入量（ADI），對于所報道的果膠的使用水平，不存在安全問題。

［信息來源］廈門WTO工作站.歐盟發布果膠等作為食品添加劑的安全風險評估報告[EB/OL].(2017-7-10).http://www.xmtbt-sps.gov.cn/detail.asp?id=54815

Content Changes of Substrates of Maillard Reaction during Processing of Fructus Corni

YANG Guangming1，2，3， ZHANG Yuling4， LI Meng4， PAN Yang*4， CAI Baochang1，2，3
（1.Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2.Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Standardization of Chinese Medicine Processing，Nanjing 210023，China；3.Engineering Center of State Ministry of Education for Standardization of Chinese Medicine Processing ，Nanjing 210023，China；4.Laboratory of Medical Fungi and Phyto-Biotech，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

To study content changes of free amino acids and reducing sugars of Maillard reaction during processing of fructus corni，UPLC/MS/MS was adopted to detect the contents of free amino acids.Chromatographic column of MS Lab HP-C18was used for analysis，with water-acetonitrile asgradient elution mobile phase，and flow rate at 0.8 mL/min.DNS method was used in determination of reducing sugars.Totally 15 kinds of free amino acids were detected in fructus corni.The content of free amino acids reduced gradually with processing time.While the content of reducing sugars changed differently from those of free amino acids，which reduced gradually in 0～24 h，increased slightly in 24～36 h and then became to be stable.The content changes of free amino acids and reducing sugars have close relationship with Maillard reaction during processing of fructus corni.The time of Maillard reaction for fructus corni to reach its equilibrium is in accordance with that of traditional processing，which provides a scientific base for determining processing end.

fructus corni，processing，maillard reaction，free amino acid，reducing sugar

R 284.1

A

1673—1689（2017）08—0884—06

10.3969/j.issn. 1673-1689.2017.08.015

2015-09-08

江蘇省高校自然科學研究重大項目（12KJA360001）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（PAPD），江蘇高校品牌專業建設工程一期項目（PPZY2015A068）。

楊光明（1974—），女，江蘇南京人，藥學博士，副研究員，主要從事中藥炮制及質量標準研究。E-mail：ygmm0901@hotmail.com

*通信作者：潘 揚（1964—），男，江蘇揚州人，藥學博士，教授，博士研究生導師，主要從事中藥化學與生物技術方向研究。E-mail：y.pan2006@163.com

楊光明，張玉玲，李萌，等.山茱萸炮制過程中美拉德反應底物的含量變化[J].食品與生物技術學報，2017，36（08）：884-889.