哮喘患者外周血單個核細胞TLR4mRNA及NF-κBmRNA的表達及臨床意義

楊麗霞 董瓊 蔣莉 何大川 高菡 謝勇

哮喘患者外周血單個核細胞TLR4mRNA及NF-κBmRNA的表達及臨床意義

楊麗霞 董瓊 蔣莉 何大川 高菡 謝勇

目的檢測外周血單個核細胞TLR4mRNA及NF-κBmRNA在哮喘患者中的表達，探討其在哮喘發病機制中的作用以及臨床意義。方法選取80例確診哮喘患者，根據哮喘分級標準，分為急性發作組(A組)和慢性持續期組(B組)，每組40人，經治療癥狀體征好轉后，分別作為臨床緩解期組，選取同期健康體檢者40例作為健康對照組(C組)，應用RT-PCR法檢測PBMC中TLR4mRNA及NF-κBmRNA的表達，應用ELISA法檢測血清IL-6的表達水平。結果A組患者的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表達均明顯高于B組(P<0.05)。A組和B組患者的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6的表達均明顯高于C組(P<0.05)。A組和B組哮喘患者經治療后的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表達明顯低于治療前，且高于C組(P<0.05)。哮喘患者TLR4mRNA、NF-κBmRNA及IL-6三者的表達相成正相關(P<0.05)。結論TLR4mRNA、NF-κBmRNA及IL-6共同參與了哮喘的發生和發展，三者可能存在于同一傳導通路。

哮喘；TLR4mRNA；NF-κBmRNA；IL-6

支氣管哮喘是一種以嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等多種細胞和細胞因子浸潤的慢性氣道炎癥性疾病，世界衛生組織(WHO)調查顯示，目前全世界約有2億哮喘患者，其中有1500萬喪失勞動力[1]。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)中的重要成員，在固有免疫機制中可以傳導炎癥信號，并能夠識別病原相關的分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMP)，從而激活單個核細胞因子-κB，引發一系列的信號傳導，導致大量細胞因子、趨化因子、黏附分子等炎性介質的釋放[2-3]。本研究旨在探討 TLR4mRNA及NF-κBmRNA的表達在哮喘患者中的臨床意義，并分析其相關性。

資料與方法

一、研究對象及分組

選取2015年10月至2016年8月期間在本院確診的哮喘患者80例。其中男性42例，女性38例，年齡19-74歲，平均(57.3±7.5)歲。根據《支氣管哮喘防治指南》對哮喘的分級標準[4],分為A組和B組。A組為急性發作期患者40例，其中男性21例，女性19例，患者年齡19-73歲，平均(53.1±7.2)歲；B組為慢性緩解期患者40例，其中男性20例，女性20例，年齡20-76歲，平均(58.4±7.3)歲；急性發作前患者治療后癥狀和體征好轉，作為臨床緩解期組。C組為健康對照組40例，均為隨機同期在我院體檢中心的健康體檢者，年齡為18-75歲。平均年齡為(55.6±6.8)歲。所有入選者2周內未使用糖皮質激素，除外高血壓、糖尿病、腫瘤等疾病。三組受試者在性別、年齡上無明顯差異(P>0.05)。

二、主要試劑

人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司)，Trizol試劑(TakaRa公司，JAPAN)，實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(TakaRa公司, JAPAN)，熒光染料試劑盒Power SYBR Green PCR Master Mix(TakaRa公司,JAPAN)，人IL-6定量ELISA試劑盒 (neobiosciense公司，中國)。

三、標本采集

采集外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝后進行離心。應用人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司，中國)分離出PBMC，血清及PBMC分別保存于-20℃備用。

四、RT-PCR檢測TLR4mRNA及NF-κBmRNA RT-PCR的表達

提取RNA，并按逆轉錄試劑說明書建立反應體系，總體積為20 μL。反應條件(40個循環)：95℃10 min，95℃15 s。60℃ 1 min。每份標本作復孔，復孔間Ct值差異控制在0.5內。應用2-△△Ct值相對定量法，對后期數據進行處理。

五、 ELISA法檢測IL-6的表達

應用IL-6ELISA試劑盒，嚴格按照說明書進行操作，檢測各組血清中IL-6的濃度。

六、統計學方法

結 果

一、 A組患者的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表達均明顯高于B組(P<0.05)。A組和B組患者的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6的表達均明顯高于C組，P<0.05，。(見表1)。

表1 各組TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表達

二、A組和B組哮喘患者經治療后的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表達明顯低于治療前，且高于C組，P<0.05，(見表2)。

表2 哮喘治療前后TLR4mRNA、NF-κBmRNA的水平及IL-6表達

三、哮喘患者TLR4mRNA與NF-κBmRNA的表達成正相關，相關系數r=0.73，P<0.05；哮喘患者TLR4mRNA與IL-6的表達成正相關，相關系數r=0.76，P<0.05;哮喘患者NF-κBmRNA與IL-6的表達成正相關，相關系數r=0.84，P<0.05。(見表3)。

表3 TLR4mRNA、NF-κBmRNA的水平及IL-6表達三者的相關性研究

#P<0.05 表示相關性顯著

討 論

支氣管哮喘是一種內源性和外源性免疫系統共同作用所致的變態性炎癥，氣道壁結構出現異常改變以及氣道高反應性是其主要特點，隨著對哮喘的研究不斷深入，我們逐漸更加關注哮喘炎癥的機制[5]。TLR4的生物結構模式是一種I型跨膜受體蛋白，表達于CD14陽性的細胞，也表達于CDl4陰性的細胞，它主要由三個部分組成：胞外結構區、跨膜結構段和胞內結構區。環境中的許多變應原，比如屋內塵螨(HDM)、病毒感染、內毒素都能夠與機體的PRRs結合，而屋塵螨(HDM)是TLR4的主要配體之一，機體TLR4識別環境中的HDM后，可以激活胞內NF-κB及相關蛋白激酶，進一步釋放相關的細胞因子，如IL-6，IL-8等，IL-6是趨化因子家族中的一員，其生物效應極為廣泛，具有調節細胞增殖、細胞分化、免疫防御機制等多種功能[6-7]。

本研究數據顯示，A組患者的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表達均明顯高于B組(P<0.05)。A組和B組患者的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6的表達均明顯高于C組(P<0.05)。這充分證實了TLR4mRNA、NF-κBmRNA的及IL-6均參與了哮喘的發病，并且在哮喘的急性發作期具有更顯著的表達。國外[8]研究發現TLR4不僅能夠激活下游炎癥傳導，還參與了多種細胞的遷移，與哮喘密切相關，同我們的研究結果一致。本研究還發現，A組和B組哮喘患者經治療后的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表達明顯低于治療前，且高于C組(P<0.05)。說明TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表達和病情的嚴重程度具有相關性，因此，可能成為衡量哮喘嚴重程度的重要指標。而IL-6作為一種發現較早的炎癥因子，其在哮喘中的意義和價值已經得到了廣泛認同[9],但是TLR4mRNA及NF-κBmRNA在哮喘患者中的臨床價值，仍需要大樣本的研究繼續探索。此外，在相關性分析中我們發現，哮喘患者LR4mRNA、NF-κBmRNA及IL-6三者的表達均成正相關，提示我們，三者或許在同一傳導途徑，其機制可能是當機體受到外界環境中的變應原的刺激，可引起機體的免疫應答和炎癥反應，激活TLR4/NF-κB分子途徑，從而誘導釋放炎癥信號，促進IL-6等炎癥因子的釋放。Hammad[10]等通過嵌合子小鼠模型實驗，認為TLR4表達于呼吸道上皮表面，其可介導上皮細胞和氣道內DCs相互作用，誘導機體各類變態反應，激活NF-κB傳導通道，而Toledo 等[11]在哮喘小鼠中的研究發現，二氫黃酮類能夠抑制NF-κB 的表達，減少促炎細胞因子的合成和釋放，阻斷哮喘的瀑布式炎癥反應，這進一步證實了我們的推論。

綜上所述，TLR4/NF-κB參與了哮喘的發生和發展，并通過一系列的信號傳導，誘導其他炎癥因子的釋放，進一步加重哮喘的炎癥反應，因此，阻斷外界致敏性刺激對TLR4的激活或者阻斷TLR4/NF-κB傳導途徑，可能為哮喘的防治提供新的思路，值得我們繼續探索。

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[2] Miyata R,van Eeden SF.The innate and adaptive immune response induced byalveolar macrophages exposed to ambient particulate matter[J].Toxicol Appl Pharmacol,2011,257(2):209-226.

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[5] Molassiotis A,Bryan G,Caress A,et al.Pharmacological and non-pharmacological interventions for cough in adults with respiratory and non-respiratory diseases:A systematic review of the literature[J].Respir Med,2010,104(7):934-944.

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[11] Toledo AC,Sakoda CP,Perini A,et al.Flavonone treatment reverses airway inflammation and remodelling in an asthma murine model[J].Br J Pharmacol,2013,168(7):1736-1749.

ExpressionandclinicalsignificanceofTLR4mRNAandNF-κBmRNAinperipheralbloodmononuclearcellsofasthmapatients

YANGLi-xia,DONGQiong,JIANGLi,HEDa-chuan,GAOHan,XIEYong

DepartmentofRespiratoryMedicine,NanchongCentralHospital,Nanchong,Jiangsu637000,China

ObjectiveTo examine the expression of TLR4mRNA and NF-κBmRNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of asthma patients and to study their roles in the pathogenesis of asthma as well as their clinical significance.Methods80 asthma patients were involved and they were divided into the acute attack group (the group A) and the chronic duration group (the group B) based on clinical classifications of asthma, and each group had 40 patients. After treatment, the improvement in symptoms and physical signs was observed. 40 healthy individuals were selected as the control group (the group C). RT-PCR was used to examine the expressions of TLR4mRNA and NF-κBmRNA in PBMC, and ELISA was applied to detect the expression of serum IL-6.ResultsTLR4mRNA, NF-κBmRNA and IL-6 had significantly higher expressions in the group A than in the group B (P<0.05). The expressions of TLR4mRNA, NF-κBmRNA and IL-6 in the group A and the group B were significantly higher than in the group C (P<0.05). In addition, after treatment dramatic falls were observed in the expressions of TLR4mRNA, NF-κBmRNA and IL-6 in the group A and the group B which were still higher than those of the group C (P<0.05). The expressions of TLR4mRNA, NF-κBmRNA and IL-6 showed positive correlations (P<0.05).ConclusionTLR4mRNA, NF-κBmRNA and IL-6 are all responsible for the pathogenesis of asthma and they are may exist in the same pathway.

asthma; TLR4mRNA; NF-κBmRNA; IL-6

2017-02-04]

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.11.019

637000 四川 南充，南充市中心醫院呼吸內科