CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的水稻OsPht 基因突變體材料可用于養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)評(píng)價(jià)

韓 嬌，王 莉，何 蕊，李 偉，王 冰，黃升財(cái)，孫永偉，程憲國(guó)*

（1 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041000；2 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽(yáng) 110866；3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；4 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的水稻OsPht 基因突變體材料可用于養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)評(píng)價(jià)

韓 嬌1，王 莉1，何 蕊2，李 偉3，王 冰3，黃升財(cái)3，孫永偉4，程憲國(guó)3*

（1 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041000；2 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽(yáng) 110866；3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；4 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

【目的】CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌為免受外來(lái)DNA片段侵襲形成的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas9已經(jīng)被作為一種基因編輯的工具廣泛應(yīng)用到很多動(dòng)物和植物的基因編輯。磷元素是植物生長(zhǎng)過(guò)程中必需的營(yíng)養(yǎng)元素，植物對(duì)磷的吸收主要由跨膜磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)Oryza JaponicaKitaake水稻中冰葉日中花磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白McPht基因的同源體OsPht磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行編輯，構(gòu)建了McPht轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)胨綩sPht缺失的突變體，初步驗(yàn)證了該突變體材料的功能。【方法】通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯手段，將水稻中與McPht蛋白同源性最高的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行編輯。首先將待編輯的基因片段連接到U3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pCXUN表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，然后通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到水稻幼胚，將獲得的轉(zhuǎn)化后再生T0代株系移栽到田間獲得T1代種子，并將T1代株系進(jìn)行盆栽培養(yǎng)，提取株系葉片基因組DNA用于PCR檢測(cè)，所有株系PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序，依據(jù)序列變化判定目標(biāo)基因的編輯位點(diǎn),并對(duì)突變體進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定?！窘Y(jié)果】1) 基因編輯后的類型可分為兩類，一類為目標(biāo)編輯片段20個(gè)堿基中后6個(gè)堿基缺失，另一類為目標(biāo)編輯片段20個(gè)堿基中后8個(gè)堿基缺失或突變。2) 編輯位點(diǎn)缺失6個(gè)堿基的株系占總突變株系的28.6%，編輯位點(diǎn)缺失8個(gè)堿基的株系占總突變株系的42.9%，GT堿基突變株系占總突變株系的28.6%。3) 水稻突變體的株高、鮮重、根系活力均小于野生型；根系掃描結(jié)果顯示水稻突變體的根長(zhǎng)、投影面積、表面積和側(cè)根數(shù)均大于野生型；Cas-2的葉綠素和可溶性糖含量顯著高于野生型，Cas-7的葉綠素和可溶性糖含量小于野生型，但差異不顯著?！窘Y(jié)論】CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)成功將水稻中McPht的同源體OsPht基因進(jìn)行了編輯，所獲得的水稻磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsPht基因堿基缺失或突變不僅為所編輯基因的功能研究提供有效的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為冰葉日中花McPht磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)隣sPht基因功能缺失的水稻株系、驗(yàn)證其生理生化功能提供寶貴的評(píng)價(jià)材料支持。本研究表明基于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)在功能性評(píng)價(jià)植物養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因方面是一條有效的途徑。

CRISPR/Cas9；基因編輯；OsPht基因；pCXUN；水稻突變體

CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在防御外來(lái)核酸入侵時(shí)形成的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，因其具有特異性、簡(jiǎn)單性和多功能性，故被視為一種新型的位點(diǎn)特異性基因組編輯工具，被用于生物和作物改良的研究[1–3]。此前我們所采用的基因組編輯方法主要有兩種，鋅指核酸酶 (ZFN) 和類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶 (TALEN)，它們主要依賴蛋白質(zhì)和DNA相互作用來(lái)確定特異性[4]。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，Cas9核酸內(nèi)切酶由單個(gè)RNA (sgRNA) 引導(dǎo)，其引導(dǎo)原理包括兩部分：其中一部分是通過(guò)DNA和RNA之間的WatsoneCrick堿基配對(duì)識(shí)別靶位點(diǎn)；另一部分是形成一種修復(fù)Cas9核酸內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)。對(duì)于靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，僅要求必須具有PAM (NGG) 序列，這意味著基因組中幾乎所有的基因都可以被CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行靶向編輯[5]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地完全編輯目的基因，其獲得的突變是可遺傳的，再經(jīng)過(guò)驗(yàn)證篩選出穩(wěn)定的突變體株系[6]。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于植物中靶向基因組編輯，包括小麥[7]、煙草[8–9]、擬南芥[8,10]、玉米[11–12]、大豆[13]等。雖然目前尚未有完全詳細(xì)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制，但其作用機(jī)制的大體過(guò)程已經(jīng)被研究出來(lái)，CRISPR/Cas9的作用機(jī)理可分為三個(gè)階段：第一階段，CRISPR/Cas9可變間隔區(qū)的獲得，指噬菌體的一段DNA序列被整合到宿主基因組的CRISPR位點(diǎn)的5′端；第二階段，CRISPR基因座的表達(dá)，插入的序列被轉(zhuǎn)錄形成crRNA；第三階段，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的激活以及其抵抗外源遺傳物質(zhì)的干擾能力[14–15]。

磷是植物生長(zhǎng)和發(fā)育所需的必需元素，對(duì)植物的生理和生化過(guò)程具有積極的影響[16]。磷是核酸和磷脂的重要組分，其主要在光合作用、能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)等過(guò)程中起重要作用[17]。由于植物中的磷濃度遠(yuǎn)大于土壤中的濃度，因此植物吸收磷是通過(guò)逆濃度梯度能量耗散過(guò)程得以完成[18]。通常磷的缺乏已經(jīng)成為植物生長(zhǎng)的主要限制因素，磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)α姿厝狈τ兄e極的應(yīng)答。磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)有兩種類型，高親和力磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和低親和力磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，兩者都在磷吸收中起重要作用[19]。

實(shí)驗(yàn)室先前將冰葉日中花磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)入水稻中進(jìn)行超表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在低磷脅迫下，其對(duì)水稻的生長(zhǎng)具有重要的作用。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將Oryza sativaL. japonica. cv.Kitaake水稻中冰葉日中花磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因McPht(GenBank：JQ343214.1) 的同源體，Pht3亞家族OsPht(GenBank：AK069397.1) 磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行編輯，獲得OsPht目標(biāo)基因堿基缺失的突變體，并對(duì)突變體材料進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定，明確OsPht磷素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因堿基缺失下的突變體的生理功能變化，為深入探討線粒體磷素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白生理功能提供科學(xué)的材料支持，同時(shí)也為冰葉日中花植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因McPht導(dǎo)入OsPht基因堿基因突變或缺失的模式植物水稻株系，建立磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外源同源基因恢復(fù)磷轉(zhuǎn)運(yùn)功能提供可靠的材料支撐，依此系統(tǒng)深入研究外源同源體如McPht基因的生理生化功能。

1 材料與方法

1.1 敲除靶點(diǎn)引物序列設(shè)計(jì)

根據(jù)編輯靶點(diǎn)引物序列設(shè)計(jì)的三點(diǎn)要求：1) 20 bp靶序列應(yīng)緊接在5′-NGG PAM之前；2) 如果敲除目的是破壞基因功能，靶序列應(yīng)該避免在編碼區(qū)或內(nèi)含子的3′末端；3) 為了減少脫靶效應(yīng)，利用gRNA網(wǎng)站 (http://crispr.dbcls.jp/) 設(shè)計(jì)水稻磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因敲除引物，上游引物的接頭序列為5′-GGCA-3′，下游引物的接頭序列為5′-AAAC-3′。用于基因編輯引導(dǎo)引物：F：5′-GGCACGCAGCCGTGGGTGTA CGTG-3′；R：5′-AAACCACGTACACCCACGGCTGCG-3′。

1.2 載體構(gòu)建

稀釋正向和反向目標(biāo)特異性sgRNA寡核苷酸至10 μmol/L的終濃度。 sgRNA寡核苷酸退火體系共20 μL，包括 2 μL Annealing buffer (10 ×)，F(xiàn) 和 R 各9 μL。退火程序：95℃，5 min；95℃～25℃，1 min下降1℃；最后10℃保存。pCXUN-U3表達(dá)載體酶切體系共 50 μL，包括 5 μLAarI buffer (10 ×)，1 μL Oligonucletide(50 ×)，2 μLAarI，2 μL 載體 pCXUNU3 (由作物科學(xué)研究所夏蘭琴博士課題組友好捐贈(zèng))，最后用滅菌水補(bǔ)充到50 μL。37℃反應(yīng)3～6 h，跑膠，對(duì)酶切后的載體片段進(jìn)行膠回收和純化。將退火后的sgRNA寡核苷酸與用限制性內(nèi)切酶AarI酶切后的載體連接，22℃反應(yīng)3 h。

1.3 大腸桿菌轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒的提取

將5 μL連接后的載體與50 μL Trans1大腸桿菌感受態(tài)于2 mL EP管中輕輕混勻，冰浴30 min，42℃水浴30 s，再冰浴2 min，在超凈臺(tái)內(nèi)向EP管加入500 μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于37℃，200 rpm的搖床上培養(yǎng)1 h。8000 rpm離心1 min，棄上清液，保留100 μL培養(yǎng)液，用槍頭吹打混勻，均勻涂在含卡那抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃黑暗條件下倒置培養(yǎng)基到有菌斑出現(xiàn)。挑取單克隆菌斑于2 mL含卡那抗生素的LB液體培養(yǎng)基的EP管中，于37℃，200 rpm的搖床上培養(yǎng)過(guò)夜。以菌液為模板，用表達(dá)載體通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增含有陰性對(duì)照，從而篩選出陽(yáng)性菌斑。對(duì)于陽(yáng)性菌斑用質(zhì)粒小提試劑盒 (TIANprep Mini Plasmid Kit) 提取質(zhì)粒DNA。

1.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

將1 μg表達(dá)載體質(zhì)粒DNA與200 μL EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)于2 mL EP管中輕輕混勻，先冰浴 30 min，然后液氮冷凍5 min，迅速置于37℃水浴鍋中水浴5 min，最后冰浴2 min。在超凈臺(tái)中向EP管中加入500 μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于28℃，230 rpm搖床上過(guò)夜培養(yǎng)。8000 rpm離心1 min，棄上清液，保留100 μL培養(yǎng)液，用槍頭吹打混勻，均勻涂在含卡那和利福平抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，28℃黑暗條件下倒置培養(yǎng)基直到有單克隆菌斑長(zhǎng)出。挑取單克隆菌斑于2 mL含卡那和利福平抗生素LB液體培養(yǎng)基的EP管中，于28℃，230 rpm的搖床上培養(yǎng)過(guò)夜，以擴(kuò)大培養(yǎng)。以菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選陽(yáng)性菌落，在28℃、轉(zhuǎn)速230 rpm培養(yǎng)24 h，向菌液內(nèi)加入終濃度為50%的甘油，置于–80℃冰箱內(nèi)。

1.5 突變體的篩選與鑒定

取低溫儲(chǔ)存攜帶pCXUN表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體按上述條件進(jìn)行活化培養(yǎng)，待OD值達(dá)到期望值時(shí)，在無(wú)菌條件下利用活化的農(nóng)桿菌液浸染Oryza sativaL. japonica cv. Kitaake水稻幼胚組織，并在含卡那和利福平抗生素MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2個(gè)月左右，將所獲再生幼苗在光照生長(zhǎng)箱進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)一個(gè)星期，然后移栽到草炭土中在溫室培育3個(gè)半月，收獲T0代轉(zhuǎn)基因水稻種子。將所獲的T0代轉(zhuǎn)基因水稻種子在田間土壤進(jìn)行栽培，對(duì)所有株系取相同位置葉片提取基因組DNA(EasyPure? Plant Genomic DNA Kit試劑盒) 。通過(guò)特異性引物：F：5′-ATGGCCGTCGTCTCCGAGAGC-3′和 R：5′-CAGCATAGCCTTCTGCCTTGAC-3′，進(jìn)行PCR檢測(cè)分析，利用凝膠電泳回收純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段，用于測(cè)序。將測(cè)序得到的結(jié)果與原始序列通過(guò)DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)，確定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化材料，篩選出目標(biāo)基因位點(diǎn)突變或缺失的水稻株系Cas2和Cas7用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 試驗(yàn)材料準(zhǔn)備

將野生型和T1代突變體水稻種子Cas2和Cas7在盛水的玻璃培養(yǎng)皿 (直徑9 cm) 中30℃黑暗條件下發(fā)芽3～4天，每天更換玻璃培養(yǎng)皿中的水，待種子發(fā)芽后將其轉(zhuǎn)移到溫室含有支撐網(wǎng) (網(wǎng)孔面積為1 mm2) 的塑料盆中水培1周。選擇長(zhǎng)勢(shì)均一的小苗，移栽到裝有草炭土盆中，在網(wǎng)室自然光照下培養(yǎng)4個(gè)星期，對(duì)突變體和野生型水稻進(jìn)行表型觀測(cè)與取樣用于相關(guān)的生理測(cè)試分析。

1.7 生物量測(cè)定與根系掃描

用自來(lái)水將水稻沖洗干凈，并用吸水紙吸干水分。用直尺測(cè)量野生型與突變體水稻的高度 (3個(gè)生物學(xué)重復(fù))，用天平稱重。用根系掃描儀 (EPSONLA，UK) 對(duì)水稻根部進(jìn)行掃描，用WINRHIZO Pro software of 2004c version (WINRHIZO，Regent，Co. Canada)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 生理指標(biāo)測(cè)定

1.8.1 根系活力測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取0.25 mL 0.4%的TTC溶液加入到10 mL試管中，加入少量次硫酸鈉粉末，混合均勻后會(huì)有紅色的甲腙產(chǎn)生。用乙酸乙酯定容至刻度并搖勻。取上述溶液0.25、0.5、1、1.5和2 mL分別加入10 mL容量瓶中并用乙酸乙酯定容，以空白作為參照，測(cè)定485 nm下的吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取野生型和突變體水稻根尖樣品，剪碎，稱取根尖樣品約0.2 g，三次生物學(xué)重復(fù)，分別放入50 mL管中，加入5 mL 0.4%的TTC溶液和磷酸緩沖液，將根尖浸沒(méi)于上述溶液中，37℃黑暗條件下反應(yīng)2～3 h，加入2 mL的1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，對(duì)照組先加1 mol/L H2SO4，再加根尖。用鑷子把根尖取出，用吸水紙吸干水分，在研缽中與2 mL乙酸乙酯一起進(jìn)行研磨，將紅色研磨液放入10 mL試管中，用乙酸乙酯沖洗研缽，將沖洗液倒入試管中，用乙酸乙酯定容至10 mL，以空白作為參照，測(cè)定485 nm下的吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根系活力計(jì)算公式為：

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出的四氮唑還原量 (mg)；W為樣品質(zhì)量；t為反應(yīng)時(shí)間。

1.8.2 可溶性糖含量測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作按照強(qiáng)曉晶方法[20]：取野生型和突變型水稻新鮮葉片，剪碎混勻，稱取0.2 g新鮮葉片，三次生物學(xué)重復(fù)，分別放入25 mL試管中，加入5～10 mL蒸餾水，封口膜封口，于沸水中提取30 min (提取2次)，提取液過(guò)濾到25 mL容量瓶中，用蒸餾水反復(fù)清洗并定容至刻度。取0.5 mL樣品液于25 mL試管中，首先加入1.5 mL蒸餾水，然后加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯和5 mL濃 H2SO4充分混勻，放入沸水中保溫1 min，自然冷卻至室溫，以空白作為對(duì)照，測(cè)定630 nm下的吸光度。可溶性糖含量按以下公式計(jì)算：

可溶性糖含量（%）=（C×VT×N×100)/(W×VS×106)式中：C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的糖量 (μg)；VT為提取液總體積 (mL)；N為稀釋倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量 (g)；VS為測(cè)定時(shí)取用提取液的體積 (mL)。

1.8.3 葉綠素含量測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作按照強(qiáng)曉晶方法[20]：取野生型和突變體水稻新鮮葉片，剪碎混勻，稱取0.2 g新鮮葉片，三次生物學(xué)重復(fù)，分別放入研缽，加入少量石英砂和80%丙酮，研磨成勻漿，放入25 mL試管，向試管中加入10 mL 80%丙酮，將試管封口置于黑暗處直到葉片退為無(wú)色，期間不間斷搖動(dòng)試管。將濾紙放于漏斗中，先用80%丙酮濕潤(rùn)濾紙，再將提取液慢慢倒入漏斗并過(guò)濾到25 mL容量瓶中，用80%丙酮定容至25 mL，搖勻。以80%丙酮作為對(duì)照，測(cè)定470 nm、646 nm、663 nm下的吸光度。葉綠素含量的計(jì)算公式：

葉綠素含量 (mg/g) = C × V × N/(W × 1000)[21]

式中：C為色素含量 (mg/L)；V為提取液體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；W為樣品鮮重 (g)。段20個(gè)堿基中后6個(gè)堿基缺失；另一類為目標(biāo)編輯片段20個(gè)堿基中后8個(gè)堿基缺失或突變。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建與測(cè)序結(jié)果

圖1所示，冰葉日中花McPht磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與水稻OsPht磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列具有75%的高度同源性。

OsPht基因靶位點(diǎn)敲除序列如圖2所示，靶點(diǎn)序列長(zhǎng)度為20 bp，位于編碼區(qū)+ 95到+ 115處。經(jīng)U3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gRNA引導(dǎo)的pCXUN表達(dá)載體轉(zhuǎn)化體浸染水稻幼胚組織后，獲得具有抗生素抗性的水稻幼苗共計(jì)13株。對(duì)13株水稻苗期葉片DNA提取(提取試劑盒 EasyPure?Plant Genomic DNA Kit) 并進(jìn)行PCR檢測(cè) (所用引物如方法1.5所述)，檢測(cè)結(jié)果表明都有與目標(biāo)基因一致的DNA片段。為了證實(shí)水稻基因的敲除情況，將水稻幼苗DNA的PCR產(chǎn)物純化并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示13株水稻幼苗中7株編輯目標(biāo)靶點(diǎn)展示出基因缺失或突變，這7株突變體堿基的編輯情況可概括為兩類：一類為目標(biāo)編輯片

圖1 氨基酸同源性比較Fig. 1 Comparison of amino acids

圖2 OsPht基因靶位點(diǎn)Fig. 2 Diagram of OsPht gene target site

圖3A為株系2和3的PCR檢測(cè)電泳圖，在株系2和3中，目標(biāo)編輯片段20個(gè)堿基中后6個(gè)堿基被缺失 (圖3B)，圖3C和3D顯示的分別是野生型植株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序峰圖與突變體植株2和3的PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖，與野生型相比，突變體株系后6個(gè)堿基TACGTG缺失。

圖4A為株系7、10、11、12和9的PCR檢測(cè)電泳圖，株系10、11和12為目標(biāo)編輯片段20個(gè)堿基中后8個(gè)堿基被完全敲除，株系7和9為后8個(gè)堿基發(fā)生缺失和突變 (圖4B)，其中堿基突變主要發(fā)生在G與T之間。與野生型相比，株系10、11和12的PCR測(cè)序峰圖顯示后8個(gè)堿基TGTACGTG完全缺失 (圖4C和D)；圖4E所示，突變體7與野生型株系相比，倒數(shù)第7和8位堿基由TG變?yōu)镚T；圖4F所示，突變體9與野生型株系相比，倒數(shù)第7位堿基不變，倒數(shù)第8位堿基由T變?yōu)镚。統(tǒng)計(jì)分析表明水稻株系總突變率為53.8%，后6個(gè)堿基成功敲除的株系占總突變株系的28.6%，后8個(gè)堿基成功敲除的株系占突變株系的42.9%，GT堿基突變株系占28.6%，證明CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)水稻磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的敲除具有較高的編輯效率。通過(guò)DNAMAN對(duì)突變體氨基酸進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，后6個(gè)堿基缺失的突變體2和3其氨基酸序列與野生型株系相比，僅中間缺失2個(gè)氨基酸；而后8個(gè)堿基成功敲除的突變體10、11和12其氨基酸序列中共有14個(gè)終止密碼子，第一個(gè)終止密碼子位于第60個(gè)氨基酸；GT堿基突變體7中第37個(gè)氨基酸由V變?yōu)長(zhǎng);T堿基突變體9，氨基酸序列不變 (圖5)。

圖3 PCR檢測(cè)電泳圖及測(cè)序結(jié)果Fig. 3 PCR product analysis of electrophoresis and sequencing results

2.2 生物量測(cè)定和根系掃描結(jié)果

野生型和T1代突變體水稻表型如圖6所示，水稻生物量和根系掃描如圖7所示。突變體Cas-2和Cas-7與野生型水稻相比，鮮重分別減少0.01 g和0.02 g，經(jīng)方差分析差異顯著 (圖7A)；株高分別為野生型水稻的0.85和0.62倍 (圖7B)，差異極顯著。水稻對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收主要通過(guò)根系進(jìn)行，因此根系結(jié)構(gòu)的變化可以間接反映植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收狀況。突變體的總根長(zhǎng)、總投影面積、總表面積和側(cè)根數(shù)均高于野生型水稻。與野生型水稻相比，突變體Cas-2和Cas-7總根長(zhǎng)分別增加了35.79 cm和20.69 cm，差異極顯著 (圖7C)；總投影面積分別增加2.07 cm2和1.98 cm2(圖7D)，Cas-2與野生型相比差異極顯著；總表面積分別是野生型水稻的1.14和0.95倍 (圖7E)，Cas-2與野生型相比差異極顯著；側(cè)根數(shù)高于野生型水稻 (圖7F)，差異極顯著。

2.3 生理指標(biāo)測(cè)定

植物吸收土壤中的營(yíng)養(yǎng)元素主要通過(guò)根系進(jìn)行，植物生長(zhǎng)情況、體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)狀況及其產(chǎn)量都可以通過(guò)根系生長(zhǎng)情況及活力水平反映出來(lái)。突變體水稻Cas-2和Cas-7的根系活力分別是野生型的0.63和0.42倍 (圖8A)，差異顯著；可溶性糖含量分別是野生型的1.29和0.83倍 (圖8B)，Cas-2與野生相比差異極顯著；葉綠素含量是野生型水稻的1.01和0.95倍 (圖8C)，差異不顯著。

圖4 株系7、10、11、12和9的PCR檢測(cè)電泳圖及測(cè)序結(jié)果Fig. 4 PCR product analysis of electrophoresis and sequencing results for plants of 7, 10, 11, 12 and 9

3 討論與結(jié)論

早在1987年科學(xué)家就首次在E.coli堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)了短的回文重復(fù)序列，直到2002年將其命名為CRISPR/Cas9。最近幾年，CRISPR/Cas9技術(shù)才逐漸趨成熟并被廣泛應(yīng)用[22]。在2013年8月8日，該技術(shù)在植物基因編輯中首次取得了巨大突破，Nature Biotechnology實(shí)驗(yàn)室成功對(duì)重要作物水稻、小麥以及模式植物擬南芥和本生煙的基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯，主要包括多個(gè)基因定點(diǎn)敲除及插入，這說(shuō)明了CRISPR/Cas9技術(shù)在植物基因組中可以完成定點(diǎn)編輯[23–25]。CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)被成功應(yīng)用于許多植物、動(dòng)物和微生物中。在本研究中，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯，將其基因進(jìn)行了定點(diǎn)敲除或突變，通過(guò)PCR及測(cè)序證實(shí)水稻基因OsPht被成功編輯；OsPht目標(biāo)基因靶點(diǎn)編輯引發(fā)的突變的特異性與效率差異表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率可能受多種因素影響，主要包括基因靶位點(diǎn)的特異性、sgRNA序列、用于Cas9和sgRNA表達(dá)的啟動(dòng)子及T-DNA插入位點(diǎn)[26]。有研究表明不同植物物種利用CRISPR/Cas9技術(shù)的敲除效率不相同，在擬南芥中的敲除率最低，在水稻中的編輯效率最高[27–28]。Li等[29]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻基因組進(jìn)行編輯，結(jié)果表明水稻的基因組編輯效率很高，而且突變主要發(fā)生在G至A的改變，但也有G至C或G至T的改變。這與本研究結(jié)果相一致，水稻OsPht基因編輯效率較高，占水稻株系總突變率為53.8%，后6個(gè)堿基成功敲除的株系占總突變株系的28.6%，后8個(gè)堿基成功敲除的株系占突變株系的42.9%，GT堿基突變株系占突變株系的28.6%。高清松對(duì)水稻OsABC1K3突變體研究發(fā)現(xiàn)，OsABC1K3突變體的株高和葉綠素含量低于野生型[30]；辛偉杰對(duì)OsPT2和OsPT6的突變體水稻進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，突變體水稻的生物量低于野生型，根長(zhǎng)、總表面積和總體積等高于野生型[31]，與我們的結(jié)果相一致，突變體水稻Cas-2和Cas-7的鮮重和株高均小于野生型，根長(zhǎng)、表面積、投影面積和側(cè)根數(shù)高于野生型，Cas-7的葉綠素含量小于野生型。有研究表明根是植物吸收營(yíng)養(yǎng)的主要器官，根系的生長(zhǎng)和活力直接影響植物地上部的生長(zhǎng)情況[21]，與我們的結(jié)果相符，野生型水稻地上部生長(zhǎng)優(yōu)于突變體，根系活力顯著高于突變體。盡管我們沒(méi)有測(cè)試植株體內(nèi)磷素吸收量 (由于干重量不足無(wú)法滿足測(cè)試需求)，但突變體株系生物量的顯著減少，無(wú)疑會(huì)影響水稻OsPht基因堿基缺失突變體對(duì)磷素的吸收。Anna等發(fā)現(xiàn)正常處理下，突變體522DK和527DK中葡萄糖及果糖含量高于野生型[32]，我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)Cas-2中可溶性糖含量高于野生型。

圖5 CRISPR/Cas9對(duì)OsPP1基因編輯后蛋白序列比對(duì)結(jié)果Fig. 5 Multiple alignments of OsPP1 protein between wild type and mutants

圖6 野生型和突變體水稻表型Fig. 6 Phenotypes of the wild type and mutant rice

圖7 生物量和根系掃描Fig. 7 Biomass and roots scanning

圖8 水稻生理指標(biāo)Fig. 8 Physiological index of rice

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的問(wèn)世給基因組定向編輯的研究帶來(lái)突破性的技術(shù)創(chuàng)新，特別是對(duì)基因功能的研究有廣闊的應(yīng)用前景，使農(nóng)作物水稻、小麥在性狀改良與分子育種方面朝著對(duì)人類有益的方向發(fā)展[23]。水稻作為模式植物，具有基因組簡(jiǎn)單、結(jié)實(shí)率高和遺傳操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被作為研究的首選植物。本研究對(duì)水稻磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsPht基因的成功編輯獲得的突變體測(cè)試結(jié)果表明，CRISPR/Cas9作為基因編輯的工具可以成功應(yīng)用到植物養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的編輯修飾，以科學(xué)有效地解釋植物養(yǎng)分蛋白基因?qū)︷B(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)的分子調(diào)控機(jī)理。同時(shí)，利用所獲得的養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因堿基缺失或突變的水稻突變體，將外源磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因如冰葉日中花McPht磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)入突變體中，獲得磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白回復(fù)株系材料，以進(jìn)一步科學(xué)驗(yàn)證McPht基因的生理生化功能。本研究表明，基于CRISPR/Cas9所介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)在植物養(yǎng)分分子調(diào)控機(jī)理的研究與應(yīng)用中具有重要的科學(xué)意義。

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Rice mutant establishment of the mutated phosphate transporterOsPhtgene by the CRISPR/Cas9 gene editing system for evaluating nutrient translocation

HAN Jiao1, WANG Li1, HE Rui2, LI Wei3, WANG Bing3, HUANG Sheng-cai3, SUN Yong-wei4, CHENG Xian-guo3*
(1 College of Life Science, Shanxi Normal University, Linfen, Shanxi 041000, China; 2 Shenyang Agricultural University, Shenyang,Liaoning 110866, China; 3 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081, China; 4 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

【Objectives】The CRISPR/Cas9 system，a generated adaptive immune system in bacteria and archaea bacteria by defending against the invasion from exogenous DNA fragments, is widely used nowadays as a gene editing tool in many animal and plant gene modification. Phosphorus is an essential nutrient element for plant growth, its absorption is mainly fulfilled through the transmembrane phosphate transporters in plants. In thisstudy, the CRISPR/Cas9 gene editing technology was applied to modify rice phosphate transporter proteinOsPhtgene sharing the highest homology with the phosphate transporter proteinMcPhtgene inMesembryanthemum crystallinum, which would provide a reliable material for scientifically elucidating the function of McPht transporter protein.【Methods】The rice phosphate transporter protein OsPht sharing high homology with McPht protein was edited by CRISPR/Cas9 gene editing system. Briefly, based on the sgRNA mediation, the fragments generated by PCR using a pair of specific primers were inserted to the expression vector pCXUN with U3 promoter, and the resulting transformants were transformed intoAgrobacteriumEHA105 to infect the rice immature embryos of riceOryzasativa L. japonica. cv. Kitaake byAgrobacteriumtransformation method. The T0 generating plant seedlings with anti-antibiotic were transplanted to the soils in field, and the T1 generation seeds were obtained and used for pot culture experiments，and the genomic DNA of rice seedling leaf was extracted for PCR detection, and all the PCR products were purified and sequenced, and the edited sites in the target gene fragments were determined according to the sequence changes, and the physiological measurements of mutant lines were performed.【Results】1) The mutants with the bases deletion or substitution in theOsPhtgene were divided into two categories, which were represented by separately deleting 6 bases and 8 bases in the target editing fragment with 20 bases. 2) The mutants missing 6 bases accounted for 28.6% of the total mutant lines, and the mutants missing 8 bases accounted for 42.9% of the total mutant lines, and the mutants with mutation of GT bases accounted for 28.6% of the total mutant lines. 3) The plant height, fresh weight and root activity of mutant rice were lower than those of the wild type. The root length, shoot area, surface area and lateral root number were higher than those of the wild type. The contents of chlorophyll and soluble sugar of Cas-2 were higher than those of the wild type, and demonstrated remarkable differences, but the contents of chlorophyll and soluble sugar of Cas-7 were lower than those of the wild type, and no significant difference was observed.【Conclusions】The CRISPR/Cas9 gene editing system has successfully edited the rice homologousOsPhtof theMcPht, and these mutants with bases deletion or substitution in theOsPhtgene not only establish a reliable materials basis for scientifically elucidating the function of the target gene, but also simultaneously provide valuable material supports, which the phosphate transporterMcPhtgene is introduced into the mutants with bases deletion or substitution in theOsPhtgene, for systematically verifying physiological and biochemical functions of exogenous homologous from other plants. This study shows that the CRISPR/Cas9-mediated gene editing system is a scientific and effective pathway for the functional evaluation of nutrient transporter genes in plant.

CRISPR/Cas9; gene editing;OsPhtgene; pCXUN; rice mutants

2017–05–08 接受日期：2017–06–08

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物重大專項(xiàng)“磷養(yǎng)分高效利用小麥新品種培育”（2016ZX08002-005）資助。

韓嬌（1991—），女，山西大同人，碩士研究生，主要從事植物營(yíng)養(yǎng)生理生化與分子生物學(xué)研究。E-mail：hanjiao19910905@126.com。 *通信作者 Tel：010-82105031，E-mail：chengxianguo@caas.cn