生物有機肥育苗防控煙草青枯病

劉艷霞，李 想，蔡劉體，石俊雄

（貴州省煙草科學研究院，貴陽 550000）

生物有機肥育苗防控煙草青枯病

劉艷霞，李 想*，蔡劉體，石俊雄

（貴州省煙草科學研究院，貴陽 550000）

【目的】煙草青枯病是影響貴州煙葉生產的主要土傳病害之一。生物防控方法作為防控煙草青枯病體系的有效措施之一，尋求經濟可行的途徑勢在必行。【方法】利用實驗室自主篩選到的煙草青枯菌拮抗菌NJL-14，通過二次固體發酵研制成煙草專用拮抗青枯病型生物有機肥 (BIO)，選取K326和紅花大金元兩個煙草品種分別進行育苗和盆栽試驗。育苗床基質分別添加BIO 1%、2%、3%、4%和5%，以確定適宜的BIO育苗添加量。盆栽試驗兩個品種分別設定五個處理：常規基質育苗 + 植煙健康土壤(CKn+CKp）、常規基質育苗 + 青枯病病土（CKn+Rs）、常規基質育苗 + 青枯病病土 + 有機肥(CKn+OFp)、常規基質育苗 + 青枯病病土 + BIO(CKn+BIOp)、育苗和盆栽病土中都施入BIO(BIOn+BIOp)。分別采用熒光定量PCR和Biolog-ECO研究育苗基質和盆栽土壤中細菌和真菌數量變化，以及微生物功能多樣性，特別是煙草青枯菌及其拮抗菌的消長關系。【結果】當BIO濃度在2%以內時，煙草的發芽率與對照無顯著差異；與普通漂浮育苗相比，托盤育苗不但能穩定和延長拮抗菌NJL-14在根際的定殖，而且顯著提高煙苗生物量，K326經BIO育苗處理的煙苗地上部和地下部的干重分別比常規基質育苗的處理高17.2%和30.8%，而紅花大金元分別高14.9%和20.0%；采用育苗與移栽土壤雙重使用BIO模式對煙草青枯病的防控效果明顯，防控效果可以達到100%，明顯優于只在盆栽中使用BIO模式，并且能夠顯著抑制土壤中病原菌數量在107cfu/g土以下，同時有效提高土壤微生物生態多樣性。【結論】采用育苗與移栽土壤雙重使用煙草專用拮抗青枯病型生物有機肥模式可有效防控煙草青枯病，控制土壤中病原菌數量，改善土壤微生物功能多樣性，為有效地生物防控煙草青枯病奠定基礎。

生物有機肥；托盤育苗；煙草青枯病；生物防控；微生物多樣性

拮抗菌單獨施入土壤后不易定殖，提高拮抗菌在土壤根際的定殖成為生物防控的研究重點。目前采用拮抗菌結合有機肥或經過2次發酵制成生物有機肥來調節土壤微生態、改善土壤微生物多樣性、抑制病原菌的生長或提高植物自身抗性，從而抑制病害的發生[1–2]，如Qiu等[3]利用生物有機肥顯著降低黃瓜枯萎病的發病率并改善土壤的微生物群落結構；Zhao等[4]利用SQR21拮抗菌的生物有機肥降低西瓜枯萎病真菌尖鐮孢菌的數量級，進而達到防控效果；Wu等[5]利用解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌制成的生物有機肥，抑制病原菌的生長取得很好的防控效果；Ding等[6]研制的BIO-36和BIO-23生物有機肥對馬鈴薯青枯病防控效果分別可以達到96%和91%。劉艷霞等[7]利用生物有機肥防控煙草青枯病，在田間防控率可高達95.4%。

近年來，有機肥特別是具有特殊功能性的生物有機肥的施用成為修復煙田土壤、防治各種土傳病害的新思路。但田間生物有機肥的用量大，這樣勢必會增加成本。而且，煙苗移栽于煙田后，同時接觸拮抗菌和病原菌，病原菌依然可能侵入到煙草根際，從而大大降低了生物有機肥的保護功效。

本研究針對貴州省煙草青枯病，篩選青枯菌高效拮抗菌，并二次固體發酵為煙草專用拮抗青枯病型生物有機肥 (BIO)，通過向傳統育苗基質中施入一定比例的BIO，分別在苗期和盆栽時調查青枯病病情及監測細菌、真菌、青枯菌和拮抗菌的數量變化，以及微生物生態多樣性差異，研究并驗證在煙草育苗期間施入煙草專用拮抗青枯病型生物有機肥，拮抗菌在煙苗根際形成一層保護鞘，從而提高移栽后煙苗對煙草青枯病的抵御效果，旨在為有效生物防控煙草青枯病提供一條經濟可行的途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草品種分別為K326和紅花大金元，K326為中抗青枯病品種，紅花大金元為中感青枯病品種[8]。

托盤育苗基質采用烤煙專用育苗基質，其主要以蚯蚓糞便和珍珠巖為生產原料 (專利證號為ZL200710202167.6)。盆栽試驗所用病土取自貴州省黔南州長順縣廣順鎮石洞村 (26.03°N，106.45°E)，經檢測土壤中青枯菌 (Ralstonia solanacearum) 數量為3.79 × 106cfu/g土。病土與健康土均取自同一田塊，將煙株根部連帶上面附著的土壤一并取回，經超聲處理分離出根際土壤。采集土壤樣品為黃壤，pH 5.45、有機質48.6 g/kg、全氮2.29 g/kg、堿解氮158 mg/kg、速效磷48.9 mg/kg、速效鉀543 mg/kg。

供試煙草青枯菌拮抗菌NJL-14由本實驗室采用稀釋平板涂布結合噴霧法篩選分離[9]，拮抗圈半徑達到10 mm (圖1)，經分子生物學鑒定為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)。煙草專用拮抗青枯病型生物有機肥(BIO) 制備：NJL-14在牛肉膏蛋白胨液體培養基中于30℃搖床中170 rpm培養48 h；有機肥為菜粕酶解的菜粕有機肥與牛糞堆肥以1︰1 (質量比) 混合而成 (簡稱有機肥)，經測定含有機質33.8%、氨基酸4.3%、N 4.20%、P2O52.26%、K2O 1.08%；將拮抗菌NJL-14培養液以5%的接種量接入上述有機肥中，調節溫度為30～45℃，含水量為30%～40%，發酵4～5天，期間不斷翻拋，發酵完成后含水量達到34.9%，即為含有NJL-14的煙草專用拮抗青枯病型生物有機肥[10]。

圖1 拮抗菌NJL-14對青枯菌的平板拮抗效果Fig. 1 Suppression of R. solanacearum by the isolated antagonist NJL-14

BIO二次發酵前后的細菌、放線菌、真菌和拮抗菌的數量見表1。經拮抗菌二次發酵后的BIO與發酵前的有機肥相比，細菌、放線菌和真菌的數量都有所增加，細菌放線菌增加幅度較大，而真菌數量增加較少。拮抗菌蠟狀芽孢桿菌NJL-14發酵后其數量增加了6個數量級，表明拮抗菌通過二次固體發酵數量顯著增加。

1.2 試驗設計

1.2.1 BIO對煙草發芽率的影響試驗 將煙草專用拮抗青枯病型生物有機肥分別以1%、2%、3%、4%和5%比例摻入普通育苗基質中，以不添加為對照。玻璃培養皿滅菌后每平板分別鋪約1 cm厚基質，基質表面放置100粒K326和紅花大金元種子，每個處理15次重復，放置于光照培養箱中25℃、75%水分中培養，每天定期測定其出芽率。

1.2.2 BIO基質育苗試驗 根據對煙草發芽率的影響結果，將BIO以適合煙草種子發芽的濃度施入到煙草常規育苗基質中。分別采用常規漂浮育苗和托盤育苗[11]，K326和紅花大金元分別設置4個處理：1) 常規漂浮育苗對照 (CK)；2)BIO漂浮育苗 (BIO)；3) 托盤育苗對照 (CKn)；4)BIO托盤育苗 (BIOn)。分別采集育苗期0、30和60 d的基質，采用熒光定量PCR檢測基質中的蠟狀芽孢桿菌數量。60 d時測量煙苗的生物量。

1.2.3 BIO盆栽試驗 盆栽試驗在貴州省煙草科學研究院人工氣候室進行。煙草育苗結束后移栽在青枯病病土中，有機肥和BIO以50 g/plot與土壤混合均勻，每盆裝土10 kg移栽1株煙。紅花大金元和K326分別設5個處理，具體育苗和土壤處理見表2，每個處理15次重復。移栽當天采集土壤樣品，分別于30、60和90 d統計病情，計算青枯病發病率和防控率[12]，并采集根際土壤約50 g用熒光定量PCR檢測土壤中病原菌、拮抗菌、細菌和真菌數量的變化。移栽80 d后根據煙葉成熟情況由下至上分次采收并烘烤，計算不同處理煙葉產量。

病害嚴重度分級 (以株為單位分組調查)：0級，全株無病；1級，莖部偶有退綠斑，或病側二分之一以下葉片凋萎；3級，莖部有黑色條斑，但不超過莖高二分之一，或病側二分之一至三分之二葉片凋萎；5級，莖部黑色條斑超過莖高二分之一，但未到達莖頂部，或病側三分之二以上葉片凋萎；7級，莖部黑色條斑到達莖頂部，或病株葉片全部凋萎；9級，病株基本枯死。

1.3 熒光定量PCR檢測病原菌、拮抗菌、細菌和真菌數量

熒光定量PCR采用TaKaRa公司的實時熒光PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM在ABI 7500TM實時熒光定量PCR檢測儀上運行。茄科勞爾氏菌的熒光定量PCR反應中，特異性引物為[13]正向引物Flic-F: GAACGCCAACGGTGCGAACT；反向引物Flic-R:GGCGGCCT TCAGGGAGGTC；蠟樣芽孢桿菌的特異性引物分別為gyrBF: 5′-CCTTGTAACGGATA ATGGAC-3′，gyrBR: 5′-CCACCACCAAACTTACCA C-3′[14]。熒光定量 PCR 擴增反應體系 (20 μL)：SYBR?Premix Ex TaqTM(2 ×) (TaKara) 10.0 μL、ROX Reference Dye(50 ×) 0.4 μL、flicF 0.4 μL、filcR 0.4 μL、DNA 模板 2.0 μL。 DDH2O 6.8 μL 反應程序為 95℃預變性30 s、95℃變性5 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，40個循環。溶解曲線步驟為95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s，反應結束后確認擴增曲線和溶解曲線。

表1 BIO 二次固體發酵前后可培養微生物和拮抗菌數量 (cfu/g)Table 1 Counts of culturable microorganisms and antagonist before and after the BIO secondary solid fermentation

表2 煙草專用拮抗青枯病型生物有機肥育苗盆栽試驗處理Table 2 Treatments in the pot experiment of the BIO nursery

細菌和真菌擴增反應體系為50 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM(2 ×)25 μL，ROX Reference Dye II(50 ×)1 μL，上下游引物 (10 mmol/L) 各 1 μL，DNA 模板 4 μL，雙蒸水18 μL。細菌特異性引物為USU1:5′-AACTGGAGGAAGGTGGGGA-3′[15]、USU2:5′-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3′；真菌特異性引物為 Fung:5′-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3′、NS1:5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′[16]。反應程序為 95℃10 s、95℃ 5 s，細菌退火溫度為58℃，真菌退火溫度為54℃ 30 s、72℃ 30 s，40個循環。最后添加熔解曲線步驟為 95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s。

1.4 土壤微生物功能多樣性檢測

根際土壤微生物功能多樣性用BiologEcoPlate系統 (Biolog Inc. Hayward Cal. USA) 通過比較31種碳源利用情況測定[17]。土壤懸液在4℃、3000 × g轉速下離心5 min，然后用0.85%的NaCl溶液稀釋100倍。土壤稀釋液接種于EcoPlates，在Biolog恒溫 (25℃) 培養箱中暗培養72 h。EcoPlates上每孔顏色變化度為OD值與對照OD值差[18]。微生物活性用微孔板平均顏色變化度 (AWCD) 值表示，Shannon指數、Simpson指數和McIntosh指數指征土壤微生物功能多樣性。

式中：Pi=Ai/Atotal；ni=Ai；N=Atotal；A代表590 nm 處吸光度。

1.5 數據分析

試驗數據采用Microsoft Excel 2003處理，顯著性分析采用SPSS Base Ver.13.0統計軟件 (SPSS, IL,Chicago, USA) 進行，用LSD、Duncan新復極差進行多重比較 (P≤ 0.05)。

2 結果與分析

2.1 BIO對煙草發芽率的影響

由圖2可以看出，當BIO濃度在2%以內時，煙草的發芽率與對照相比無顯著差異，而當BIO濃度高于2%時，發芽率降低。因此，選用2%作為煙草基質育苗中加入BIO的比例。

2.2 育苗基質中蠟狀芽孢桿菌數量動態變化

通過熒光定量PCR計數，原始基質中含有的蠟狀芽孢桿菌數量達到104copies/g土 (表3)。隨著育苗時間延長，漂浮育苗和托盤育苗中的拮抗菌數量都呈現逐漸下降趨勢。兩品種的漂浮育苗對照和托盤育苗對照中原始基質中的蠟狀芽孢桿菌數量隨時間延長逐漸下降，但都保持在同一數量級水平上。育苗30 d時，漂浮育苗BIO處理的拮抗菌數量從107copies/g土下降一個數量級至106copies/g土，而托盤育苗BIO處理的拮抗菌數量雖然有小幅下降，但在數量級上沒有改變。育苗60 d時，漂浮育苗BIO處理的拮抗菌數量與30 d相比又下降一個數量級，紅花大金元和K326托盤育苗BIO處理蠟狀芽孢桿菌數量分別比對應品種30 d下降56.6%和29.6%。在整個育苗過程中，托盤育苗拮抗菌數量的減少顯著低于漂浮育苗，可能是由于托盤育苗提供相對干燥的環境，提供更多的氧氣，使得拮抗菌更易定殖。兩品種間比較，同等處理的K326拮抗菌數量隨時間減少的趨勢明顯低于紅花大金元。

圖2 煙草專用拮抗青枯病生物有機肥接種量對煙草發芽率的影響Fig. 2 Effects of the BIO inoculation amounts on tobacco seed germination

表3 育苗基質中拮抗菌數量動態變化 (× 104 copies/g, soil)Table 3 Dynamics of antagonists’ population in the seedling substrate

2.3 BIO對煙苗生長的影響

BIO育苗不但可以增強拮抗菌的定殖能力，還可以對苗期煙株的生長起到一定的促生作用。對于紅花大金元和K326兩個品種，用BIO漂浮育苗后，生物量都比對照的常規基質育苗有所增加，K326的地上部和地下部的干重分別增加17.2%和30.8% (表4)，紅花大金元的地上部和地下部的干重分別增加14.9%和20.0%。用黑色塑膠盤培育的煙苗 (托盤育苗)，基質的相對濕度要小于漂浮育苗的煙苗，BIO對煙苗生長的促生作用更明顯，K326經BIO育苗處理的煙苗地上部和地下部的干重分別比常規基質育苗的處理高5.0和3.4倍，而紅花大金元分別高5.8和4.3倍。兩個品種經托盤育苗生物量都要小于漂浮育苗，可能是由于漂浮育苗更利于煙苗對營養元素的吸收，因此煙苗的生長相對更迅速。

2.4 盆栽試驗中煙草青枯病的防控效果

從圖3中可以看出，K326所有處理均未發生青枯病，同處理紅花大金元發病率高于K326。

在病土基礎上施加普通有機肥的處理 (CKn+OFp)，其60 d和90 d發病率高于病土對照，青枯病防控率為負值 (表5)，這可能是由于有機肥為土壤中的病原菌提供了豐富的營養，促進了病土中青枯菌的生長，使得病原菌數量增加，反而使得煙株更易感病。在育苗基質和盆栽土壤中都施入煙草專用拮抗青枯病型生物有機肥的處理，對青枯病的防控要顯著好于對照處理或是只在盆栽中加入生物有機肥的處理，可能由于育苗期間拮抗菌已經定殖在煙苗根際，因此，當盆栽試驗基質中有病原菌的存在時，拮抗菌照樣可以發揮作用，從一開始就能降低病原菌的數量，起到保護煙株的作用。

2.5 盆栽試驗中土壤病原菌與拮抗菌間的消長關系

對紅花大金元品種，健康土對照由于未接入病原菌和拮抗菌，在煙葉生長的全生育期，病原菌和拮抗菌都維持在103cfu/g土左右 (圖4)；CKn+Rs和CKn+OFp兩處理病原菌數量先增加后降低，而且CKn+OFp處理由于有機肥的存在，為病原菌提供了豐富的營養物質，因此煙草全生育期土壤病原菌的數量比病土對照 (CKn+Rs) 分別增加31.8%～73.8%，拮抗菌數量也呈現先上升后下降的趨勢。CKn+BIOp處理和BIOn+BIOp處理由于BIO中拮抗菌的存在，煙草移栽后土壤中病原菌的數量逐漸減少，而在育苗基質和盆栽土壤中都施入BIO的處理 (BIOn+BIOp)育苗期間拮抗菌已經定殖在煙苗根際，盆栽試驗又施入BIO強化了根際拮抗菌，因此病原菌在每一時期都顯著低于只在盆栽時施入BIO處理 (CKn+BIOp)，且數量穩定保持在107cfu/g 土以下，并隨生育期遞減。CKn+BIOp處理的拮抗菌數量隨生育期遞減，移栽后90 d拮抗菌數量降到移栽時的6.5%，而BIOn+BIOp處理的拮抗菌數量在移栽后30 d略有上升，然后隨生育期呈持續下降趨勢，移栽后90 d時拮抗菌數量比移栽時減少69.8%，明顯緩于CKn+BIOp處理。

表4 煙草專用拮抗青枯病型生物有機肥對煙草苗期生物量的影響Table 4 Effects of bio–organic fertilize on tobacco seedling biomass in the nursery experiment

圖3 盆栽試驗不同處理煙草青枯病發病情況Fig. 3 Tobacco bacterial wilt occurrence of different treatments in the pot experiment

對于K326品種，除病土對照 (CKn+Rs) 和有機肥處理 (CKn+OFp) 兩處理中的病原菌數量在移栽后30 d略有上升外，其他處理中的病原菌數量都迅速降低，所有處理中的茄科勞爾氏菌在移栽后90 d都降至105cfu/g土水平。在育苗基質和盆栽土壤中都施入BIO的處理 (BIOn+BIOp) 在移栽后各時期的拮抗菌數量都顯著高于只在盆栽時施入BIO處理 (CKn+BIOp)，前者在移栽后30 d、60 d和90 d的拮抗菌數量分別為后者的3.39、3.09和10.72倍，表明煙草專用拮抗青枯病型生物有機肥育苗并在盆栽中強化能夠有效延長拮抗菌在根際的定殖。

表5 盆栽不同處理對煙草青枯病防控率和產量的影響Table 5 Control efficiency to tobacco bacterial wilt and yield of different treatments in the pot experiment

圖4 盆栽試驗土壤青枯病病原菌與拮抗菌數量消長關系Fig. 4 Population of pathogen and antagonist of soil in the pot experiment

2.6 盆栽試驗根際微生物數量和群落功能多樣性

從表6可以看出，所有處理的細菌和真菌數量無顯著差異，無論是紅花大金元還是K326病土對照的細菌數量在所有處理中最低，施入煙草專用拮抗青枯病型生物有機肥處理的細菌數量相對較高，育苗基質和盆栽試驗雙重施入BIO處理的細菌數量最多，真菌數量最少，分別比只在盆栽中施入BIO處理細菌高6.3% (紅大) 和2.2% (K326)，真菌少23.7% (紅大) 和43.9% (K326)。兩品種病土對照的Shannon指數、Simpson指數和McIntosh指數顯著小于健康土對照，功能多樣性下降。紅花大金元的只在盆栽中施入BIO(CKn+BIOp) 和育苗、盆栽中都施入BIO(BIOn+BIOp) 處理的Simpson指數和McIntosh指數間無顯著差異，但Shannon指數差異顯著，BIOn+BIOp的Shannon指數比CKn+BIOp高10.0%。K326的育苗和盆栽都施入BIO處理 (BIOn+BIOp) 的Shannon指數、Simpson指數和McIntosh指數顯著高于只在盆栽中施生物有機肥處理 (CKn+BIOp) 處理。

表6 盆栽不同處理根際土壤微生物數量和群落功能多樣性Table 6 Counts of bacteria and fungi and the functional diversity of microorganisms in the rhizosphere soil

3 討論

單一的菌株制劑[19]或者純有機肥產品對土傳病害的防控效果都很有限。土傳病原菌拮抗菌與適合其生長的有機載體 (優質有機肥) 一起結合施入于土壤，使得拮抗菌更易在根際定殖，形成優勢種群，阻止病原菌對作物根系的侵染，從而起到較好的防控效果，這一結果已經在煙草[16]、番茄和辣椒[20]、西瓜[21]、棉花[22]、甜瓜[23]等作物上得到驗證。近年來有學者從施用有機肥的角度，通過外源微生物和有機碳的輸入來進行土壤改良進行克服連作障礙、防控土傳病害，但這類實踐存在爭議且效果并不穩定[24]。例如，在長期連作條件下，單獨的生物有機肥施用并不能有效緩解馬鈴薯連作障礙，減少塊莖產量損失[25]。

生物有機肥在育苗和盆栽中雙重使用，不但可以減少肥料用量，以大幅度地降低生物有機肥施用成本，還能促使拮抗菌在植物根系表面形成“微生物生物防御層”，提前定殖后防止或減少病原菌，有效防控病害發生，維持植物根系正常生長[26]。張苗等[27]利用具有促生及生物防控效果的PGPR菌株Bacillus amyloliquefaciensSQR9研制出活性育苗基質和生物有機肥，育苗及盆栽試驗對黃瓜和茄子具有一定的促生效果，并且對黃瓜枯萎病的防控效果達到40.39%。滕桂香等[28]研究表明，苗床期施用微生物有機肥有助于培育壯苗，移栽大田后再次穴施微生物有機肥極大提高烤煙的產量和品質。煙草由于一直以來采用漂浮育苗，漂浮水影響了拮抗菌的定殖，因此拮抗菌育苗很少在烤煙上使用。本研究通過將拮抗菌二次固體發酵后，并采用托盤育苗方式，拮抗菌在育苗基質中的定殖能力大大增強。與傳統的飄浮育苗相比，托盤育苗的拮抗菌更易生存，因此在煙苗移栽后其拮抗菌的數量在所有處理中也是最多的。育苗時就加入拮抗菌，比在煙苗移栽后加入拮抗菌的處理，拮抗菌可以更快地進入增長階段，由此保證了拮抗菌在基質中的數量，這樣對于拮抗病原菌就提供了有力的保障。

葛慈斌等[29]通過番茄組培試驗發現青枯病發病濃度為8.0 × 106cfu/g土，但烤煙前期研究表明當土壤中茄科勞爾氏菌數量降到107cfu/g土以下時，不易發生煙草青枯病[7]。由于番茄和烤煙品種不同，加之番茄采用組培試驗，而烤煙是田間實際生產，土壤比培養瓊脂更具復雜性和緩沖性。因此，在烤煙實際生產中，其土壤中能夠誘導青枯病發生的濃度要高于組培番茄能夠誘導青枯病發生的濃度。本試驗中，盆栽中施用生物有機肥和育苗+盆栽雙重施用生物有機肥兩處理，在移栽30 d后都可以將土壤中病原菌降到107cfu/g土以下，在煙草生長全生育期青枯病的防控率都達78.6%以上。育苗+盆栽雙重施用生物有機肥處理對病原菌的抑制作用優于只在盆栽中施用生物有機肥處理，在全生育期土壤病原菌數量下降兩個數量級。

由于K326對煙草青枯病具有中抗性，因此K326所有處理均未發生青枯病，施入煙草專用拮抗青枯病型生物有機肥與否在青枯病防控效果上無差異；而紅花大金元對煙草青枯病具有中感性，因此病土處理青枯病發病達到100%，施用生物有機肥處理防控效果明顯。另外，不同抗性品種間煙草的根系分泌物組分存在較大差異，其對根際微生物種類和數量的影響不同[30]，導致施入生物有機肥前后兩品種根際的病原菌和拮抗菌數量不同，K326根際土壤的病原菌數量減少比紅花大金元更為迅速，但總體而言，施入生物有機肥后，根際土壤中的病原菌數量顯著下降。Yin等[31]研究表明，水稻苗期枯萎病與土壤有機質含量及微生物活性成負相關，施入有機肥后土壤微生物活性和酶活增加，發病情況降低。在本研究中，無論是紅花大金元還是K326品種，育苗+盆栽雙重施用生物有機肥處理的Shannon多樣性指數、Simpson指數和McIntosh指數顯著高于只在盆栽中施用生物有機肥處理，表明多次施用生物有機肥能夠增加土壤微生物功能多樣性。生物有機肥的施用可以提高土壤微生物活性，改善微生物結構和功能，從而實現土壤微生物生態平衡，抑制作物病害[32]。近來很多研究表明，對土傳病害的抑制在一定程度上是土壤微生物群體的作用[33]。本研究中，只在盆栽中施入生物有機肥和育苗+盆栽雙重施用生物有機肥處理能夠有效防控煙草青枯病，防控率分別達到78.6%和100%，其土壤微生物功能多樣性顯著高于其它處理，說明微生物群體作用有效降低了青枯病的發病情況，這可能是生物有機肥的施用增加了有益微生物的碳源利用強度，與土傳病原菌形成“營養競爭”，使病原菌得不到足夠的營養物質不能大量繁殖[34]，此論點與本研究中施入生物有機肥處理茄科勞爾氏菌數量顯著減少的結果相符。

由功能微生物二次固體發酵的生物有機肥不但能夠抑制土傳病害發生、增加土壤微生物活性，還能起到一定的促生作用。Wang等[35]研究表明，施用由Bacillus amyloliquefaciensW19制得的微生物肥料可顯著提高香蕉植株干重。趙青云等[36]研究發現，施用生物有機肥香草蘭地上部干重和根系干重均顯著高于對照, 分別增加了63.1%和59.4%。部分微生物兼具促生和生防的效果，例如短短芽孢桿菌二次固體發酵的生物有機肥對煙草青枯病的防控率達到92.3%，同時可顯著提高煙葉和根系生長[9]，與本研究結果相似，即施用生物有機肥對煙苗生長具有顯著的促進作用。

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Nursery application of a novel bioorganic fertilizer on controlling tobacco bacterial wilt

LIU Yan-xia, LI Xiang*, CAI Liu-ti, SHI Jun-xiong
(Guizhou Academy of Tobacco Sciences, Guiyang 550000, China)

【Aims】Tobacco bacterial wilt is one of the most serious soil-borne diseases in tobacco growing area of Guizhou Province, China. Since bio-controlling tobacco bacterial wilt becomes more and more popular, it is of great importance to develop a high-efficient and economic way to bio-control this disease. 【Methods】In this study, the antagonistic strain NJL-14 was isolated in our own lab, and a novel bioorganic fertilizer (BIO) was developed using the secondary solid-fermented approach. Nursery and pot experiments were conducted to evaluate efficiency of the BIO application on controlling tobacco bacterial wilt. In nursury substitute, 1%, 2%,3%, 4% and 5% of BIO were added to test the suitable addition levles of BIO. In the follwing pot experiement, the addition level was used in the soil basal treatment. Using the seedlings from the nursury without treated with BIO,four treatments were set up as : healthy soil (un-infected with bacterial wilt), sick soil (infected with wilt), sick soil added with normal organic fertilizer , sick soil with BIO; and a treatment of using seedlings from BIO treated nursury and sick soil added with BIO. Real-time PCR and biology-ECO technology were employed to study population of bacteria and fungi in nursery substrate and soil, the soil microbial functional diversity, especially theeffect on the reproduction ofRalstonia solanacearumand its antagonist. 【Results】When the concentration of BIO was within 2%, there were no significant differences in the germination percentage between the control and the treatments. Compared with normal float seedlings, seedlings in tray stabilized the colonization of antagonistic strain NJL-14 in rhizosphere, and significantly increased tobacco seedling biomass. As for tobacco variety, K326,the dry weights of leaves and roots treated by BIO were increased by17.2% and 30.8% compared to the control.As for tobacco variety, Honghuadajinyuan, the dry weights of leaves and roots treated by BIO were 14.9% and 20.0% higher than that of the control. The best bio-control efficiency (100%) could be achieved by applying BIO at the nursery stage plus application in the transplanted soil, which was obviously better than the mode of only applying BIO in the pot experiment. Under the double-application mode, soil pathogen population was significantly depressed to less than 107cfu/g soil. Meanwhile, the soil microbial functional diversity was improved a lot. 【Conclusions】The mode of applying BIO at the nursery stage plus application in the transplanted soil could efficiently bio-control tobacco bacterial wilt, control soil pathogen concentration and improve soil microbial functional diversity. This work built a foundation for effectively bio-controlling tobacco bacterial wilt.

bioorganic fertilizer; seedling in tray; tobacco bacterial wilt; bio-control; soil microbial diversity

2016–09–26 接受日期：2017–04–20

國家自然科學基金（41461068）；中國煙草總公司重點項目（110201402009）；貴州省煙草總公司科技項目（201410）資助。

劉艷霞（1982—），女，河北張家口人，博士，副研究員，主要從事植物營養、土壤微生物區系分析等研究。

E-mail：liuyanxia306@163.com。 *通信作者 E-mail：iversonlyx@163.com