中間偃麥草TiAP1基因的克隆及生物信息學分析

田秋菊，宋靜，楊艷琳，許田，王洪剛，封德順

(山東農業大學農學院/作物生物學國家重點實驗室，山東 泰安 271018)

中間偃麥草TiAP1基因的克隆及生物信息學分析

田秋菊，宋靜，楊艷琳，許田，王洪剛，封德順

(山東農業大學農學院/作物生物學國家重點實驗室，山東 泰安 271018)

本研究從煙農15和中間偃麥草雜交所得的小偃麥異附加系SN6306中克隆得到TiAP1基因的全長序列，該序列全長1 272 bp，預測編碼423個氨基酸。通過BlastP分析，發現其屬于天冬氨酸蛋白酶家族。生物信息學分析發現，TiAP1蛋白含有信號肽且位于第16和17個氨基酸之間，同時含有兩個木聚糖酶抑制劑結構域，分別位于該蛋白的N端和C端。此外，通過TMHMM預測，發現該蛋白無跨膜螺旋結構，因此是胞外蛋白。為了檢測基因的親緣關系，構建系統進化樹，發現TiAP1基因與烏拉爾圖小麥以及粗山羊草相應基因有較近的親緣關系。上述結果為研究TiAP1基因的功能奠定了基礎。

小偃麥異附加系；TiAP1；基因克隆；生物信息學分析；白粉病

小麥是目前全球種植最廣的糧食作物之一。民以食為天，糧食問題一直關乎著國計民生，而小麥的產量與安全也關乎著國家的糧食安全。與水稻等農作物相比，小麥中含有更加豐富的營養物質。小麥與其他農作物相比有較長的生長期，抗災能力強，經濟效益相對較高，對解決吃糧問題有很重要的現實意義[1]。但是，在生產過程中，有很多生物和非生物脅迫因素影響小麥的產量和品質，比如：葉枯病、根腐病、黃葉病等。

小麥白粉病是常見小麥病害之一[2]，其病原菌是一種特殊的病原真菌，屬于禾本科布氏白粉菌(Blumeriagraminisf. sp.tritici)。它是活體營養專性寄生真菌，屬于子囊菌亞門真菌的一種[3]。近幾年來，白粉病蔓延迅速，至今為止，在全國所有麥區幾乎都有爆發，減產可達 1/10至1/5，發病最嚴重時減產可達2/5至3/5[4]，嚴重影響小麥豐產。

天冬氨酸蛋白酶(aspartic proticinase，APs)是四大類蛋白酶之一，該酶活性較強，即使在酸性環境下依然可以保持活性[5]，其在真核生物以及微生物中分布廣泛，主要參與機體的新陳代謝及生物調控[6]。多種生物體內都存在APs，例如：病毒、真菌、哺乳動物及植物[7]。它在不同的植物器官中表達，比如：種子、莖、葉片、花、根。作為一類蛋白水解酶，天冬氨酸蛋白酶的生物學功能具有多樣性，其在不同的植物發育過程和部位行使的功能各有不同[8]。Kadek等[9]研究指出肉食性的豬籠草可以分泌一種液體以此來降解捕獲的昆蟲，為自身提供氮源，通過研究發現該液體中含有天冬氨酸蛋白酶，這種天冬氨酸蛋白酶最低可以在pH 2.5左右維持活性，且對于高pH值也顯示了不同尋常的活性。該天冬氨酸蛋白酶序列與其他植物、動物APs有很大不同，它含有更多的半胱氨酸殘基，這也可能是豬籠草能抗高溫和耐酸的原因。Chen等[10]在水稻中發現了96個OsAP基因，其中66個在葉中表達，種子中的AP基因受激素和黑暗/光照的誘導有不同程度的上調表達。

近幾年來，植物體內天冬氨酸蛋白酶基因的研究越來越引起人們的關注。本實驗室在前期的研究中利用RNA-seq技術發現了一個新的天冬氨酸蛋白酶基因TiAP1,同時通過VIGS技術研究發現該基因可能與白粉病有關。本研究則在此基礎上從小偃麥異附加系中克隆TiAP1基因全長，并對其進行生物信息學分析，以期為今后TiAP1基因的功能研究及在育種上的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為本實驗室利用小麥近緣植物中間偃麥草(Thinopyrumintermedium，2n=42)與普通小麥煙農15(TriticumaestivumL.，2n=42)雜交得到的小偃麥異附加系SN6306、小麥煙農15以及中間偃麥草。

1.2材料處理

SN6306在蛭石和基質比列1∶1的條件下進行培養至三葉期，用鑷子涂抹接種白粉病菌生理小種E09，在處理0、12、24、48、72 h和96 h時取葉片，將取得的葉片放入液氮中速凍后，迅速放于-80℃冰箱中冷凍低溫保存，用于RNA的提取。

1.3 RNA的提取與反轉錄

所用材料為經白粉病處理12、24、48、72 h和96 h的SN6306葉片各個時間點的混合樣，RNA提取步驟參照全式金的EasyPureTMPlant RNA Kit提取試劑盒說明書進行。RNA提取之后先用核酸測定儀 NanoPhotometer P360(Implent，德國)進行濃度測定，再用2%瓊脂糖凝膠電泳進行RNA濃度和質量測定。

以提取的葉片總RNA為模板，利用全式金的TransScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TransGen，China)反轉錄試劑盒進行反轉錄。具體過程如下：在RT管中加入總RNA約3 μg，Oligo(dT)2 μL，加水至終體積為9 μL，冰上操作，輕輕混勻；然后將管置于80℃ 3 min，冰上冷卻2 min；接著向管中加入2×TS Reaction Mix 10 μL，TransScript?RT/RI Enzyme Mix 1 μL，使最終的反應體系為20 μL；接著反應體系按如下程序進行：42℃ 90 min，94℃加熱2 min，冰上放置2 min，輕輕混勻，然后向體系中加入80 μL DNase-free水對第一鏈cDNA 進行稀釋，并放于-20℃冰箱待用。

1.4TiAP1基因克隆

根據先前的RNA-seq結果中得到的TiAP1基因序列，設計特異引物對APF: 5′-AGGCAGACCTCACCCAAAC-3′、APR: 5′-ACAGAGAGAATACTACGAGACACGA-3′，以得到的cDNA為模板進行PCR反應。PCR反應體系(10 μL)為：cDNA 4 μL(約50 ng)，10 μmol/L APF/R引物各0.5 μL，2×PCR Mix 5 μL。反應程序如下：首先94℃預變性5 min，然后進入Touch Down-PCR循環：94℃變性30 s，退火(65～55℃)1 min，后72℃延伸2 min，退火溫度每個循環降低1℃，10個循環后降到55℃，再在55℃下進行25個循環，最后72℃延伸10 min，于10℃保存。PCR反應產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，利用EtBr進行染色，凝膠成像儀成像。用TaKaRa膠回收試劑盒切取目的條帶進行膠回收，回收基因與克隆載體pMD18-T連接，將連接產物交由上海博尚生物技術有限公司進行測序。

1.5生物信息學分析

對TiAP1基因序列和蛋白序列進行生物信息學分析，具體為：TiAP1基因序列的開放閱讀框(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html, ORFfinder)、TiAP1蛋白序列的信號肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/, SignalP)、蛋白親疏水性(ProtScale, ExPASy)、蛋白結構(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, BLAST)等；蛋白質的多序列聯配使用軟件DNAMAN；系統進化樹分析使用軟件MEGA5。為了得到更多的TiAP1蛋白特征，進行跨膜螺旋預測(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[13]、蛋白質三級結構模型預測(http://www.sbg. bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index, Phyre2)[14，15]、蛋白質的Z值計算和蛋白質殘基能量的計算(https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php)[16]以及等電點、分子量等預測。

1.6TiAP1基因組序列的擴增比對

YN15、SN6306、中間偃麥草基因組DNA按照CTAB法提取，然后利用設計的APF/R引物以基因組DNA為模板擴增TiAP1的基因組序列。擴增體系：2×PCR Mix 5 μL，10 μmol/L APF/R各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補至10 μL。反應程序：首先94℃預變性5 min，然后進入Touch Down-PCR循環：94℃變性30 s，退火(72～60℃)1 min，后72℃延伸2 min，退火溫度每個循環降低1℃，12個循環后降到60℃，再在60℃下進行25個循環，最后72℃延伸10 min，于10℃保存。PCR反應產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，利用EtBr進行染色，凝膠成像儀成像。用TaKaRa膠回收試劑盒切取目的條帶進行膠回收，回收基因與克隆載體pMD18-T連接，將連接產物交由上海博尚生物技術有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1TiAP1基因的克隆

利用設計的APF/R引物對TiAP1基因進行擴增，得到的基因全長為1 272 bp(圖1)，編碼423個氨基酸，通過BlastP分析，發現該基因屬于天冬氨酸蛋白酶家族(圖2、圖3)。

M：DL2000 Marker；1：TiAP1擴增條帶

圖1TiAP1基因擴增結果

2.2TiAP1基因的多序列比對和聚類分析

利用TiAP1基因編碼的氨基酸序列在NCBI中查找，在11個其它物種中找到了APs蛋白，對其進行多序列比對分析，結果表明TiAP1的氨基酸序列與這11個物種中的APs具有很高的相似性(圖4)。對這共計12個APs蛋白進行進化樹分析，發現TiAP1編碼的氨基酸序列與烏拉爾圖小麥以及粗山羊草中的APs序列相似，表現為親緣關系(圖5)。

2.3TiAP1基因組序列的擴增比對

利用設計的APF/R引物，以提取的YN15、SN6306、中間偃麥草DNA為模板進行PCR擴增。結果(圖6)顯示，在SN6306和中間偃麥草中擴出了大小一致的目的條帶，而YN15中卻未擴增出任何條帶。測序分析發現，從SN6306和中間偃麥草中擴增到的DNA序列相似性將近99%，而該基因序列與小麥已測序數據庫(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Projects)中的AP基因相似性較低(圖7、圖8)。以上結果證明了TiAP1基因是來自于中間偃麥草的一個新基因。

圖2TiAP1基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列

圖3 TiAP1蛋白的BlastP分析

TiAP1(Elytrigiaintermedia(Host) Nevski中間偃麥草)、TuAP(EMS56884.1,Triticumurartu烏拉爾圖小麥)、AtAP(EMT20017.1,Aegilopstauschii粗山羊草)、SiAP(XP_004953106.1,Setariaitalica狗尾草)、BdAP(XP_003578403.1,Brachypodiumdistachyon短柄草)、ZmAP(XP_008674331.1,Zeamays玉米)、NaAP(BAF98915.1,Nepenthesalata豬籠草)、VvAP(XP_002264056.1,Vitisvinifera葡萄)、SlAP(XP_004239638.1,Solanumlycopersicum番茄)、MaAP(XP_009410092.1,Musaacuminata野芭蕉)、PdAP(XP_008777368.1,Phoenixdactylifera海棗)、EgAP(XP_010907568.1,Elaeisguineensis油棕)。下圖同。

圖4 TiAP1與其他物種APs蛋白序列比對分析

2.4 TiAP1蛋白的生物信息學分析

分析發現TiAP1蛋白含有信號肽且位于第16和17個氨基酸殘基之間(圖9)，但是沒有跨膜螺旋，所以不是分泌蛋白(圖10)。該蛋白含有兩個木聚糖酶抑制劑結構域，分別位于該蛋白的N和C末端(圖11)。

圖5 TiAP1與其他物種APs蛋白序列的聚類分析結果

M：DL2000 Marker；1：YN15；2：SN6306；3：中間偃麥草

圖6 APF/R引物對YN15、SN6306、中間偃麥草DNA的擴增結果

圖7 SN6306、中間偃麥草TiAP1基因擴增序列比對

TaAP-1～ TaAP-3為小麥中的3個AP基因。

圖9 TiAP1蛋白信號肽結構的預測

圖10 TiAP1蛋白跨膜螺旋的預測

通過ProtParam對蛋白的理化特性進行了分析，比如：分子量等電點(pI)消光系數以及親水系數等(表1)。通過SOPMA預測發現，在TiAP蛋白二級結構中延伸鏈和無規則卷曲所占比例較高(表1)。

圖11 TiAP1的蛋白結構域分析

圖12 TiAP1蛋白質三級結構預測

利用Phyre2對TiAP蛋白進行三級結構預測以及準確性分析(圖12)。為了識別三級結構中的錯誤，用ProSA對三級結構進行檢測。Z值是蛋白鏈通過X射線晶體照相或者核磁共振(NMR)計算出來的。Z值代表了整個模型的質量，Z>0，表明三級結構錯誤較多，而且不穩定，Z值為0或負數表明三級結構模型比較穩定。通過計算該蛋白三級結構模型的Z值為-8.52(圖13)，說明該三級結構模型比較理想。從圖14可以看出氨基酸殘基大部分都小于零，說明目的蛋白是可以構建三級結構模型的。

圖13 蛋白質Z值的計算

圖14 TiAP1蛋白質中氨基酸殘基能量圖

表1 蛋白質的初級結構、二級結構、翻譯后修飾、跨膜結構預測

3 討論與結論

本研究利用RNA-seq技術從煙農15和中間偃麥草雜交所得的小偃麥異附加系SN6306中克隆得到一個新的天冬氨酸蛋白酶基因TiAP1。該基因屬于天冬氨酸蛋白酶家族，全長1 272 bp，編碼423個氨基酸，含有信號肽，與烏拉爾圖小麥以及粗山羊草具有較近的親緣關系。利用HMHMM對跨膜螺旋進行預測，發現沒有跨膜螺旋結構，因此屬于胞外蛋白。對TiAP1蛋白的理化特性進行預測，目的蛋白等電點約為5.9，信號肽的切割位點位于第16和17個氨基酸之間。此外，通過對該蛋白的二級結構和三級結構進行預測，發現二級結構中延伸鏈和無規則卷曲所占的比例較高，三級結構構建的模型比較穩定。蛋白的空間結構很大程度上決定了蛋白質的生物學功能，因此了解蛋白質的結構對研究蛋白質的功能有重要意義。

有研究發現天冬氨酸蛋白酶基因在生物體內有重要作用。Contour-Ansel等[11]從普通大豆中克隆出一個天冬氨酸蛋白酶基因PvAP1，屬于典型天冬氨酸蛋白酶；同時發現PvAP1受水分脅迫的影響，影響其轉錄水平和翻譯后水平，由此推測天冬氨酸蛋白酶可能參與豆科植物的抗旱過程。Prasad等[12]在水稻中發現了一種編碼典型天冬氨酸蛋白酶的基因OsCDR1，通過原核表達系統得到OsCDR1融合蛋白，利用融合蛋白處理擬南芥葉片，發現PR2轉錄本在處理和未處理的葉片中均有表達，而CDR1編碼的沒有活性的融合蛋白不能誘導PR2轉錄本在局部和系統中的表達，這表明OsCDR1有引起植物體系統防御反應的功能。

本研究較系統地研究了TiAP1基因的序列特征、系統進化等方面的內容，這在一定程度上為進一步研究TiAP1基因的作用機制奠定了基礎。

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CloningandBioinformaticsofTiAP1GenefromThinopyrumintermedium

Tian Qiuju, Song Jing, Yang Yanlin, Xu Tian, Wang Honggang, Feng Deshun

(CollegeofAgronomy,ShandongAgriculturalUniversity/StateKeyLaboratoryofCropBiology,Taian271018,China)

The wheat-Thinopyrumalien addition line SN6306 was originated from the intergeneric hybridization between YN15 andThinopyrumintermedium(Host) Nevski. Through PCR amplification, the full length cDNA ofTiAP1 gene was obtained. Its open reading frame (ORF) was 1 272 bp and encoded a peptide of 423 amino acids. The BlastP analysis results showed that it belonged to the aspartic protease family. The bioinformatics analysis results showed that TiAP1 protein contained a signal peptide, whose cleavage site was located between the 16th and 17th amino acid, and two xylanase inhibitor domain structures, which located in the N and C end respectively. The TMHMM predicting results showed that the protein had no transmembrane helix structure. So the protein was not secreted protein. The phylogenetic tree showed thatTiAP1 gene was similar to the corresponding gene inTriticumurartuThum.ex Gandil andAegilopstauschii. These results would provide the reference for the research ofTiAP1 gene functions.

Wheat-Thinopyrumalien addition line;TiAP1; Gene clone; Bioinformatics analysis; Powdery mildew

S512.901

A

1001-4942(2017)10-0001-09

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.001

2017-05-17

國家重點研發計劃項目(2016YFD0102000)；國家自然科學基金面上項目(31171552)

田秋菊(1990—)，女，在讀碩士研究生，研究方向為生物技術在小麥遺傳改良中的應用。E-mail: qiujutian@yeah.net

封德順(1970—)，男，教授，主要從事小麥分子生物技術育種研究。E-mail: dsfeng@sdau.edu.cn