利用小麥秸稈生產木霉分生孢子及其生物有機肥對黃瓜的促生效果

馮程龍，王曉婷，康文晶，孟曉慧，張風革，冉 煒，沈其榮

（南京農業大學資源與環境科學學院/江蘇省固體有機廢棄物資源化利用高技術研究重點實驗室，江蘇南京 210095）

利用小麥秸稈生產木霉分生孢子及其生物有機肥對黃瓜的促生效果

馮程龍，王曉婷，康文晶，孟曉慧，張風革，冉 煒*，沈其榮

（南京農業大學資源與環境科學學院/江蘇省固體有機廢棄物資源化利用高技術研究重點實驗室，江蘇南京 210095）

【目的】木霉是重要的植物根際促生功能菌，然而木霉類生物肥料生產的應用基礎研究很薄弱。本研究以小麥秸稈為發酵基質，探究哈茨木霉T-E5產分生孢子的固體發酵工藝條件，并驗證發酵物作為生物有機肥的促生效果。【方法】在實驗室條件下，以小麥秸稈為固體發酵基質，研究固體發酵的不同發酵方式，溫度、酸濃度、酸種類、接種量、含水量、外加碳源和氮源等單因子條件下的產孢量；再利用正交試驗設計，研究溫度、酸濃度、含水量、接種量、外加氮源和碳源的發酵條件優化。利用兩季溫室盆栽試驗測定包括施用化肥、有機肥、發酵物和不同肥料組合的5個不同施肥處理的黃瓜地上部生物量、株高和葉面積。采用稀釋涂布法測定黃瓜盆栽根際土中總真菌數量和木霉菌數量。【結果】單因素條件優化：基質用稀硝酸 (0.1 mol/L) 調節酸度值后接種3%(v/w) 的1 × 107個/mL的T-E5孢子液，調節水分使初始含水量達到75%；在此條件下，添加尿素和玉米粉，在28℃下發酵培養8天，最大產孢量可達到8.87 × 109個/g。通過正交優化，每10 g小麥秸稈，加入調節酸度值的0.05 mol/L硝酸18.3 mL，含水量70%(濕基)，接種量9%，添加尿素的量為1%，30℃淺盤培養8天，產孢量達到1.1 × 1010個/g。第1季盆栽試驗結果表明，與單施化肥處理 (CCK) 相比，發酵產物與化肥配施 (CT) 使黃瓜的地上部分生物量、株高和葉面積分別提高14.97%、16.75%和14.64%；與單施有機肥處理(OCK) 相比，發酵產物與有機肥配施 (OT) 使黃瓜的地上部分生物量、株高和葉面積分別提高10.62%、26.06%和9.53%。第2季盆栽也有類似的促生效果，與CCK相比，CT使上述指標分別提高12.83%、11.49%和26.93%；與OCK相比，OT使上述指標分別提高5.96%、34.29%和18.01%。兩季盆栽添加木霉發酵物的處理中根際土總真菌數和木霉菌數量相比CCK、OCK和不施肥照 (CK) 均增加1個數量級以上。【結論】以小麥秸稈為主要原料，采用固體發酵工藝可生產高分生孢子含量的哈茨木霉菌劑及其生物有機肥，表明利用農業廢棄物生產高附加值的木霉菌劑及其生物有機肥具有可行性。但木霉孢子數量主要受發酵條件影響，今后應在中試和工廠化生產水平進一步研究木霉孢子固體發酵的工藝參數。

T-E5木霉；小麥秸稈；固體發酵；生物有機肥；黃瓜

木霉菌 (Trichodermaspp.) 屬真菌界、雙核菌門、半知菌亞門、絲孢綱叢、梗孢目、叢梗孢科，廣泛存在于土壤、森林、植株根際或葉面、樹皮及枯枝落葉中[1]。大量研究表明，一些木霉菌株屬于重要的植物根際促生真菌 (PGPF)，具有良好的促進植物生長和抑制植物病原菌的功能。木霉菌株通過競爭、重寄生和分泌次生代謝產物等方式，能抑制多種植物病菌的生長；通過分泌植物生長激素等物質，能顯著促進作物的生長[2–5]。Vinale等[6]利用哈茨木霉T22和深綠木霉Pl對萵苣、番茄和胡椒等作物進行處理后，植株果實數量、株高、地下部鮮重和干重均顯著提高。楊春林等[7]利用哈茨木霉菌株T-h-30對黃瓜、芹菜和番茄等幾種蔬菜進行大田試驗，結果發現木霉對植株的葉片數、株高等具有顯著的促進作用，且有效提高了蔬菜的品質和產量。因此，一些木霉屬菌株如哈茨木霉 (T. harzianum) 和綠色木霉 (T. aviride) 作為生物肥料或生物農藥，在農業生產上具有廣闊的應用前景[8–9]。然而，目前市場上木霉菌生物肥料或生物農藥并不常見，其中限制木霉菌應用的主要瓶頸之一是產品中木霉分生孢子數量偏低。

國內外對木霉發酵工藝的研究并不多見，有學者利用固體發酵工藝研究了木霉纖維素酶[10]、木聚糖酶[11]和揮發性有機物[12]。Verma 等[13–14]利用液體發酵工藝研究了活性污泥含量和預處理及溶解氧對木霉分生孢子數量的影響。張良等[15]通過固液發酵實驗表明固體發酵產孢效果明顯優于液體發酵。與液體發酵相比，固體發酵能較容易利用低成本的農業或工農業副產物作為培養基質，在資金和操作成本上較液體發酵低。固體發酵是在無重力水狀態下進行的，所需設備簡單，同時減少了液體發酵下游工程帶來的成本[16–18]。

小麥秸稈資源豐富，容易獲得，其中富含的纖維素在發酵過程中能被木霉利用。本研究以哈茨木霉T-E5 為試驗菌株，以小麥秸稈為發酵基質，經過溫度、酸濃度、含水量、接種量、添加氮源、添加碳源等單因子條件優化，再通過正交試驗優化，獲得產孢量最大的配方。通過盆栽試驗，以小麥秸稈發酵物作為生物有機肥研究其對黃瓜生長的影響。本研究初步探索到哈茨木霉TE-5菌株固體發酵產孢的較優工藝條件，為該菌的深入研究提供了有益的試驗數據，并為木霉菌肥和木霉類生物有機肥的推廣應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：哈茨木霉T-E5，南京農業大學國家有機肥料工程研究中心提供。T-E5菌株是由本課題組張風革[19]通過紫外誘變對野生菌株哈茨木霉SQRT037經過多級篩選，獲得一株性狀穩定、活性更強的誘變菌株。

固體發酵基質：經粉碎的純小麥秸稈粉。

供試作物：黃瓜新津春4號。

盆栽土壤：江蘇宜興地區養分貧瘠的亞表層水稻土，pH 6.8、有機質9.61 g/kg、全氮0.12 g/kg、有效磷5.42 mg/kg、速效鉀67.30 mg/kg。

有機肥：江蘇聯業生物科技公司生產的豬糞，養分含量為N 0.95%、P2O52.08%、K2O 1.26%。

木霉生物有機肥：木霉固體發酵物與普通豬糞有機肥以1∶10的比例復配得到，生物有機肥中木霉菌孢子數量為3.0 × 108個/g。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的配制 PDA固體培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、自來水1000 mL、pH自然。馬丁氏培養基：KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、瓊脂15～20 g、水1000 mL，此培養基1000 mL加1%孟加拉紅水溶液3.3 mL。臨用時每100 mL培養基中加1% 鏈霉素液0.3 mL。固體發酵培養基質：稱取10 g固體發酵基質，裝入250 mL三角瓶中，121℃下滅菌30 min，烘干待用。

1.2.2 孢子懸液的制備 PDA平板接菌放置在恒溫培養箱，溫度設置在28℃，8天后取出，在平板中添加10 mL左右的無菌水，并用無菌的涂布棒來回刮洗平板制備孢子懸液，用血球計數板法測定孢子懸液中的孢子含量。

1.2.3 孢子量的檢測 稱取10 g發酵產物，加入100 mL無菌水及5粒玻璃珠 (破碎混合均勻) 至三角瓶中，搖床設置在28℃，振蕩30 min，四層滅菌紗布過濾后測定孢子懸液的孢子量，用馬丁氏培養基通過梯度稀釋依次涂布的方法進行準確計數，測定發酵物的含水量，得到每克干物質孢子量，每個處理4次重復。

1.2.4 固體發酵培養方式 在10 g發酵基質中，加入15 mL無菌水及5 mL孢子懸液，攪拌均勻，分別放入三角瓶 (三角瓶法)、自封袋 (袋裝法[20]) 和方盒(淺盤平板法[21]) 28℃培養7天。按1.2.3方法檢測發酵物中孢子量。

1.2.5 固體發酵條件的單因素優化試驗方法

1) 培養溫度：在10 g發酵基質中，加入15 mL無菌水混勻，加入5 mL菌液，攪拌均勻，設置溫度梯度24℃、26℃、28℃、30℃、32℃淺盤培養7天。按1.2.3方法檢測發酵物中孢子量。

2) 酸濃度：在10 g發酵基質中，分別加入15 mL濃度為 0.2 mol/L、0.1 mol/L、0.01 mol/L、1 × 10–3mol/L、1 × 10–4mol/L 和 1 × 10–5mol/L(10–3～10–5，稀釋得到) 的稀硝酸以及超純水，攪拌均勻，靜置8小時，再加入5 mL菌液，攪拌均勻，28℃淺盤培養8天。按1.2.3方法檢測發酵物中孢子量。

3) 酸種類：在10 g發酵基質中，分別加入0.1 mol/L的硝酸、硫酸、鹽酸、磷酸的滅菌稀酸溶液15 mL，攪拌均勻，靜置8小時，加入5 mL菌液，攪拌均勻，28℃淺盤培養7天。按1.2.3方法檢測發酵物中孢子量。

4) 含水量：在10 g發酵基質中，加入0.1 mol/L的硝酸溶液，靜置8小時，再加入5 mL菌液，使含水量分別達到50%、60%、70%、75%、80%(濕基)后，攪拌均勻，28℃淺盤培養7天。按1.2.3方法檢測發酵物中孢子量。

5) 接種量：在10 g發酵基質中，加入0.1 mol/L的稀硝酸25 mL，攪拌均勻，靜置8小時，再加入1%、3%、5%、7%、9%等不同濃度的菌液5 mL，并使含水量達75%，攪拌均勻，28℃淺盤培養7天。按1.2.3方法檢測發酵物中孢子量。

6) 氮源：在10 g發酵基質中，加入0.1 mol/L的稀硝酸25 mL，分別加入1%的蛋白胨、酵母粉、尿素、硝酸鉀、硫酸銨攪拌均勻，靜置8小時，再加入3%的菌液5 mL，含水量75%，攪拌均勻，28℃淺盤培養7天。按1.2.3方法檢測發酵物中孢子量。

7) 碳源：在10 g發酵基質中，加入0.1 mol/L的稀硝酸25 mL，1%的尿素，分別加入1%的玉米粉、小麥粉、大豆粉、葡萄糖、蔗糖，攪拌均勻，靜置8小時，再加入3%的菌液5 mL，含水量75%，攪拌均勻，28℃淺盤培養7天。按1.2.3方法檢測發酵物中孢子量。

1.2.6 發酵時間 在10 g發酵基質中，加入0.1 mol/L的稀硝酸25 mL，1%的尿素，1%的玉米粉攪拌均勻，靜置8小時，再加入3%的菌液5 mL，含水量75%，攪拌均勻，28℃培養，從第2天開始取樣至第10天。按1.2.3方法檢測發酵物中孢子量。

1.3 發酵條件正交優化設計

選取發酵條件中影響最大的6個因子：溫度、酸濃度、含水量、接種量、氮源 (選取尿素)、碳源(選取玉米粉)，通過正交試驗進一步優化培養基的發酵條件。選用6因素5水平的L25(56) 正交表進行試驗，正交試驗因素及水平見表1，共安排25個試驗組，每個試驗組3次重復。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.4 盆栽試驗設計及測定方法

試驗分2季，第1季于2016年4～6月，收獲后，盆栽用土暴曬3天，混合均勻，重新裝盆；第2季于2016 年7～9月在江蘇宜興中宜生物肥料工程中心溫室內進行。試驗設5個處理：1) 不施肥(CK)； 2) 尿素 0.814 g/缽，過磷酸鈣 1.486 g/缽，硫酸鉀 0.935 g/缽 (化肥 CCK)；3) 豬糞有機肥 (干重)40 g/缽，氮磷鉀養分施用量與化肥處理相等 (有機肥OCK)；4) 化肥+木霉發酵物 (干重) 4 g/缽 (CT)；5)豬糞有機肥 (干重) 40 g/缽+木霉發酵物 (干重) 4 g/缽(OT)。每個處理6次重復。每缽裝土3 kg。肥料與土壤攪拌均勻后分別裝入盆缽，將長勢均勻的兩葉一心的健康黃瓜苗移植到盆缽里面。溫室內按日常栽培方法管理。培養至1個月后，按常規方法測定各處理的株高、葉面積及地上部干重。葉面積選取每株黃瓜苗由下至上按葉片順序同一位置 (第6片葉)，測量其長度和寬度，計算面積 (長 × 寬)。

真菌群落及木霉菌計數：土壤中真菌總數和木霉菌數的測定采用平板稀釋涂布計數法，稱取根際土5 g溶于45 mL無菌水中，振蕩30 min保證土樣與無菌水混合均勻后進行梯度稀釋，總真菌稀釋涂布于馬丁氏培養基平板上，28℃培養平板計數。木霉菌稀釋涂布于木霉選擇性培養基[22]：馬丁氏培養基用前加入1%氯霉素25 mL/L、3%鏈霉素3 mL/L、五氯硝基苯0.2 g/L、曲拉通1 mL/L、霜霉威1.2 mL/L。

1.5 數據分析

采用Origin8.5和SPSS軟件進行數據統計分析并作圖，使用最小顯著差異法 (Least significant difference,LSD) 檢驗進行多重比較 (P＜ 0. 05)。

2 結果與分析

2.1 固體發酵培養方式

為找到適合木霉菌大量培養的發酵方式，本研究對三角瓶法、袋裝法和淺盤法三種培養方式進行對比。結果表明，使用袋裝法和淺盤法的孢子產量比三角瓶法高 1 倍，其中使用淺盤平板法所產生的孢子最多，可達到 1.06 × 108個/g (圖1)。

2.2 固體發酵單因素條件優化

2.2.1 培養溫度 溫度對微生物生長及固體發酵產生很大的影響，不同的發酵溫度對木霉產孢的影響不同。表2 表明，在 28℃時孢子產量最高，達到 1.34 ×108個/g，其中溫度低于 28℃時，木霉的產孢量要大于30℃及 32℃，因此 28℃左右是木霉固體發酵的最佳產孢溫度。在接種木霉后的前 3 天，當溫度在30℃及 32℃時，可能是由于培養基上的菌絲生長受到高溫抑制，因而后期的孢子產量較低；在 24℃和26℃時，菌絲生長速度減緩，直接影響到孢子的形成。

2.2.2 酸濃度 前期預備試驗及查閱文獻發現，pH值對基質產孢量的影響較大。研究采用硝酸溶液調節固體基質的pH，基質的pH對產孢量的影響差異顯著。直接在固體秸稈物質中調節酸度，容易出現固體基質pH調節不穩定，木霉不能進行有效的生長，因此本實驗通過加入不同濃度梯度的酸液對固體基質進行調節，以期達到調節均一穩定的狀態。采用 0.1 mol/L的硝酸溶液進行調節，固體發酵產物產生的分生孢子產孢量最高，達到 1.24 × 108個/g，與超純水處理相比增加了 2 個數量級。而采用 0.01 mol/L、1 × 10–3mol/L、1 × 10–4mol/L 和 1 × 10–5mol/L 的硝酸溶液處理的產孢量均出現降低的現象 (表2)。

2.2.3 酸種類 pH對微生物的生長有很大影響，本實驗通過添加相同濃度的四種常用酸溶液進行固體基質pH的調節。結果表明，不同的酸類對木霉孢子的產生具有顯著的影響。如表2 所示，四種酸均能調節基質pH，同時提高木霉固體發酵孢子的產量，其中以硝酸作為固體發酵培養基的酸度調節劑時尤為顯著，達到 3.0 × 108個/g。

圖1 哈茨木霉 T-E5 在三種培養方式下的產孢量Fig. 1 Sporulation of Trichoderma harzianum T-E5 in three culture modes

表2 不同固體發酵單因素條件下的產孢量Table 2 Spores produced under different single factor condition in solid state fermentation

2.2.4 含水量 不同含水量對于木霉孢子的產生具有顯著的影響。如表2所示，含水量在70%～80%時木霉孢子產量較高，其中75%含水量時孢子產量達到最高2.74 × 108個/g。含水量在80%時，相比75%含水量木霉孢子產量下降30%左右。而含水量在50%～60%時，由于培養基較干，不適宜木霉菌的生長，產孢量較低。因此在以小麥秸稈作為發酵培養基時，初始含水量在 75%時為最適。

2.2.5 接種量 木霉接種量對固體發酵的產孢量影響較為明顯。在分別加入 1%、3%、5%、7%、9%接種量的孢子懸液培養 8 天后，取樣測定孢子數。表2表明，1%、5%、7%、9%的處理木霉的產孢量顯著(P＜ 0.05) 低于 3% 的處理。接種量過低，木霉在固體基質中的生物量較低；而接種量過高時，菌體之間的養分競爭作用增加也不利于木霉生長。

2.2.6 氮源 添加 1%的不同氮源對木霉孢子的產量有顯著性的影響(表2)。以尿素作為外加氮源時，木霉孢子產量最高，可達到 1.17 × 109個/g。以蛋白胨和酵母粉作為氮源時孢子產量分別為 6.46 × 108個/g和 7.41 × 108個/g，兩者差異顯著。而以磷酸銨、硝酸鉀、硫酸銨作為外加氮源時孢子產量較低，相比尿素處理，磷酸銨處理產孢量下降 62.87%；硝酸鉀處理下降71.56%；而硫酸銨處理產孢量下降了 2 個數量級，這與酸種類實驗中使用硫酸處理產孢量較低的趨勢相似，可能與硫能夠抑制微生物生長作用相關。

2.2.7 碳源 試驗選取玉米粉等五種碳源作為添加物，旨在增加接入菌液后發酵前期的孢子萌發率及菌絲生長量。考慮到生產成本，故確定其添加量為1%。添加碳源玉米粉、小麥粉、大豆粉、葡萄糖及蔗糖，木霉孢子產量分別是 6.62 × 109、5.26 × 109、4.67 × 109、4.69 × 109、4.37 × 109個/g。添加碳源均能提高產孢量，其中以玉米粉處理的木霉孢子產量增加最高。

2.3 發酵時間

為確定發酵時間對木霉孢子生長的影響，從接種后的第 24 h開始取樣，作為發酵取樣的第 1天，之后連續取樣 10 天。圖2結果表明，哈茨木霉在固體發酵培養基上，1～3 d產孢量較低；4～8 d產孢量大幅度增加；第 8 d達到最大值 5.11 × 109個/g。故確定哈茨木霉T-E5 的最佳發酵時間為 8 天。以上述單因素發酵條件為基礎，淺盤發酵8天，最終木霉菌孢子產量可達 8.87 × 109個/g。

圖2 哈茨木霉 T-E5 在 10 天內孢子產量趨勢Fig. 2 Trichoderma harzianum T-E5 spore yield trends in 10 days

2.4 發酵條件的正交優化結果

為了優化發酵條件，進行了六因素五水平L25(56)的正交試驗，選擇溫度、酸濃度、含水量、接種量、尿素及玉米粉加入量作為 6 個因素。結果 (表3) 表明，試驗 19 得到的發酵條件下基質的平均產孢量最高達到 1.10 × 1010個/g，故選擇發酵條件為：添加硝酸濃度為 0.05 mol/L、含水量 70%、尿素 1% 、不添加玉米粉、接種量為 9%、30℃ 下培養 8 天。

優化后的發酵培養基配方為每 10 g小麥秸稈，加入濃度為0.05 mol/L的硝酸18.3 mL調節基質酸度值，接種9%的菌液5 mL，含水量70%(濕基)，添加尿素的量為1%，30℃淺盤培養8天。

2.5 木霉發酵物對黃瓜生長的影響

2.5.1 干重 兩季盆栽結果 (表4)顯示，OT處理效果最好，CT和OCK次之，CK最差。可見，木霉秸稈發酵物配施肥料比單施肥料對黃瓜的干物量積累更具有積極的促進作用。第一季的CT處理比CCK處理的干重增加 14.97%，OT比OCK增加10.62%；第二季的CT處理的干重比CCK增加12.83%，OT比OCK增加 5.96%。

2.5.2 株高 OT處理的黃瓜植株明顯高于其他四個處理 (表4)。與有機肥處理相比較，化肥處理的黃瓜株高較低。兩季盆栽CT處理比CCK處理株高分別增加 16.75% 和 11.49%，OT處理比OCK處理分別增加 26.06% 和 34.29%。其中第一季OT處理的株高明顯高于CT處理。說明木霉發酵物配施有機肥能明顯促進黃瓜植株的株高。

2.5.3 葉面積 第1季和第2季盆栽的葉面積，CT處理比CCK處理分別增加14.64% 和 26.93%，OT處理相比OCK處理分別增加了 9.53% 和 18.01%。

兩季盆栽CCK和OCK處理的葉面積大小無顯著差異且明顯小于CT與OT處理。同時，CT處理的葉面積略高于OT處理。說明木霉秸稈發酵物配施肥料可以明顯促進黃瓜葉片的生長。

表3 發酵條件的正交優化結果Table 3 Orthogonal optimization of the fermentation conditions

表4 不同肥料處理對黃瓜生長指標的影響Table 4 Effects of different fertilizer treatments on cucumber growth

2.6 黃瓜根際總真菌及木霉數量

2.6.1 總真菌數量 從盆栽根際土中總真菌涂布計數結果 (圖3)可知，兩季盆栽CT和OT處理的總真菌數量均顯著高于其他處理，且CT處理顯著高于OT 處理，分別達到 3.17 × 105、2.10 × 105個/g 和 2.31 ×105、1.91 × 105個/g。這表明配施木霉菌的處理能夠增加土壤中總真菌的數量。

2.6.2 木霉菌數量 從黃瓜根際土木霉菌涂布計數結果 (圖4)可知，兩季盆栽CT和OT處理的木霉菌數量均顯著高于其他處理。其中第一季盆栽木霉菌數CT處理顯著高于OT處理，分別為1.88 × 104和 1.23 ×104個/g；而第二季盆栽中OT處理高于CT處理，分別為 1.37 × 104和 1.25 × 104個/g。添加木霉發酵物的肥料處理中，涂布得出的木霉菌數量要比未添加處理高 1 個數量級。結果表明，添加發酵物的處理木霉菌數與總真菌數量相比較，增加趨勢相近，且均能顯著增加土壤中木霉菌的數量。

圖3 不同肥料處理下黃瓜根際土總真菌的數量Fig. 3 Quantity of total fungi in rhizosphere soil of cucumber from different fertilizer treatments

圖4 不同肥料處理下黃瓜根際土木霉菌的數量Fig. 4 The Trichoderma quantity in the rhizosphere soil of cucumber from different fertilizer treatments

3 討論與結論

我國小麥秸稈資源量大，使用秸稈作為發酵基質有利于降低有高附加值的木霉生物有機肥的生產成本。本研究對木霉菌T-E5 固體發酵條件進行了分析與優化。三種培養方式比較試驗中，平板法即淺盤發酵法的孢子產量明顯高于三角瓶法和袋裝法，且采用淺盤法進行發酵有利于工廠化的擴大培養[23]。前期預備試驗發現，在不同pH值培養基下，產孢量變化幅度較大。由于直接以秸稈即培養基質自身的pH值來衡量酸度對木霉菌發酵的影響，易出現基質pH值不穩定、不能有效掌控發酵條件、木霉不能良好生長的問題。由此，通過單因子試驗加入不同濃度的稀酸溶液對固體基質進行調節，同時比較硫酸、鹽酸、磷酸和硝酸四種常用酸對產孢量的影響，其中加入 0.1 mol/L硝酸溶液的發酵基質產孢量最大。與類似發酵相比較，調低發酵基質pH值的做法在以往的報道中出現較少。Li等[24]在哈茨木霉菌SH2303 產厚垣孢子的液體發酵優化實驗中，調節液體培養基的初始pH值為 4.17，得到最大產孢量為4.5 × 108個/mL。固體發酵培養基中，水分含量的多少直接影響菌體的生長。含水量低，培養基較干燥，不利于菌株孢子萌發及菌絲的生長；含水量高，自由水太多，培養基較濕潤，影響基質的透氣性，同樣不利于菌株孢子萌發及菌絲的生長。曾慶才等[25]通過單因素試驗獲得當初始含水量為 50% 時，菌株FJAT-9490 產孢量最大，為 3.67 × 109個/g；而張廣志等[26]以玉米秸稈為培養基，基質含水量在 60%～70% 時產孢量達到最高。這或許與所選用的培養基以及培養基的孔隙度不同有關。添加營養成分對木霉孢子產量有所影響。王永東等[27]在哈茨木霉H-13的固體發酵條件優化中添加蔗糖、蛋白胨、硝酸銨等碳源與氮源，產孢量達到 1.0 × 1010個/g。在實際生產發酵過程中，除取樣檢測菌體生長量外，還可通過發酵產物的外觀判斷是否終止發酵過程。綜合分析表明，本研究獲得了以小麥秸稈為發酵基質的哈茨木霉T-E5 的固體發酵生產分生孢子的最佳條件。

木霉能夠對植物的生長產生明顯的影響，可通過對根際微生態環境以及土壤中養分的循環產生直接或間接的影響，微生物的活動直接增加根際養分的有效性、加速循環利用，同時也能促進根系的生長發育，間接影響養分的循環過程及其有效性[28–31]。哈茨木霉SQRT037是一株高效的植物促生菌，可產生類植物激素Harzianolide，能夠顯著增加植株的根系長度和根尖數量[29]，同時其可活化部分土壤難溶養分，包括P、Fe、Zn和Cu[30]。本試驗采用的哈茨木霉T-E5 是SQRT037 經過紫外誘變得到的一株穩定性更強、活性更高的木霉菌。哈茨木霉T-E5 通過促進根系生長和根系分泌物的產生對植株的促生長效應已被驗證[32–33]。木霉菌發酵產物的好壞直接影響其實際應用效果。本研究利用哈茨木霉T-E5 固體發酵物制成的生物有機肥對黃瓜生長具有顯著的促進作用。各生理指標的檢測結果表明，添加有機肥量10% 的固體發酵產物處理黃瓜苗，木霉固體發酵物配施肥料比單施肥料對黃瓜的干物質量、株高和葉面積有顯著促進作用；功能菌有效活菌數是生物有機肥在促進作物生長方面的關鍵因素[34]，根際土總真菌和木霉菌數量結果表明，促生作用是固體發酵物中哈茨木霉T-E5 菌體成分為主發揮的作用，而非固體發酵培養基質所起的作用。本試驗結果為推廣應用木霉生物有機肥提供了初步的理論基礎，今后應在中試和工廠化生產水平進一步研究木霉孢子固體發酵的工藝參數。

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Trichodermaconidia production using wheat straw and growth promoting effect of its bio-organic fertilizer on cucumber

FENG Cheng-long, WANG Xiao-ting, KANG Wen-jing, MENG Xiao-hui, ZHANG Feng-ge, RAN Wei*, SHEN Qi-rong
(College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University/Jiangsu Provincial Key Laboratory for Solid Organic Waste Utilization, Nanjing 210095, China)

【Objectives】Trichodermaspecies are important plant growth promotion fungi in rhizosphere of plants, whereas it is insufficient for using them to produce bio-fertilizers. This study tried to use wheat straw powder as substrate for conidia production ofT. harzianumT-E5 in solid state fermentation (SSF), aimed to optimize process conditions of the fermentation as well as to check the plant growth promoting effect of the ferment produce as a bio-organic fertilizer on cucumber in greenhouse.【Methods】In laboratory conditions,wheat straw was used as solid fermentation substrate, and numbers of conidia spores were compared under aseries of single factors, including different fermenting containers, temperatures, acid concentration, acid species,amounts of inoculum, moisture contents, and forms of exogenous carbon and nitrogen resources. An orthogonal experiment was then designed to optimize fermentation conditions of temperature, acid concentration, water content, inoculation amount, and external nitrogen and carbon sources. In addition, two seasons of greenhouse pot experiments were conducted with five fertilization treatments, including chemical fertilizer, organic fertilizer,ferment product and its combinations with the chemical fertilizer or the organic fertilizer. The above ground biomass, plant heights and leaf areas of cucumber were measured, The number of total fungi andTrichodermaspecies in the rhizosphere soil of cucumber were counted using the diluted spread plate.【Results】The solid state fermentation of T-E5 in tray with wheat straw powder was suitable for production of conidial spores. The wheat straw powder was prepared by inoculation with 3% (v/w) of 1 × 107spores/mL T-E5 spore suspension prior to acidification with nitric acid solution (0.1 mol/L) and then water was added to reach an initial moisture content of 75%. Under those conditions, fermentation with addition of exogenous urea and corn powder at 28℃ for 8 days yielded the maximum number of T-E5 conidial spores of 8.87 × 109spores/g. By the orthogonal optimization,when 18.3 mL 0.05 mol/L of nitric acid, 9% (v/w) inoculation amount, and 1% (w/w) of urea were added to every 10 g of wheat straw with 70% (wet basis) of water content, at 30℃ shallow dish and fermented for 8 days, the amount ofTrichodermaconidia reached to 1.1 × 1010spores/g. The results of the first season pot experiment showed that the treatment of ferment product with chemical fertilizers (CT) increased cucumber above ground biomass, plant height and leave area by 14.97%, 16.75% and 14.64%, respectively, compared with the treatment of chemical fertilizers (CCK). Compared with the treatment of the organic fertilizer (OCK), the treatment of ferment product with the organic fertilizer (OT) increased the above ground biomass, plant height and leave area by 10.62%, 26.06% and 9.53%, respectively. The results of the second season pot experiment showed similar promoting effects, i.e. compared with CCK, CT increased the above items by 12.83%, 11.49% and 26.93%respectively, and compared with OCK, OT increased above items by 5.96%, 34.29% and 18.01%, respectively.Compared with CCK, OCK and CK, the CT and OT treatments increased the numbers of total fungi andTrichodermaspecies in the rhizosphere soil of cucumber by more than one order of magnitude.【Conclusions】The bio-agent and bio-organic fertilizer with high content ofT. harzianumconidial spores can be produced using wheat straw as main substrates in SSF process. This suggests it is feasible that using agricultural wastes with SSF process to produce high value addedTrichodermabio-agent and its bio-organic fertilizers. But the amount of spores is largely dependent on the fermentation conditions, and the technological parameters of SSF for producingTrichodermaspores in the pilot and factory levels need to be further studied.

T-E5Trichoderma; wheat straw; solid state fermentation; bio-organic fertilizer; cucumber

2017–03–23 接受日期：2017–06–02

“十二五”農村領域國家科技計劃課題（2013BAD08B04-7）資助。

馮程龍 （1993—），男，河南扶溝人，碩士研究生，主要從事生物有機肥方面的研究。E-mail：fchengl@sina.com

* 通信作者 Tel：025-84395210；E-mail：ranwei@njau.edu.cn