缺鋅對玉米根系發育、生長素含量及生長素轉運基因表達的影響

周 斌，張金堯，乙 引，汪 洪*

（1 貴州師范大學生命科學學院，貴州貴陽 550001；2 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所/農業部植物營養與肥料重點實驗室，北京 100081）

缺鋅對玉米根系發育、生長素含量及生長素轉運基因表達的影響

周 斌1,2，張金堯2，乙 引1，汪 洪2*

（1 貴州師范大學生命科學學院，貴州貴陽 550001；2 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所/農業部植物營養與肥料重點實驗室，北京 100081）

【目的】研究缺鋅對玉米根系生長及根系中生長素含量與生長素運輸關鍵基因表達的影響，揭示缺鋅脅迫下玉米根系生長與生長素響應特征。【方法】以鄭單958玉米為材料，進行營養液培養試驗，設置Zn 0缺鋅(0 μmol/L) 和正常供鋅 (1 μmol/L) 兩個處理。植株干樣經硝酸–過氧化氫消煮，利用原子吸收分光光度計測定消煮液鋅濃度。保存于FAA溶液 (70% 乙醇︰38% 甲醛︰乙酸 = 90︰5︰5，體積比) 中的根系樣品，經洗滌掃描獲得數字圖像，利用WinRHIZO軟件分析得到根長、根表面積、根體積等指標；采用氣相色譜-質譜聯用儀檢測根系中生長素吲哚乙酸含量；采用實時熒光定量PCR技術對玉米根系生長素轉運基因ZmAUX1和ZmPIN1c表達進行定量分析。【結果】缺鋅脅迫下，植株地上部鋅含量低于20 μg/g，生物量顯著降低；缺鋅根系表面積與體積變小，總根長、側根總長度與側根平均長度變短，側根密度增大，直徑變細。缺鋅條件下，距根尖2 cm的區域中生長素較正常供鋅處理降低近30%。缺鋅根系中ZmAUX1和ZmPIN1c基因表達明顯受抑。【結論】缺鋅脅迫下玉米根系中生長素轉運關鍵基因表達降低，生長素含量下降，生長素分布改變，影響根系生長發育。

玉米；缺鋅；根系；生長素；生長素轉運基因

鋅是植物必需微量元素，參與植物體內碳水化合物代謝、蛋白質合成、調節生長素代謝[1–2]。缺鋅影響植物根系生長發育[3]。1985年，Cumbus在營養液中培養小麥植株，發現缺鋅植株根冠比增加，側根數量和長度明顯增加[4]。Genc等進行土培試驗發現，缺鋅時大麥根系變長[5]。Widodo等研究表明，缺鋅水稻根系發育受阻，節根數目減少，但節根伸長并未下降[6]，Richard等報道，擬南芥27個品系的主根和側根生長受到供鋅影響效應不同，缺鋅抑制擬南芥側根發育[7]。

植物體內生長素 (吲哚乙酸，即IAA) 合成主要存在兩條途徑，即依賴于色氨酸的合成途徑與不依賴于色氨酸的合成途徑。前一種途徑來源于色氨酸的代謝產物，而后一種途徑來源于色氨酸的前體—吲哚–3–甘油磷酸[8–9]。缺鋅植物體內生長素含量明顯下降[1,10]。1948年Tsui發現IAA的合成前體—色氨酸的合成需要鋅，缺鋅時色氨酸含量降低，從而導致IAA合成減少；缺鋅引起生長素下降的另一個原因可能是，缺鋅植物體內活性氧自由基增多，IAA被氧化降解[1,10]。Widodo等發現，缺鋅脅迫下水稻節根數目減少，但鋅高效水稻品種RIL46能維持較好的根系生長能力，體內編碼生長素反應蛋白OsIAA7(Os02g13520) 和生長素誘導蛋白pCNT115(Os04g26870和Os04g27060) 基因表達水平較高[6]。

生長素影響植物根系生長發育[11–12]。外源生長素IAA和IBA施用增加，水稻種子根長度逐漸變短[13]。以擬南芥為模式植物，大量研究表明生長素是調控側根發生發育的重要激素物質，影響側根發生過程的各個時期[11,14–15]。對生長素刺激缺乏敏感性的突變體如aux1、alf4、axr1、axr4、axr6、pxa1、iaa28等表現為側根數量減少，相反內源生長素水平高的突變體alf1和sur1側根數量則顯著增加。外源施加生長素可促進側根的發育。生長素從地上部向根部的極性運輸影響擬南芥側根的生長發育。外源施用抑制生長素極性運輸的化學物質—萘基鄰氨甲酰苯甲酸 (NPA) 明顯抑制側根的形成。對NPA有抗性的突變體tir1和tir4側根數量明顯減少[14]。生長素信號轉導途徑主要包括生長素受體 (F-box蛋白TIRl/AFB1/2/3)、Aux/IAA蛋白、生長素響應因子ARFs和泛素連接酶復合物SCFTIRl/AFB1/2/3。生長素通過與生長素受體結合，促進SCFTIRl/AFB1/2/3對Aux/IAA泛素化，Aux/IAA蛋白被26S蛋白酶降解，激活生長素響應因子ARFs (auxin response factors)，調節下游側根發育形成的目標基因轉錄，促進側根發生[16–17]。

生長素主要在地上部生長點和根尖合成。根系內生長素極性運輸包括向頂運輸和向基運輸。向頂運輸是指莖部產生生長素從根莖交界處向根尖方向的運輸，向基運輸是指莖端運輸到達根尖的部分生長素及根部自身合成的生長素從根尖頂端向基部根莖交界處的運輸。生長素運輸到達根系伸長區后，重新進入維管系統。在根尖，生長素在中柱中向下運輸，而在皮層組織中逆轉，形成一種被稱為“倒傘”的現象[18–20]。極性運輸主要通過對細胞中極性分布的生長素輸入和輸出轉運蛋白進行調控，轉運蛋白協同作用，形成生長素濃度梯度，從而調節植物細胞的生命活動與植物根系生長發育[19]。目前發現的生長素轉運蛋白主要有五種，分別是負責向細胞內轉運蛋白AUX1 (AUXIN-RESISTANT1)/LAXs(AUX1-LIKEs) 蛋白家族[21]、向細胞外轉運蛋白PINs(PIN-FORMEDs) 蛋白家族和ABCB (ATP-bindingcassette B)/PGP (P-glycoprotein) 蛋白家族[22]、介導細胞內轉運蛋白家族PILS (PIN-LIKES) 及定位于液泡膜介導由細胞質與液泡間生長素轉運蛋白WAT1(WALLS ARE THIN1)[18–19,23]。

玉米是對缺鋅敏感的作物。玉米為須根系植物，根系由種子根、節根、不定根組成的軸根及其上側根組成[24–25]。缺鋅引起植物體內生長素含量下降，但是對缺鋅脅迫下，生長素在根系的分布及相關轉運蛋白編碼基因的表達特征，缺少深入研究。本試驗選擇玉米品種鄭單958為供試作物，進行營養液培養，研究缺鋅脅迫下玉米根系中生長素的分布及編碼轉運蛋白ZmAUX1和ZmPIN1基因的表達，以期揭示缺鋅脅迫玉米根系生長素運輸與含量分布特征及對根系生長的影響。

1 材料與方法

1.1 植株培養

以玉米品種鄭單958為試驗材料，選取飽滿一致種子經10% H2O2浸泡消毒15 min，超純水沖洗3遍，浸泡24 h后，轉移到鋪有濕紗布的培養皿中，上蓋一層濕紗布，25℃黑暗中催芽1 d。選擇發芽一致的種子放入洗凈的石英砂中，在培養箱中25℃下育苗。一周后，選擇長勢一致的幼苗，去掉胚乳，移栽到500 mL玻璃培養管中，每管1株，培養管直徑5 cm，高20 cm，外用黑色布包裹避光，超純水培養1 d，后轉移至營養液中培養。培養在光照培養箱進行，控制條件：光照時間12 h，光照強度18000 Lux，白天溫度25℃、夜間20℃，相對濕度70%。

基礎營養液配方 (mol/L)：Ca(NO3)22.0 × 10–3、K2SO47.5 × 10–4、MgSO46.5 × 10–4、KH2PO42.5 ×10–4、EDTA-Fe(Ⅱ) 1.0 × 10–4、H3BO31.0 × 10–6、CuSO41.0 × 10–7、(NH4)6Mo7O245.0 × 10–9。設置缺鋅(0 μmol/L) 和正常供鋅 (1 μmol/L) 兩個處理，代號分別為–Zn和+Zn。鋅以ZnSO4形式供給，每個處理6次重復。營養液pH用NaOH或HCl調至6.0，每隔兩天更換一次營養液。

1.2 根系形態測定

處理培養20 d后，收獲根系，保存于FAA固定液 (70%酒精∶38%甲醛∶乙酸體積比 = 90∶5∶5)中待測。測定時，在盛有清水的有機玻璃盤中將根系平展，用直尺測量初生根和節根長度，并對初生根和節根進行計數。統計初生根上的側根數量，以伸出根表3 mm (肉眼可見) 為側根標準，單位長度(cm) 初生根上側根總數為側根密度。

利用掃描儀 (EsponV 700) 掃描根系樣品獲取數字化圖像，利用WinRHIZO根系分析系統 (Regent Instruments Inc.，Canada) 對圖像進行分析，獲得總根長、根系直徑、表面積、不同直徑范圍內根系長度。

1.3 鋅含量測定

收獲植株地上部和根系，用超純水洗滌根系多次，105℃下殺青30 min，70℃烘干至恒重，稱量干重。干樣用HNO3–H2O2消煮，原子吸收分光光度計 (ZEEnit 700P，德國耶拿分析儀器股份公司) 測定消煮液中Zn濃度。

1.4 生長素測定

用超純水洗滌根系多次，取種子根距離根尖1和2 cm區段，按照Ljung等[26]所述的方法，80%甲醇提取，純化過柱，三甲基硅烷化重氮甲烷己烷甲酯化，采用氣相色譜–質譜聯用儀 (型號：Agilent，7890A/5975C) 測定。測定條件：毛細柱型號 Agilent 19091S-443 30 m × 250 μm × 0.25 μm；色譜柱升溫起始溫度100℃，以20℃/min速度升至280℃后保持1 min，250℃進樣，不分流模式，進樣體積 1 μL。

1.5 生長素運輸關鍵基因表達檢測

1.5.1 總RNA提取 培養15 d后，取種子根上距離根尖3 cm組織放入研缽中，用液氮研磨至粉末。按天根生化科技 (北京) 有限公司的植物總RNA提取試劑盒 (DP432) 說明書進行RNA提取。用普通瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.5.2 cDNA合成 使用Biotool公司All-in-One cDNA Synthesis SuperMix，產品號B24403。步驟如下：

1) 在離心管中加入 (冰上操作) RNA溶液623 ng(6 μL)、All-in-One cDNA Synthesis SuperMix 4 μL、RNase-free Water ＞ 20 μL；

2) 將EP管內液體混勻并在42℃條件下孵育15 min；

3) 在85℃條件下孵育2 min將All in one逆轉錄酶失活，并在冰上冷卻至室溫。保存于–20℃，作為基因擴增及實時熒光定量PCR (qRT-PCR) 的模板。

1.5.3 引物設計 用軟件Primer 5.0設計目的基因ZmAUX1和ZmPIN1c以及內參基因β-actin引物，由中美泰和公司合成。引物序列如下：

1.5.4 qRT-PCR 采用Biotool公司的2x SYBR Green qPCR Master Mix預混合試劑，按下列組份配置成PCR反應液 (冰上進行，體積量為20 μL)，利用熒光定量PCR儀 (型號：LineGene9600 Plus，博日科技公司) 檢測。在微量離心管中配置下列反應液：模版cDNA溶液1 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、2x SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL、dd H2O補充到20 μL。PCR反應條件為 50℃ 2 min，95℃ 2 min，然后 95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s進行40個循環，72℃終延伸10 min，4℃保存。

1.6 數據處理

通過t檢驗比較兩個鋅處理數據之間的差異，Duncan檢驗比較兩個鋅處理和兩個根區域IAA含量數據之間的差異。

2 結果與分析

2.1 生物量和含鋅量

培養15 d后，缺鋅處理植株出現明顯缺鋅癥狀：地上部矮化，節間縮短，葉片變小，新葉基部出現白化或黃化，20 d后，葉片出現壞死性褐色斑塊。

據表1可知，缺鋅處理15 d的植株地上部與根系干重明顯降低，根冠比增大。不施鋅植株地上部和根系中鋅含量明顯降低。

2.2 根系形態

缺鋅處理15 d的玉米根系生長狀況如圖1所示。表2數據表明，根系的總根長、根表面積、根體積、根系直徑均下降，根系發育明顯受抑。側根總長、平均側根長縮短，側根密度增加。

缺鋅條件下，0.45～1.05 mm和 ≥ 1.05 mm直徑范圍內的根系長度明顯減少， ≤ 0.45 mm直徑范圍內的根系長度與正常供鋅處理之間無明顯差異，但在總根長中所占比例增加，表明根系變細 (表3)。

2.3 根系生長素含量

如圖2所示，缺鋅條件下，距根尖1 cm根系區域中生長素含量與正常供鋅處理之間無顯著性差異，而距根尖1～2 cm的根系區域中生長素含量較正常供鋅處理降低約30%。正常供鋅條件下，靠近根尖部分生長素含量較遠端降低，而缺鋅條件下，距離根尖0～1 cm與1～2 cm區域中生長素含量差異不大。

2.4ZmAUX1、ZmPIN1c表達

圖1 玉米根系生長照片Fig. 1 Maize roots with and without Zn application

表1 缺鋅和施鋅處理下玉米植株生物量和含鋅量Table 1 Dry matter weights and Zn concentrations of maize plants with and without Zn application

表2 缺鋅和施鋅處理下玉米根系形態指標Table 2 Root morphology of maize with and without Zn application

2.4.1 總RNA提取結果 利用試劑盒法提取總RNA，核酸測量儀測定結果表明，缺鋅處理和加鋅處理的OD 260/280值分別為1.92和1.98，但缺鋅處理總RNA濃度較低，為530.1 ng/μL，而加鋅處理為1180.1 ng/μL。瓊脂糖凝膠電泳結果 (圖3) 顯示，無DNA和蛋白質污染，效果良好，RNA無明顯降解。

2.4.2 實時熒光定量PCR結果 缺鋅處理下，根系中編碼ZmPIN1c和ZmAUX1基因表達明顯受到抑制(圖4)，這可能導致生長素極性運輸受阻。

表3 缺鋅和施鋅處理下玉米不同直徑 (mm) 范圍內根系長度 (cm)Table 3 Root length with various diameter in maize plants with and without Zn application

圖2 缺鋅和施鋅處理下玉米根系不同區段生長素含量Fig. 2 IAA concentration in different regions of maize roots with and without Zn application

圖3 缺鋅和施鋅處理下玉米根系的總RNA電泳圖Fig. 3 Isolated RNA from the roots of maize plants with and without Zn application

圖4 實時熒光定量PCR分析缺鋅和施鋅處理下玉米根系ZmAUX1和ZmPIN1c表達Fig. 4 Real-time quantitative (qRT-PCR) analysis of ZmAUX1 and ZmPIN1c genes expression in maize plantswith and without Zn application

3 討論與結論

鋅是植物必需微量營養元素。植物正常Zn含量為25～150 mg/kg (干重)。當Zn含量低于20 mg/kg時，植物可能表現出缺鋅癥狀[1]。根系Zn含量較地上部高[1]。本試驗缺鋅處理下的鄭單958植株地上部Zn含量低于10 mg/kg，低于缺Zn臨界水平。缺鋅導致節間縮短，植株矮化，新葉基部出現失綠或白化。1 mmol/L適量鋅供給明顯改善玉米生長，地上部生物量顯著提高。

良好的根系形態和生理特性對植物高效吸收利用土壤鋅具有重要意義[2,6,27–28]。汪洪等[27]試驗表明水稻根系形態和構型變化影響植株Zn吸收積累及體內Zn利用效率。利用盒維數法結合根系圖像分形分析程序法研究發現分形維數和分形豐度與植株地上部干重、單位Zn濃度所產出的地上部生物量、地上部Zn吸收量之間呈顯著正相關關系。Dong等[28]報道，Zn高效小麥品種Excalibur與Zn低效硬粒小麥品種Durati相比，直徑 ≤ 0.2 mm細根在總根長中比例較高。細根比例高，根系比表面積增加，有利于提高植物對土壤中鋅的吸收。本試驗發現，缺鋅抑制玉米根系發育，其總根長、總根表面積、總根體積、直徑、總側根長、平均側根長均下降，0.45～1.05 mm和 ≥ 1.05 mm直徑范圍內的根系長度減少， ≤0.45 mm直徑范圍內根系在總根長中所占比例增加。

缺鋅植物體生長素含量下降。生長素是由細胞快速分裂的組織合成，如莖尖、幼嫩葉片、根尖。在植物體內，以色氨酸為前體，通過若干途徑合成IAA。根據主要中間產物可以把IAA合成的色氨酸途徑分為吲哚–3–丙酮酸途徑、吲哚–3–乙醛肟途徑、色胺途徑和吲哚-3-乙酰胺途徑四條支路[29]。缺鋅植株體內色氨酸含量降低，使得IAA合成途徑受阻，IAA含量下降；也有人推斷，IAA含量的降低是因為缺鋅導致氧自由基含量增加，IAA氧化降解增加[1]。

生長素極性運輸表現為在莖中生長素向基部運輸，在根中向根尖運輸，這一現象被認為是生長素轉運蛋白在質膜上的極性分布所致[21]。IAA進入細胞需要AUX1蛋白協助，IAA經PIN轉運蛋白作用才能運出細胞[21]。PIN成員通過不同的表達模式以及細胞極性分布使得生長素精細的時空分布能夠在特定的細胞類型或細胞層中得以實現，負責調控地上部IAA向基運輸以及根中IAA的向頂運輸。PIN1定位于初生維管組織，在根的表皮和皮質中也存在表達。PIN1、PIN2、PIN3、PIN4、PIN7共同調控根分生組織的發育。PIN1主要負責將到達根尖后的生長素與根尖合成的生長素向頂運輸[22]。本研究發現，缺鋅的玉米根尖生長素含量明顯降低，且較正常供鋅處理相比，玉米根尖并未產生IAA濃度梯度差；同時發現轉運蛋白編碼基因ZmAUX1和ZmPIN1c表達相對較弱，這可能會影響在根系中的極性運輸，生長素濃度梯度分布紊亂，從而影響根系發育生長。

缺鋅條件下，ZmAUX1和ZmPIN1c基因表達較少，原因可能與缺鋅影響植物體內RNA含量有關。植物缺鋅時體內RNase酶活性提高，RNase降解RNA，造成RNA含量降低[1]。RNA聚合酶含有鋅[1]，該酶保護核糖RNA免造降解，缺鋅時該酶活性降低。鋅與植物體內蛋白合成也有密切關系，鋅能保持核糖核蛋白體完整性[1–2]。轉錄因子鋅指蛋白含有鋅，鋅指蛋白主要功能是與特定的靶DNA或靶蛋白結合從而參與基因的表達的調控，影響蛋白質合成，缺鋅可能會使鋅指蛋白含量降低[1]。

綜上所述，玉米缺鋅導致根系內生長素含量下降，根系中生長素運輸蛋白編碼基因ZmPIN1c和ZmAUX1表達減弱，生長素在根系中濃度分布梯度變化，從而影響根系生長發育，但仍需要進一步通過生長素及其轉運蛋白分布和功能的精細定位開展研究。

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Effects of zinc deficiency on root growth, endogenous auxin content and key auxin transport genes expressions in maize roots

ZHOU Bin1,2, ZHANG Jin-yao2, YI Yin1, WANG Hong2*
(1 School of Life Sciences, Guizhou Normal University, Guiyang 550001, China; 2 Key Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizer，Ministry of Agriculture/Institute of Agricultural Resources and Regional Planning,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

【Objectives】The objective of this study was to reveal effects of zinc (Zn) deficiency stress on plant root growth, endogenous IAA content and key auxin transport genes expressions in roots of maize. It would provide some molecular biological evidences of maize plants subjected to Zn deficiency stress.【Methods】The maize cultivar Zhengdan958 was chosen as the test crop. Hydroponic culture experiment was conducted with Zn 0 and 1.0 μmol/L treatments. The plant shoot and root biomass were weighted. Dry plant samples were digested with HNO3-H2O2for Zn determination by atomic absorption spectrophotometer. Root samples were stored in FAA solution (70% alcohol︰38% formaldehyde︰acetic acid = 90︰5︰5 by volume ratio) prior to measurements. The root systems were digitized for image analysis with WinRHIZO sofware. Root length, diameter, volume and surface area were obtained. The endogenous indole-3-acetic acid of fresh root samples was determined by gas chromatography-mass spectrometer. Real-time quantitative PCR technique was used to quantify the expression levels ofZmAUX1andZmPIN1cin the roots.【Results】The results showed that Zn content of maize shootswithout Zn application was below the critical level of 20 μg/g. Zn deficiency stress significantly decreased shoot dry weight, root surface, root volume, root diameter, total root length, total lateral root length, and average lateral root length, but increased lateral root density. The concentrations of indole-3-acetic acid (IAA) within the regions of 2 cm from root tips were lower by about 30% under Zn deficient condition than normal Zn treatment.Moreover, there was no significant difference for IAA content between the two regions under no Zn added. The expressions ofZmAUX1andZmPIN1cwere significantly declined by limited Zn supply.【Conclusions】Zn deficiency might change IAA distribution in roots through inhibiting expressions ofZmAUX1andZmPIN1c,which would have a negative influence on root growth and development.

maize; zinc deficiency; root; auxin; auxin transport gene

2017–02–27 接受日期：2017–05–02 網絡出版日期：2017–06–19

國家自然科學基金項目（31372138）；國家重點研發計劃項目（2016YFD0200108）資助。

周斌（1990—），安徽蚌埠人，碩士研究生，主要從事作物微量營養元素研究。E-mail：zhoubean@126.com

* 通信作者 Tel：010-82105021，E-mail：wanghong01@caas.cn