液態發酵麩醋工藝優化及其風味品質研究

胡凱弟 ， 趙 爽 ， 彭 楊 ， 周 康 ，2， 敖曉琳 ，2， 何 利 ，2， 劉書亮 *，2

（1.四川農業大學 食品學院，四川 雅安 625014；2.農產品加工及貯藏工程四川省重點實驗室，四川 雅安625014）

液態發酵麩醋工藝優化及其風味品質研究

胡凱弟1， 趙 爽1， 彭 楊1， 周 康1，2， 敖曉琳1，2， 何 利1，2， 劉書亮*1，2

（1.四川農業大學 食品學院，四川 雅安 625014；2.農產品加工及貯藏工程四川省重點實驗室，四川 雅安625014）

為提高液態發酵食醋品質，在其傳統工藝基礎上添加麩皮浸出液，以四川麩醋醋醅中篩選的優良巴氏醋酸菌為菌種，根據單因素實驗確定影響醋酸發酵的顯著因素，并通過Box-Behnken設計試驗優化，其最優發酵條件為：麩曲添加質量分數1.11%、醋酸菌接種體積分數13.71%、醋酸發酵溫度31.50℃，在此條件下產酸量為68.48 g/L。以四川某醋廠生產的液態發酵食醋為對照，對所得液態發酵麩醋進行感官評價、揮發性成分和游離氨基酸分析。液態發酵麩醋口感柔和、香味獨特，檢測出20種揮發性成分、17種游離氨基酸；游離氨基酸總量為805.29 mg/dL，各項指標均優于液態發酵食醋，品質明顯提升。

液態發酵麩醋；巴氏醋桿菌；發酵條件；優化；品質

四川麩醋作為中國傳統名醋之一，其釀造原料主要為麩皮和獨特的生料固態發酵工藝，是造就其產品色澤深厚、香味濃郁，口感醇厚等特點的主要原因[1-2]；但該工藝存在淀粉利用率和機械化程度低、生產周期長等缺點[3]。液態發酵食醋是利用人工接種純培養物結合機械自動化操作釀造的，其原料利用率高、酸度較高、周期短，但食醋風味較差[4]。因此，結合四川麩醋優點對液態發酵食醋進行品質提升，具有重要的實際生產意義。

目前國內外關于提升液態發酵食醋品質多集中在工藝參數優化和菌種強化等研究方面。Kang等[5]為了提高蘋果醋醋酸含量，優化了初始酒精度數、蘋果汁濃度和接種量等條件；Qi等[6]通過調整醋酸菌生物量使醋化率增加了20%；Gullo M等[7]篩選出優良醋酸菌并應用于發酵，以改善產品品質；Zhang等[8]將啤酒添加于種子液中，使山楂醋醋酸產量增加；趙春燕等[9]利用醋酸菌、乳酸菌、酵母菌協同發酵并添加鮮味劑，改善了液態發酵食醋風味。麩皮作為四川麩醋主要釀造原料之一，具有抗氧化、降低膽固醇等生理功能[10]，賦予麩醋獨特的風味和保健作用[2]；有研究表明，將麩皮添加于玉米或杜仲葉醋中能增加醋的功能性和良好風味[11-12]，然而將麩皮作為原料之一用于液態食醋工藝、提高其品質的研究還未見報道。考慮到是液態發酵生產食醋，本試驗在其傳統工藝基礎上，將麩皮浸出液添加于釀造原料中，并接種優良醋酸菌種子液；同時利用Box-Behnken響應面優化了麩曲添加量、醋酸菌接種量和醋酸發酵溫度等發酵條件，通過感官評價和風味物質分析，探討該方法對醋品質的影響，為提升液態發酵食醋品質提供理論依據和數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 從四川麩醋醋醅中分離的2株產酸能力較強的巴氏醋桿菌 （Acetobacter pasteurianus）A30-16 和 C9-4[13]，啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y1，由四川農業大學食品微生物實驗室提供；黑曲霉（Aspergillus niger） CICC 2279，購自中國工業微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養基與試劑 基礎培養基：酵母膏10 g，葡萄糖10 g，水1 000 mL；自然pH，使用前加入（體積分數）3%無水乙醇，121℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖培養基（PD）：葡萄糖20 g，新鮮去皮土豆 200 g， 水 1 000 mL；pH 7.0，121 ℃滅菌20 min，固體培養基添加20 g/L瓊脂粉。

無水乙醇、氫氧化鈉為分析純（AR），成都科龍試劑廠；α-淀粉酶，北京奧博星生物技術有限責任公司產品；小麥麩皮、大米，當地市場購置；液態生醋，四川某醋廠提供。

1.1.3 儀器 7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀，美國 Agilent Technologies公司產品；Milli-Q Gradient超純水系統，美國Millipore公司產品；手動SPME進樣器、DVB/CAR/PDMS三極萃取纖維頭、15mL萃取瓶，美國Supelco公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品準備 麩皮浸出液：稱取100 g麩皮與800 mL水混勻后于40℃條件下水浴30 min，過濾并取濾液，用水補至1 000 mL，現制現用。

麩曲的制備：稱取10 g麩皮加水11 mL混勻，121℃滅菌30 min。接種活化后的黑曲霉2～3環，于30℃培養78 h。

酵母種子液的制備：從斜面挑取2～3環接種于PD培養基，30℃靜置培養（22±2）h，即為酵母菌種子液。

醋酸種子液的制備：從甘油保藏管中挑取接種于基礎培養基，30℃、120 r/min振蕩培養 （22±2）h進行活化，然后按體積分數2%再次接種于基礎培養基，30 ℃、120 r/min 振蕩培養（22±2）h，即為醋酸菌種子液。

1.2.2 工藝流程 按圖1所示進行，其中大米粉∶麩皮浸出液∶水=4∶10∶3 （質量比），α-淀粉酶質量分數0.25%，麩曲質量分數0.8%，酵母菌體積分數10%，醋酸菌體積分數10%，33℃振蕩培養。

1.2.3 總酸測定 參照GB/T 5009.39-2003。

1.2.4 菌種比例優化 待發酵液酒精體積分數為5%時接入醋酸菌，菌株C9-4與A30-16接種體積分數分別為（5+5`）%、（4+6`）%、（6+4`）%、（3+7`）%、（7+3`）%、（8+2`）%、（2+8`）%、（10+0`）%、（0+10`）%。間隔24 h測定產酸量，72 h后結束發酵。

1.2.5 單因素實驗設計 參照1.2.2工藝，根據表1進行單因素實驗，其中菌株C9-4和A30-16接種體積分數依據1.2.4。

圖1 工藝流程Fig.1 Picture of flow chart

表1 單因素實驗因素與水平Table 1 Factors and levels for single-factor experiments

1.2.6 響應面實驗設計 在單因素實驗基礎上，采用中心組合實驗設計原理，選擇對產酸量影響顯著的 3 個因素為自變量（X1、X2、X3），產酸量（Y）為響應值，展開3因素3水平的響應面優化實驗，待總酸不再增加時結束發酵，測定產酸量。建立最小二乘法擬合二次多項式數學模型，利用此模型確定最佳發酵條件。

1.2.7 品質特性分析 發酵結束后取上清液即生醋，與四川某醋廠生產的液態發酵生醋（即原料中未添加麩皮浸出液的普通食醋）同時沸水浴60 min制得熟醋，分別是液態發酵麩醋和液態發酵食醋，進行品質特性分析。

1）感官評價 參照GB 18187-2000。

2）揮發性物質的測定 采用頂空固相微萃取—氣質聯用法（HS-SPME-GC-MS）。

①萃取頭老化 萃取頭首次使用先在進樣口250℃老化2 h，以后每次使用前老化30 min。

②樣品處理 取6 mL醋于15 mL的頂空瓶中，加入1.0 g氯化鈉，40℃加熱平衡15 min，將老化好的萃取頭插入瓶中，使之與液面保持1.5 cm，40℃萃取30 min，進樣。

③GC-MS的參數 色譜條件：色譜柱HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度30℃，保持3 min，4℃/min升溫至150℃；8℃/min升溫至180℃；10℃/min升溫至250℃，保持10 min。載氣（He）流速 1.0 mL/min，不分流。

質譜條件：電子轟擊離子源（EI）；電子能量：70 eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：280℃；四級桿溫度：150 ℃；掃描范圍（m/z）：30～400。

3）游離氨基酸的測定 將2種熟醋樣品分別過0.45 μm膜，送成都糧油食品飼料質量監督檢驗測試中心測定游離氨基酸含量。

2 結果與分析

2.1 菌株比例優化結果

由表2可知，相比于單一菌株，接種混合菌株產酸量均有不同程度的升高。按體積分數（6+4`）%接種時不僅產酸最快，達到60 g/L（特級醋）僅需4 d，且產酸量最高，為65.08 g/L。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 麩曲添加質量分數對產酸量的影響 如圖2所示，在一定范圍內（0.2%～1%），發酵液產酸量與麩曲添加質量分數呈正相關，在質量分數1%時產酸量達到最大；當添加質量分數大于1%時，產酸量反而略有下降，可能是添加過量麩曲致使糖化力增強產生高濃度糖液，酵母菌代謝過盛進而影響醋酸發酵過程[14]。

表2 不同菌株比例對產酸量的影響Table 2 Influence of different proportions of strains on acid production

圖2 麩曲添加質量分數對產酸量的影響Fig.2 Influenceofaddition ofbran kojion acid production

2.2.2 酵母菌接種體積分數對產酸量的影響 由圖3可知，當酵母菌接種體積分數在0.5%～1%時，產酸量隨著接種體積分數的增加而迅速上升；1%～10%時，隨著接種體積分數的增加，產酸量增加緩慢并在10%時達到最大值；當接種體積分數＞10%，產酸量與接種體積分數呈負相關，這與覃莉[15]等研究結果相一致。

2.2.3 醋酸菌接種體積分數對產酸量的影響 從圖4可以看出，當醋酸菌接種體積分數＜10%時，產酸量隨著接種體積分數的增加而顯著上升；超過10%后發酵液產酸量反而略有下降。可能是發酵液中營養物質大多用于細胞增殖，而用于醋酸發酵的底物減少[16]。

圖3 酵母菌接種體積分數對產酸量的影響Fig.3 Influence of yeast on acid production

圖4 醋酸菌接種體積分數對產酸量的影響Fig.4 Influence of inoculation of acetic acid bacteria on acid production

2.2.4 醋酸發酵溫度對產酸量的影響 從圖5可知，不同溫度下醋酸發酵效果差異明顯。隨著溫度升高，產酸量呈現先上升后下降的趨勢，與王穎等[16]研究結果相吻合。當發酵溫度高于33℃時，產酸量隨著溫度的上升而直線下降。30℃時產酸量達到最大。

圖5 醋酸發酵溫度對產酸量的影響Fig.5 Influence of acetic acid fermentation temperature on acid production

2.3 響應面優化實驗結果

2.3.1 實驗的設計及其結果 在單因素實驗基礎上，采用Box-Behnken設計法，選擇對產酸量影響較大的麩曲添加質量分數（X1）、醋酸菌接種體積分數（X2）、醋酸發酵溫度（X3）進行優化實驗設計，響應面實驗因素與水平見表3，Box-Behnken實驗設計結果見表4。

表3 響應面實驗因素與水平Table 3 Factors and levels for response surface methodology

表4 Box-Behnken實驗設計結果Table 4 Results of Box-Behnken experimental design

利用Design-Expert.8.05軟件對表4實驗數據進行多元回歸擬合，得到3個因素的二次多項式回歸方程為：

該模型方差分析結果見表5，該模型回歸極顯著（P＜0.01），且失擬項不顯著（P＞0.05）；校正決定系數R2adj為0.944 4，說明該模型與實際擬合，可以解釋94.44%響應值的變化。擬合方程一次項X1、X2、X3對產酸量影響極顯著（P＜0.01），二次項 X12、X22、X32對產酸量影響極顯著（P＜0.01），說明了麩曲添加質量分數、醋酸菌接種體積分數、醋酸發酵溫度3個因素對產酸量的線性效應和曲面效應均顯著，且這3個因素對產酸量影響程度依次為醋酸菌接種體積分數＞醋酸發酵溫度＞麩曲添加質量分數。交互項X1X2對產酸量影響極顯著（P＜0.01），X1X3、X2X3不顯著（P＞0.05）。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance on regression model

2.3.2 工藝條件優化及驗證 結合響應面結果及等高線圖（見圖6—圖8），當醋酸發酵溫度為30℃，麩曲添加質量分數0.8%～1.3%、醋酸菌接種體積分數11%～16%時，產酸量達到最大值；當醋酸菌接種體積分數為12%，麩曲添加質量分數1%～1.4%、醋酸發酵溫度29～35℃時，產酸量達到最大值；當麩曲添加質量分數1.2%，醋酸菌接種體積分數11%～16%、醋酸發酵溫度29～35℃時，產酸量達到最大值。

通過軟件分析得到最大產酸量工藝條件為：麩曲添加質量分數1.11%、醋酸菌接種體積分數13.71%、醋酸發酵溫度31.50℃，此時產酸量可達到68.48 g/L。經驗證在該條件下實際產酸量為67.97 g/L，與預測值擬合性較好。

2.4 液態麩醋品質特性

2.4.1 2種液態醋的感官評價結果 按照1.2.7所述方法，將制好的2種熟醋于室溫下放置5 d后進行感官評價，結果見表6。可以看出無論從色澤、香氣還是滋味上，液態發酵麩醋都優于液態發酵食醋。

圖6 麩曲添加質量分數和醋酸菌接種體積分數的響應面分析圖和對應的等高線Fig.6 Response surface and contour map for the addition of bran koji and inoculation of acetic acid bacteria

圖7 麩曲添加質量分數和醋酸發酵溫度的響應面分析圖和對應的等高線Fig.7 Response surface and contour map for the addition of bran koji and temperature of acetic acid fermentation

圖8 醋酸菌接種體積分數和醋酸發酵溫度的響應面分析圖和對應的等高線Fig.8 Response surface and contour map for the inoculation of acetic acid bacteria and temperature of acetic acid fermentation

表6 2種食醋感官評價結果Table 6 Sensory evaluation results of 2 kinds of vinegar

2.4.2 2種液態醋的揮發性香氣成分比較結果 采用HS-SPME-GC-MS法分析兩種醋的揮發性風味物質，結果見表7。液態發酵麩醋中共檢出20種揮發性成分，其中醇類物質3種、酸類3種、羰基類化合物5種、酚類1種，以及8種酯類化合物。所占比例最多的是酯類物質，主要是乙酸苯乙酯和乙酸異戊酯，其面積分數分別是8.21%與2.43%，這與Guerrero E D等[17]結果相似。所檢測到的物質中，苯乙醇、糠醛、苯甲醛、乙酸苯乙酯、4-乙基-2-甲氧基苯酚等共同構成了液態發酵麩醋良好風味[18]。而液態食醋中僅檢測出11種揮發性風味物質，包括1種醇類、3種酸類、1種醛類以及6種酯類化合物。

表7 2種食醋中的揮發性成分Table 7 Contents of volatile constituents in 2 kinds of vinegar

2.4.3 2種液態醋的游離氨基酸比較結果 由表8可以看出，液態發酵麩醋中共檢出17種游離氨基酸，其中人體必需氨基酸7種，游離氨基酸總量為805.29 mg/dL，氨基酸種類和含量明顯多于液態食醋（共檢出12種游離氨基酸，游離氨基酸總量僅為3.38 mg/dL），其中谷氨酸、丙氨酸、精氨酸的含量分別是液態食醋的1379、2024和895倍，給液態發酵麩醋帶來獨特的風味和生理作用[19]。

表8 2種食醋中游離氨基酸的質量濃度Table 8 Contents of free amino acid in 2 kinds of vinegar mg/dL

3 結 語

本試驗在傳統液態食醋基礎上，添加麩皮浸出液，以四川麩醋醋醅中篩選的優良醋酸菌為菌種，通過單因素和Box-Behnken試驗設計對液態發酵麩醋工藝條件進行優化，得到最優發酵條件：麩曲添加質量分數1.11%、醋酸菌接種體積分數13.71%、醋酸發酵溫度31.50℃，在該條件下產酸量可達到68.48 g/L。王穎等[16]優化了薏苡仁醋酸發酵條件，優化后醋酸產量能達到6.76 g/dL；高寅等[20]對液態深層發酵果醋工藝進行優化，醋酸酸度在5.5×10-2g/mL左右，均低于本試驗優化結果，這可能與菌種本身產酸能力有關。

品質特性分析結果顯示，無論從香氣還是滋味上，液態發酵麩醋感官評價都優于液態發酵食醋。液態發酵麩醋中共檢測出20種揮發性風味物質，其中醇類物質3種、酸類3種、羰基類化合物5種、酚類1種以及8種酯類化合物，檢測出17種游離氨基酸，游離氨基酸總量為805.29 mg/dL；兩種風味物質的種類和數量均多于液態發酵食醋，品質提升明顯。由此可見，原料中添加麩皮浸出液效果較好，方法可取。

[1]SHANG Ying.Study on traditional processing technology of Langzhong baoning vinegar[J].China Brewing，2003，22（6）：32-33.（in Chinese）

[2]MIU Jie，MA Huixiang.The function of Sichuan grain vinegar[J].Jiangsu Condiment and Subsidiary Food，2005，22（4）：35-36，39.（in Chinese）

[3]DENG Yuanjun.Production technology of bran vinegar[J].China Brewing，2011，30（11）：153-154.（in Chinese）

[4]WOOD B J B.Microbiology of fermented foods[M].2nd.Berlin：Springer Science&Business Media，1998：1-44.

[5]KANG B H，SHIN E J，LEE S H，et al.Optimization of the acetic acid fermentation condition of apple juice[J].Korean Journal Food Preservation，2011，18（6）：980-985.

[6]QI Z L，YANG H L，XIA X L，et al.A protocol for optimization vinegar fermentation according to the ratio of oxygen consumption versus acid yield[J].Journal of Food Engineering，2013，116（2）：304-309.

[7]GULLO M，CAGGIA C，VERO D L，et al.Characterization of acetic acid bacteria in “traditional balsamic vinegar” [J].International Journal of Food Microbiology，2006，106（2）：209-212.

[8]ZHENG Y，ZHANG K P，WANG C X，et al.Improving acetic acid production of Acetobacter pasteurianus AC2005 in hawthorn vinegar fermentation by using beer for seed culture[J].International Journal of Food Science&Technology，2010，45（11）：2394-2399.

[9]ZHAO Chunyan，WANG Peng，WANG Shuqin，et al.Improvement of flavor and color of vinegar produced by submerged fermentation[J].China Brewing，2008，27（19）：59-61.（in Chinese）

[10]WU Hui，HOU Ping，LI Xiaofeng，et al.Research pogress in extraction of dietary fibers from different materials and their characteristics[J].Modern Food Sience and Technology，2008，24（1）：91-95.（in Chinese）

[11]ZHANG Zhanguo，REN Bo，LI Zhixi，et al.Reinforce effect of brans and Aspergillus niger on the functionality of corn vinegar[J].Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica，2008，17（5）：325-329.（in Chinese）

[12]HAO Jianxin，LIU Yiwei，YANG Yang，et al.Use of chlorogenic acid as target to optimize the formula of vinegar fermented with eucommia leaves[J].Science and Technology of Food Industry，2013，34（3）：168-172.（in Chinese）

[13]SHAO Xiangli，ZHAO Shuang，LIU Shuliang.Screening of high quality acitic acid bacteria from grains of Sichuan bran vinegar and itscharacteristicsofproducingacid[J].Science and Technology of Food Industry，2015，36（6）：203-207，211.（in Chinese）

[14]YE Riying，WU Bin，CHEN Haiyan.The separation of acetic bacteria advantage lies in acid production and grey relational analysis on its proliferation and acid production with ethyl alcohol[J].Science and Technology of Food Industry，2015，36（6）：162-165.（in Chinese）

[15]TAN Li，WANG，CHEN Xiong，et al.High-yield production of acetic acid by mixed fermentation with yeast and acetic acid bacteria[J].China Brewing，2012，31（1）：144-147.（in Chinese）

[16]WANG Yin，HAN Jianquan，YU Yijun，et al.Optimization of acetic fermentation process for semen coicis binegar response surface methodology[J].Food Science，2013，34（21）：292-296.（in Chinese）

[17]GUERRERO E D，MARIN R N，MEJIAS R C，et al.Stir bar sorptive extraction of volatile compounds in vinegar：validation study and comparison with solid phase microextraction[J].Journal of Chromatography A，2007，1167（1）：18-26.

[18]UBEDA C，CALLEJON R M，HIDALGO C，et al.Determination of major volatile compounds during the production of fruit vinegars by static headspace gas chromatography-mass spectrometry method[J].Food Research International，2011，44（1）：259-268.

[19]CALLEJON R M，TRONCOSO A M，MORALES M L.Determination of amino acids in grape-derived products：a review[J].Talanta，2010，81（4）：1143-1152.

[20]GAO Yin，HUANG Qiuyun，CHEN Zhong，et al.Optimization of submerged fermentation for fruit vinegar production[J].2010，25（12）：1419-1422，1418.（in Chinese）

Optimizing Production of Liquid-State Fermented Bran Vinegar and Study on Its Quality of Flavor

HU Kaidi1， ZHAO Shuang1， PENG Yang1， ZHOU Kang1，2，AO Xiaolin1，2， HE Li1，2， LIU Shuliang*1，2
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，China；2.Key Laboratory of Agricultural Products Processing and Preservation Engineering，Ya'an 625014，China）

In order to improve the quality of liquid-state fermented vinegar，based on the traditional techniques，bran leachate was added into fermentation system，and Acetobacter pasteurianus isolated from the normal grains of Sichuan bran vinegar was inoculated.The significant factors which influence acetic acid fermentation were confirmed by single factor experiment，then the fermentation process was optimized by response surface methodology designed by Box-Behnken principle.The optimum fermentation conditions were as follows：the addition quantity of bran koji was 1.11%，the inocula biomass acetic acid bacteria was 13.71%，fermentation temperature was 31.5℃.Under these conditions，the acid production reached 68.48 g/L.Using liquid vinegar obtained from one factory atSichuan as a control，the quality of liquid-state fermented bran vinegar was estimated with sensory evaluation，volatile constituents and free amino acid indexes.The results showed that the liquid-state fermented bran vinegar possessed pure taste and unique aroma.20 volatile components and 17 free amino acids were identified in the liquid-state fermented bran vinegar.The total content of free amino acids was 805.29 mg/dL.Quality of liquid-state fermented bran vinegar was significantly improved.

liquid-state fermented bran vinegar，Acetobacter pasteurianus，fermentation condition，optimization，quality

TS 264.2

A

1673—1689（2017）08—0869—08

10.3969/j.issn. 1673-1689.2017.08.013

2015-06-24

四川省農業科技成果轉化資金項目（14NZ0012）。

*通信作者：劉書亮（1968—），男，重慶人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事食品微生物與發酵方面研究。E-mail：lsliang999@163.com

胡凱弟，趙爽，彭楊，等.液態發酵麩醋工藝優化及其風味品質研究[J].食品與生物技術學報，2017，36（08）：869-876.