高效液相色譜法測定白酒中紐甜含量影響因素的探究

劉石雪，唐麗云

（沂蒙老區酒業有限公司，山東臨沂276700）

高效液相色譜法測定白酒中紐甜含量影響因素的探究

劉石雪，唐麗云

（沂蒙老區酒業有限公司，山東臨沂276700）

本實驗對高效液相色譜法測定白酒中紐甜含量的各個影響因素進行了探究，優化了實驗條件。采用Agilent C18色譜柱(5 μm,150 mm×4.6 mm),流動相為乙腈-離子對試劑緩沖液，紫外檢測器波長210 nm，柱溫30℃，流速1 mL/min。結果表明，紐甜濃度在0.16～25 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，檢出限0.06 μg/mL，加標回收率在93.75%～98.13%之間。該方法分離度較好，操作穩定，數據準確,適用于白酒中紐甜的檢測。

高效液相色譜法； 紐甜； 白酒

紐甜是一種新一代的人工合成的二肽類強力甜味劑，其化學名稱為N-［N-(3,3-二甲基丁基)-L-α-天門冬氨酰］-L-苯丙氨酸-1-甲酯，分子式為C20H30N2O5[1-2]。由于具有高甜度、無齲齒性、高安全性、高穩定性、協同增效性、適用范圍廣、添加方式多樣等優點，可以替代蔗糖、阿斯巴甜等甜味劑，并廣泛添加到食品中[3]。例如可以添加到乳制品、谷物食品、糖果、巧克力、鈣片、飲料、烘焙食品、復合調味料等食品中。其熱值小、不參與人體代謝過程，適當的添加量可以起到改善口感的作用，不會引起人的肥胖、高血壓、糖尿病等疾病[4]，因此是一種無營養安全類食品添加劑。但依據國家強制性標準GB 2760—2014食品添加劑使用標準，紐甜不在白酒(食品分類號15.01.01)允許使用的范圍之內，即發酵酒種中不得添加甜味劑[5-6]。

最新食品安全國家標準GB 5009.247—2016規定了食品中紐甜測定的高效液相色譜法[7]，其前處理過程包括混合提取液提取、固相萃取柱凈化、氮吹濃縮等步驟，處理過程較為復雜，影響因素較多。因此本實驗在國標法基礎上對白酒中紐甜提取的過程、液相色譜條件等關鍵控制點進行實驗探究，為以后測定白酒中紐甜的含量提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：市售白酒樣。

試劑：乙腈（色譜純，德國默克股份兩合公司）；甲醇（色譜純，德國默克股份兩合公司）；甲酸（色譜純，科密歐）；三乙胺（色譜純，科密歐）；磷酸（分析純，科密歐）；辛烷磺酸鈉（色譜純，科密歐）；紐甜標準溶液（純度≥99.0%）。

儀器設備：高效液相色譜儀（Agilent1260II型，配有紫外檢測器）；超聲波清洗儀（朗博儀器制造有限公司）；分析天平（梅特勒·托利多AL104型）；漩渦振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；DN系列氮吹儀（天津市東康科技有限公司）；HSE系列固相萃取裝置（天津市恒奧科技發展有限公司）。

1.2 儀器條件

色譜柱：C18色譜柱，5 μm，150 mm×4.6 mm（內徑）；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm，進樣量50 μL；流動相A乙腈、B離子對試劑緩沖液。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3 標準溶液制備

標準儲備液：準確稱取0.1000 g紐甜標準品，加混合提取液溶解定容至100 mL，此溶液紐甜含量為1.00 mg/mL。

標準工作液：稀釋標準儲備液至濃度分別為0.16 μg/mL、0.80 μg/mL、1.60 μg/mL、4.00 μg/mL、8.00 μg/mL、25.00 μg/mL等系列標準工作液。

1.4 樣品前處理

準確量取10.0 mL試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入30 mL混合提取液，振蕩混勻。超聲15 min后，用混合提取液定容至刻度。吸取10.0 mL溶液以2 mL/min的流速通過固相萃取柱；待濾液完全流出后，用5 mL混合提取液以2 mL/min的流速淋洗萃取柱，棄去全部流出液；最后用5 mL甲醇以1 mL/min的流速洗脫。洗脫液在40℃水浴中用氮吹儀濃縮，混合提取液定容至2.0 mL，經0.45 μm濾膜過濾后作為待測液供色譜分析[7]。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的影響

前處理方法的影響對同一個酒樣進行了3組實驗：第1組，根據1.4所述處理過程進行酒樣前處理，后用氮吹儀濃縮近干，混合提取液定容至2.0 mL。第2組，根據1.4所述處理過程進行酒樣前處理，后用氮吹儀濃縮至1.0 mL，混合提取液定容至2.0 mL。第3組，樣品不經過前處理，直接加熱除去乙醇，用水定容至2.0 mL。結果顯示：第1組、第2組，紐甜分離度好，雜峰較少，回收率較高，并且氮吹濃縮的體積對結果定量影響不大，紐甜含量均為0.39 μg/mL。第3組，紐甜分離度不好，雜峰較多，回收率低，紐甜含量為0.08 μg/mL。結果見圖1。

2.2 檢測波長的選擇

紐甜在206 nm波長到218 nm波長間都有吸收峰[9-10]，但是考慮到乙腈在210 nm以下也有較強的吸收峰。因此選擇波長218 nm、212 nm、210 nm進行實驗，結果見圖2。從圖2可看出，波長210 nm時，樣品中紐甜吸收峰最高，最為靈敏。因此選擇210 nm為實驗波長。

2.3 色譜柱溫度的影響

選取不同柱溫25℃、28℃、30℃、32℃、35℃進行實驗，結果表明，色譜柱溫度對紐甜的保留時間和色譜峰形影響不大?？紤]到溫度過低或者過高不易控制，并且受環境影響較大，確定本實驗的檢測柱溫為30℃。

2.4 流動相變化的影響

對乙腈和離子對試劑緩沖液梯度洗脫程序進行優化，結果表明表1梯度洗脫程序具有較好分離效果，能滿足檢測要求。

圖1 前處理方法對酒樣中紐甜含量的影響

圖2 檢測波長對酒樣中紐甜含量的影響

2.5 流速變化的影響

流動相流速的高低影響色譜柱的柱效、系統的壓力、各個組分分離效果和保留時間。選擇實驗的流速為0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min，結果表明，隨著流速增大，各組分出峰時間提前，在0.8 mL/min、1.0 mL/min時，出峰時間合適，分離度較好。因此確定本實驗流速為1.0 mL/min。

2.6 在優化條件下進行紐甜測定實驗

2.6.1 標準曲線和線性范圍

分別取0.16 μg/mL、0.80 μg/mL、1.60 μg/mL、4.00 μg/mL、8.00 μg/mL、25.00 μg/mL 的系列紐甜標準溶液，以峰面積為縱坐標，以標液濃度為橫坐標作線性回歸，得到如下回歸方程：y=25.879x+0.714，r=0.9999。可見，紐甜在濃度0.16～25.0 μg/mL濃度范圍內，線性關系良好（圖3）。

圖3 紐甜的標準曲線

2.6.2 檢出限的確定

根據GB/T 5009.1—2003《食品衛生檢驗方法理化部分總則》[8]中對檢出限的規定，把3倍空白值的標準偏差相對應的質量或濃度稱為檢出限。色譜法（GC,HPLC）的檢出限為色譜儀最低響應值（儀器噪音水平的3倍）/標準曲線回歸方程斜率。平均測定20次，得出本實驗紐甜檢出限為0.06 μg/mL。

2.6.3 樣品加標回收率和精密度實驗

選取不含紐甜的空白酒樣，根據實驗要求分別加入一定量紐甜標液，使其濃度分別為0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL、3.2 μg/mL、6.4 μg/mL，每個濃度做3次平行試樣。根據上述方法進行前處理，測定其紐甜含量。按外標法進行定量，并計算其加標回收率，具體情況見表2。由表2可以看出，此方法的加標回收率在93.75%～98.13%之間，相對標準偏差1.82%，測定結果準確。

2.6.4 樣品檢測結果

表2 加標回收實驗

從市場上抽取4個酒樣，按上述優化后的處理方法進行紐甜檢測，每個樣品做3個平行實驗。結果表明，1#、2#樣品未檢出，3#樣品為0.33 mg/L，RSD為1.0%。檢測結果見圖4。

圖4 標樣及3#樣品檢測結果

3 結論

根據本實驗室的儀器設備和色譜柱性能，對GB 5009.247—2016規定的食品中紐甜測定的高效液相色譜法[7]進行優化改進。確定了新的乙腈、離子對試劑緩沖液的洗脫梯度、210 nm的檢測波長，獲得了更加準確的分離度和響應值。并對前處理過程的關鍵控制點進行把控實驗，確定對實驗數據準確性的影響，為以后其他企業和檢測機構紐甜實驗檢測數據的準確性提供參考依據。

[1]魯琳,杭義萍,高燕紅.高效液相色譜法快速檢測乳飲料中常用甜味劑[J].食品科學,2009,30(10)：166-168.

[2]鄭鵬然,周樹南.食品衛生全書[M].北京：紅旗出版社,1996：642-643.

[3]魏志勇,劉穎秋,佘志剛.紐甜的應用及研究進展[J].食品工業科技,2008(12)：252-254.

[4]劉家常,張露新,李欣.食品甜味劑及其檢測技術[J].口岸衛生控制,2011,16(4)：16-19.

[5]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準食品添加劑使用標準：GB 2760—2014[S].北京：中國標準出版社,2015.

[6]張瑩,遠輝,丁春瑞.超高效液相色譜法測定白酒中紐甜不確定度評定[J].釀酒科技,2016(12)：99-103.

[7]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準食品中紐甜的測定：GB 5009.247—2016[S].北京：中國標準出版社,2017.

[8]中華人民共和國國家衛生部.食品衛生檢驗方法理化部分總則：GB/T 5009.1—2003[S].北京：中國標準出版社,2004.

[9]張暉,薛洪寶,楊俊松,等.HPLC測定食品中甜味劑的含量[J].光譜實驗室,2013,30(4)：1813-1817.

[10]曹峰,許霞.高效液相色譜法測定萊蕪姜酒中的紐甜含量[J].食品科學技術學報,2014,32(6)：77-80.

茅臺集團“匠中匠”酒博會簽約3億元

本刊訊：據《貴州日報》報道，2017年9月8日,貴州茅臺集團白金酒公司高端醬酒“匠中匠”品牌發布會在貴陽中天凱悅酒店舉行。中國酒類流通協會副秘書長、中國酒業論壇創始人趙禹,酒仙網董事長郝鴻峰,貴州省白酒產業顧問權圖,貴州省煙草學會秘書長毛學軍等行業嘉賓前來祝賀。

發布會上,匠中匠CEO董兵勾勒了“匠中匠”的未來規劃,提出要在3年內,將匠中匠打造成10億元規模的品牌,成為貴州茅臺集團白金酒公司旗下又一款超級大單品,成為茅臺品牌家族的又一顆明星!近200名來自貴州本地和華東、華中、華北的經銷商參加了發布會,并與“匠中匠”簽署了總額3億元、首款3千萬元的經銷合同。（江源薦，黃筱鸝編輯）

來源：貴州日報 2017-09-11

Factors Influencing the Determination of
Neotame Content in Baijiu by HPLC

LIU Shixue and TANG Liyun

(Yimeng Distillery Co.Ltd.,Linyi,Shandong 276700,China)

In this study,the factors influencing the determination of neotame content in Baijiu by HPLC were explored.The column of Agilent C18(5 μm,150 mm×4.6 mm)was adopted,a mobile phase of acetonitrile-ion pair reagent buffer at a flow rate of 1.0 mL/min was used,and column temperature was at 30℃with UV detector wavelength at 210 nm.The results suggested that neotame content in the range of 0.16 μg/mL to 25 μg/mL presented a good linear relation with peak area,the detection limit was 0.06 μg/mL,and the spiked recovery rate was between 93.75%to 98.13%.The method had the advantages including good separation,stable operation,and accurate data,and it was suitable for the determination of neotame content in Baijiu.

HPLC;neotame;Baijiu

TS262.3；TS261.7

A

1001-9286（2017）10-0084-04

10.13746/j.njkj.2017241

2017-09-11

劉石雪，女，碩士研究生，E-mail：zhaoweishan1986@163.com。

唐麗云，女，國家級白酒評委，主要研究方向：白酒產品研發，E-mail：lytliyun@163.com。

優先數字出版時間：2017-09-14；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170914.1422.003.html。