鉤狀木霉 ACCC31649的GFP 標記及其對辣椒定殖和促生作用

趙興麗，陶 剛，趙玳琳，卯婷婷，王 廿，顧金剛

（1 貴州師范大學生命科學學院，貴陽 550000；2 貴州省植物保護研究所，貴陽 550006；3 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081）

鉤狀木霉 ACCC31649的GFP 標記及其對辣椒定殖和促生作用

趙興麗1，陶 剛2*，趙玳琳2，卯婷婷2，王 廿2，顧金剛3*

（1 貴州師范大學生命科學學院，貴陽 550000；2 貴州省植物保護研究所，貴陽 550006；3 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081）

【目的】旨在建立農桿菌介導的綠色熒光蛋白 (GFP) 基因轉化鉤狀木霉 (Trichoderma hamatum) ACCC 31649的技術方法，篩選遺傳穩定的GFP標記轉化子，并研究該菌株在辣椒植株中定殖和對辣椒的促生作用，為進一步闡明木霉在辣椒根際定殖及其與辣椒病原菌在辣椒根際和植株中的定殖、互作和生防作用奠定基礎。【方法】通過根癌農桿菌介導的遺傳轉化方法篩選遺傳穩定的GFP標記轉化子，通過灌根接種方法和組織切片的水玻片熒光觀察研究了鉤狀木霉在辣椒植株中定殖過程和對辣椒的促生作用。【結果】獲得了遺傳穩定GFP標記的鉤狀木霉轉化子。熒光顯微觀察表明，辣椒根、莖、葉組織中都檢測到GFP標記菌株的定殖。標記菌株首先在根部定殖，然后通過根部維管束逐步定殖到莖和葉片組織中。野生型菌株和GFP標記菌株灌根接種4葉期辣椒幼苗，30天后，GFP標記菌株與水處理對照相比，辣椒的株高增長13.5%，根長增長16.2%，鮮重和干重分別增加了43.8%和45.3%，而且野生型菌株與GFP標記菌株對辣椒的促生作用沒有顯著差異。【結論】鉤狀木霉能夠在辣椒植株根、莖和葉組織中定殖，并且對辣椒具有顯著的促生作用。同時，GFP標記的鉤狀木霉將在進一步闡明該菌株在辣椒根際定殖及其對病原菌拮抗和互作研究中發揮重要作用。

綠色熒光蛋白；遺傳轉化；鉤狀木霉；辣椒；促生作用；定殖

木霉菌（Trichodermaspp）是自然界廣泛分布的具有較高生防應用價值的真菌類群。木霉菌對許多作物具有較好的防病效果，2014年尹大川等研究表明，綠木霉 (Trichoderma virens) 對樟子松 (Pinus sylvestris) 的枯梢病 (Sphaeropsis sapinea)、楊樹(PopulusL.) 的爛皮病 (Cytospora chrysosperma) 以及由立枯絲核菌 (Rhizoctonia solani) 和尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) 引起的苗木立枯病具有較好的防治效果[1]；長枝木霉 (Trichoderma longibrachiatum)對黃瓜枯萎病[Fusarium oxysporum(Schl.)f.sp cucumerinumOwen][2]、綠色木霉 (Trichoderma viride)對香蕉枯萎病 (Fusarium oxysporumf.sp.cubense, Foc)等都具有明顯的防治作用[3]。木霉也能夠促進植物的生長。哈茨木霉 (Trichoderma harzianum) 能夠促進茄子 (Solanum melongena) 幼苗[4]、辣椒 (Capsicum annum)[5]和番茄 (Lycopersicon esculentum)[6]等植物生長，深綠木霉 (Trichoderma aureoviride) 對白三葉草(Trifolium rephens) 等具有明顯的促生作用[7]。目前的研究結果表明，木霉可能的促生機制包括：1) 木霉可產生植物生長調節劑，對外源植物激素起到雙向調節的作用[8–10]；2) 木霉能抑制或降低植物根際周圍的有害菌群產生的有利于自身生長但對植物生長有抑制作用的化合物[11–12]；3) 木霉能夠產生有機酸、螯合劑、還原酶等，增加植物對養分的利用率從而促進植物的生長[13–14]。

近年來，農桿菌介導的遺傳轉化方法 (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT) 被廣泛用于真菌的菌種改良、基因功能鑒定和基因標記與克隆等研究[15]，它具有轉化效率高[16]，轉化受體廣泛（如孢子、菌絲、子實體等真菌組織可作為轉化受體[17]），T-DNA單拷貝隨機插入，能夠形成遺傳穩定的轉化子等特點[18–19]。由于不需要對樣品進行復雜處理，通過綠色熒光蛋白 (GFP) 標記的菌株在活細胞狀態下即可以進行實時觀察，使其在植物與微生物相互作用的研究中得到廣泛的應用，例如Luc等[20]利用GFP標記，觀察發現一種內生細菌在水稻的根系表面和莖組織細胞等部位定殖；Nicole等[21]分別利用紅色熒光蛋白 (RFP) 和GFP標記研究了叢枝菌根真菌 (AMF)Glomus intraradices在植物根組織中的定殖。

鉤狀木霉 (Trichoderma hamatum) ACCC31649是一株具有生防潛力的優良專利菌株 (專利號：ZL2013 10023319.1)，前期研究表明該菌株具有顯著促進黃瓜生長的特性。其它研究也表明鉤狀木霉能夠產生內切幾丁質酶從而有效地抑制辣椒白絹病 (Sclerotium rolfsiiSacc.)[22]，木霉菌（Trichoderma parareeseiT6）莽草酸途徑影響木霉菌對植物抗性的誘導和植物耐鹽性[23]。本研究選擇GFP基因作為標記基因，利用ATMT方法建立鉤狀木霉的遺傳轉化體系，獲得穩定遺傳的GFP標記轉化子，并研究野生型和GFP標記的鉤狀木霉在宿主組織中的侵染和定殖過程及對辣椒的促生作用，為進一步研究鉤狀木霉在辣椒根際土壤的存活、定殖及其與病原菌的互作提供重要的技術和手段。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與根癌農桿菌質粒

供試鉤狀木霉菌株 (T. hamatum'ACCC 31649) 由中國農業科學院農業微生物菌種保藏中心提供。根癌農桿菌GFP基因表達載體質粒EGFP-PSK2251[18]由美國賓夕法尼亞州立大學 (The Pennsylvania State University) Kang教授實驗室構建，并同意授權中國科學院微生物所真菌學國家重點實驗室劉杏忠研究員惠贈。

1.2 GFP基因的轉化

根癌農桿菌介導 (ATMT) 遺傳轉化方法參照Mullinset al.的ATMT介導的GFP轉化方法進行[18]。

1.2.1 鉤狀木霉對潮霉素B敏感性測試 潮霉素B濃度梯度分別為15、25、50、75和100 μg/mL，不加潮霉素B的培養平板為對照處理，每個處理設5個重復，28℃暗培養，6 d后，觀察記錄結果，確定潮霉素B對野生菌株的合適敏感濃度。

1.2.2 鉤狀木霉細胞核數觀察 熒光染料及配制：1）熒光染料1制備 稱取DAPI (4′, 6-diamidine -2-phenylindole dihydrochloride, Roche)，用適量無菌超純水溶解調整濃度為50 μg/mL制備的母液，于–620℃下保存備用。使用時用無菌水稀釋成1 μg/mL的染色液[24]；2）熒光染料2制備 將1 g/L的熒光增白劑溶液卡氏白 (Calcoflour white，Sigma) 用無菌水稀釋至終濃度為1 μg/mL使用[25]；FAA固定液(100 mL)為50%乙醇90 mL、醋酸5 mL、甲醛5 mL。

樣品的熒光染色處理：染色方法參照并改進胡曉棣等的DAPI和Calcoflour white雙重染色的方法[26]。將一蓋玻片放于載玻片上，在蓋玻片中央滴加一滴孢子懸液，微波爐加熱30 sec (LG燒烤型WD800(MG-5520M) 800 W)，于超凈臺風干，再水洗2次，加FAA固定液 (或將待觀察材料直接浸入FAA固定液中) 固定1～2 h，50%乙醇沖洗2次，加100 μL DAPI染色液 (1 μg/mL)，室溫黑暗放置30 min，加100 μL Calcoflour white 染色液 (1 μg/mL)，室溫黑暗放置10 min，水沖洗2～3次。最后將蓋玻片的觀察材料的一面加微量水并避免氣泡，反轉倒置于載玻片上，指甲油封片。選擇340～488 nm波長激發光與發射光進行熒光顯微觀察。

1.2.3 GFP基因的遺傳轉化 菌株ACCC31649孢子液制備：轉接木霉菌株于PDA平板，28℃培養6天左右，用適量無菌水洗培養平板，經4層滅菌擦鏡紙過濾掉菌絲，取2 mL用于血球計數板計算孢子數目，將孢子懸液濃度調到107spores/mL。

根癌農桿菌菌株的活化和誘導培養：從–80℃取出，凍融，在50 ng/mL卡那霉素的YEB培養平板上劃線，28℃暗培養2天，挑取單菌落接種于1 mL的MM液體培養基中，同時加入2 μL的25 μg/mL卡那霉素，28℃暗培養2天，取100 μL活化的農桿菌液于900 μL的誘導培養液 (IM) 中，同時加入2 μL的卡那霉素 (50 μg/mL) 和 4 μL 的 0.1 mol/L 乙酰丁香酮 (AS)，28℃，140 r/min，黑暗條件下搖菌10 h，使農桿菌菌液OD600達到0.6左右。

MM培養液、IM誘導液及共生培養基配方及配制參照王梅娟等方法[27]進行。

根癌農桿菌與真菌共培養及遺傳轉化：取100 μL的農桿菌菌液和100 μL的孢子液均勻混合，涂布于共生培養平板[18]上，25℃，黑暗條件下培養60 h后，將共培養物用2 mL無菌水洗滌，取200 μL過濾液涂布于含有潮霉素B (50 μg/mL)、噻孢霉素 (30 μg/mL)和利福平 (50 μg/mL) 的PDA平板上，風干后覆蓋一層相同抗生素的PDA培養基[28]。每天觀察檢查，待平板上出現菌落時鏡檢，挑取有熒光的轉化子于潮霉素B (50 μg/mL) PDA平板上培養。

1.2.4 遺傳穩定轉化子的篩選和PCR驗證 將挑取的轉化子在潮霉素B (50 μg/mL) PDA平板連續轉接5代，再接種于不含潮霉素B的PDA平板上，培養5天左右 (長滿平板并產孢) 進行單孢分離。體視鏡視野下，用酒精燈灼燒的注射器針頭挑取菌落菌絲于1mL滅菌水的1.5 mL EP管中，充分混勻，以挑取次數設置孢子濃度梯度，一般設挑一次和兩次的兩個梯度。再用滅菌的膠頭滴管吸取孢子懸液滴于皿底劃有網格線并加有鏈霉素 (50 μg/mL) 的2%的水瓊脂培養基 (WA，2 g瓊脂粉，100 mL蒸餾水) 平板上，室溫靜置培養15 h，在體視鏡下，用注射器針頭將視野中萌發的單個孢子挑取接種到潮霉素B(50 μg/mL) 的PDA平板，28℃，黑暗培養1～2天，鏡檢，保留強熒光的轉化子，再重復4次上述單孢分離過程，篩選得到遺傳穩定的GFP標記轉化子。篩選保留10個遺傳穩定的轉化子。

將野生型菌株和轉化子接種PDA平板上培養一周左右，刮取菌絲提取基因組DNA，以基因組DNA為模板和特異性引物Hmbf1 (5′-CTGTCGA GAAGTTTCTGATCG-3′) 和 Hmbr1 (5′-CTGAT AGAGTTGGTCAAGACC-3′) 擴增潮霉素標記基因片段進行驗證[29]。擴增反應條件為95℃預變性3 min，95℃ 30 s，62℃ 45 s，72℃ 60 s，進行 35 個循環，72℃ 10 min。

1.2.5 鉤狀木霉的生物學特性觀察測定 菌落及菌絲和孢子形態：在PDA平板上活化培養鉤狀木霉野生型菌株ACCC31649及10個篩選的穩定轉化子，用打孔器取菌落邊緣生長的菌絲塊，接種于90 mm PDA平板中央，以野生型菌株ACCC31649為對照，28℃黑暗培養6天左右，記錄其菌落形態，并制片，通過光學顯微鏡觀察形態學特征。

生長速率測定：以鉤狀木霉野生型菌株ACCC 31649為對照處理，選擇穩定轉化子ACCC31649-GF21測定菌落的生長速率，每個處理5個重復，28℃，黑暗培養，采用十字交叉法測量菌落直徑。

生物量的測定：參照陳美娟[30]的方法進行。以鉤狀木霉野生型菌株ACCC31649為對照處理，每個處理5次重復。在PDA平板 (Ф = 90 mm) 上鋪一層滅菌的玻璃紙，將活化的菌株接種菌絲塊 (Ф = 5 mm)于玻璃紙中央，28℃，培養7 d，從玻璃紙上去除接種的菌絲塊，刮取培養物，于電子天平上稱量菌絲鮮重，然后在60℃烘箱中烘烤6 h，徹底去除水分，測量干重。

產孢量的測定：以鉤狀木霉野生型菌株ACCC 31649為對照處理。將菌絲塊接種到PDA平板上，28℃黑暗培養7 d，先加入3 mL滅菌蒸餾水，用滅菌涂布棒輕輕刮取培養基表面的菌絲，經4層擦鏡紙過濾，再用1 mL滅菌蒸餾水沖洗過濾紙，收集分生孢子，用血球計數板測量分生孢子液濃度，每個處理5次重復。

1.3 野生型菌株與GFP標記菌株對辣椒促生作用

挑選子粒飽滿、大小均勻的辣椒種子 (中椒6號，中國農業科學院蔬菜花卉研究所選育)，表面消毒 (3%NaClO，1 min；75%酒精，1 min)。將消毒后的種子均勻平鋪在鋪有滅菌紗布的保鮮盒中，覆蓋一層滅菌紗布，加入適量 (紗布濕潤即可) 的無菌水，密封、28℃黑暗下催芽。待種子冒白芽后播種于裝有滅菌營養土的育苗缽中，長至四葉一心時進行木霉灌根接種處理。

將野生菌株ACCC31649于PDA平板上培養6 d左右，加無菌水制成分生孢子懸浮液，血球計數板計數調整濃度為1 × 107spores/mL。取2 mL分生孢子液于120 mL PDB三角瓶中，28℃，150 r/min搖瓶培養6天，4層滅菌濾紙過濾，制備濃度為1 × 107spores/mL孢子液。每株辣椒幼苗接種15 mL孢子液于根圍，以無菌水為對照處理，每個處理設16個重復，于26℃、14 h光照/10 h黑暗交替培養30 d，測量辣椒根長、株高、鮮重、干重。計算菌株對辣椒幼苗的促生率[31]：

1.4 GFP標記菌株在辣椒組織中的定殖

按照1.3的方法在辣椒幼苗根圍接種GFP標記菌株ACCC31649-GF21，26℃，14 h光照/10 h黑暗交替培養，每隔24 h取辣椒根、莖和葉，徒手切片，制成水玻片，熒光顯微鏡下觀察菌株在辣椒各組織中的定殖情況。

1.5 數據統計與分析

數據采用DPS 7.05軟件進行方差分析，并用LSD法比較各處理間的差異顯著性 (P=0.05) 。

2 結果與分析

2.1 鉤狀木霉的遺傳轉化

2.1.1 鉤狀木霉 ACCC31649對潮霉素B的敏感性鉤狀木霉ACCC31649在不同濃度的潮霉素平板，28℃培養4 d。當潮霉素B濃度在50 μg/mL及以上時(圖1)，ACCC31649菌絲不能生長。因此，本研究采用50 μg/mL的潮霉素B作為篩選轉化子的適宜濃度。

圖1 不同潮霉素B濃度 (μg/mL) 對鉤狀木霉ACCC 31649的生長抑制Fig. 1 Inhibition of different concentrations of hygromycin B (μg/mL) on mycelium growth of T. hamatum ACCC31649

2.1.2 細胞核染色及觀察 通過DAPI染色液和Calcoflour white染色液對鉤狀木霉細胞核進行組合染色后，在345～488 nm發射波長范圍進行熒光顯微觀察，由圖2可清楚觀察到鉤狀木霉分生孢子為單核細胞。

2.1.3 鉤狀木霉轉化子的篩選 將選擇性培養基上長出的單孢菌落挑出接種于含潮霉素B (50 μg/mL) 的PDA培養基上，5天后熒光檢測并挑取邊緣菌絲接種于含潮霉素B的PDA培養基上，這樣重復操作5次初步得到GFP標記的轉化子。從上述轉化子中挑選出10個具有強綠色熒光的轉化子，每一個轉化子分別進行5代的單孢分離培養，最終保留10個能夠穩定遺傳的GFP標記轉化子 (圖3)。

轉化子PCR驗證：分別選取2個GFP標記轉化子和野生型菌株的基因組DNA做為模板，特異性引物Hmbf1和Hmbr1擴增潮霉素標記基因片段進行驗證。擴增產物凝膠電泳結果，其條帶在750 bp左右(圖4)，與預期目標片段大小一致。

2.2 野生型和轉化子的菌落、菌絲和孢子的形態特征

野生型鉤狀木霉ACCC31649菌落多為基內菌絲，少量氣生菌絲，且氣生菌絲呈卷毛狀，白色至灰色，分生孢子產生于致密的墊狀或者半球形的產孢簇中，產孢簇表面呈絨毛狀，初期為白色，漸變為暗綠色，背面暗灰色；ACCC 31649-GF21菌落基內菌絲發達，白色至黃綠色，背面無色至灰色。野生型與GFP標記GF21菌株形態特征相比較，兩者菌落邊緣規則整齊，菌絲直徑1～7 μm，分生孢子都為橢圓形，大小 (3.9～5.6) μm × (2.8～4.0) μm，尖端闊圓形，基部變細或者稍微呈尖形；氣生菌絲上稀疏地產生分生孢子梗，在分生孢子梗尖端下部產生1～2個輪生瓶梗，瓶梗從基部向上至頂尖逐漸縊縮，中間部位有時候稍微膨大 (圖5)。

圖2 ACCC31649-GF21在辣椒植株中的定殖Fig. 2 Colonization of the ACCC31649-GF21 in the pepper plants

圖3 鉤狀木霉ACCC31649-GF21的GFP熒光蛋白表達(標尺 25 μm)Fig. 3 Expression of GFP fluorescent proteins in T. hamatum ACCC31649-GF21 (bar 25 μm)

圖4 鉤狀木霉ACCC31649-GF21的潮霉素標記基因PCR檢測Fig. 4 PCR detection of Hyg B gene of T. hamatum ACCC31649-GF21

2.3 野生型與轉化子菌落生長速度及生物量測定

通過對標記前后菌株的培養特征進行顯微觀察和測定，在菌絲大小、產孢結構及孢子形態等方面，轉化子與野生型無明顯差異，而在相同培養條件下，GFP標記菌株ACCC 31649-GF21菌落的生長速率比野生型變慢了，而ACCC31649-GF21產孢量與野生型相比卻增加了，但在菌落的鮮重和干重等生物量方面，ACCC31649-GF21與野生型菌株基本一致 (表1)。

2.4 ACCC31649-GF21在辣椒植株中的定殖

通過取樣切片熒光顯微觀察，在接種ACCC 31649-GF21后的24 h，GF21的菌絲和孢子聚集在根表皮 (圖6A、B)；48 h后，GFP標記菌株在主根維管束中生長定殖 (圖6C)；接種3 d，菌絲穿透皮層細胞在主根韌皮部定殖 (圖6D)，同時在辣椒的莖部木質部 (圖6E) 也觀察到菌株的定殖；接種5 d，定殖至莖表皮 (圖6F) 和根莖連接處 (圖6G) 及莖部氣孔(圖6H)；25 d后，菌絲到達辣椒植株的第一片真葉的葉柄 (圖6I、J) 和葉片 (圖6M、L) 組織中。從30天到70天后，辣椒組織中仍然可以觀察到綠色熒光菌絲。上述結果表明，通過灌根接種，標記的鉤狀木霉菌株能夠從辣椒根部維管束自下向上定殖，首先在辣椒幼苗的側根周圍富集、吸附，后侵入側根表層，進入維管束和韌皮部，沿維管束向上經主根、根莖交界、莖和葉定殖生長，但最后都未能夠定殖到辣椒植株的頂端。

圖5 鉤狀木霉ACCC31649與ACCC31649-GF21的形態特征Fig. 5 The morphology of T. hamatum ACCC31649 and T. hamatum ACCC31649-GF21

表1 鉤狀木霉野生菌株和轉化子生長速率、產孢量及生物量的比較Table 1 Comparison of growth rate, biomass and conidiation of T. hamatum ACCC31649 and T. hamatum ACCC31649-GF21

2.5 野生型菌株與轉化子對辣椒的促生作用

接種鉤狀木霉30天后，辣椒幼苗的株高、根長及植株的干重和鮮重等數據統計結果表明，經野生型菌株處理后，辣椒的株高比對照增加15.9%，根長增加19.4%，鮮重增加36.3%，干重增加43.4%，野生型菌株對辣椒幼苗具有顯著的促生作用；而經轉化子GF21處理的辣椒幼苗，辣椒的株高比對照增加13.5%，根長增加16.2%，鮮重增加43.8%，干重增加45.3%，轉化子同樣表現出顯著的促生作用(圖7、表2)。上述結果表明，轉化子GF21和野生型菌株都能夠明顯促進辣椒幼苗的生長。

3 討論

目前，植物病害生物防治中應用較多的生防真菌主要有木霉菌[32]、芽孢桿菌[33–34]、叢枝菌根真菌[35–36]、毛殼菌[37]等。研究已經證明木霉菌能夠通過溶菌、重寄生、競爭營養和空間來抑制病原真菌[38–39]，同時還能夠促進植物生長[40–41]，從而增強植物的抗逆能力。本研究以GFP基因作為標記基因，利用ATMT方法建立了GFP基因的鉤狀木霉ACCC31649遺傳轉化體系。近年的研究表明，單核真菌通過ATMT介導的遺傳轉化子具有很高的遺傳穩定性[42–43]，因此，本研究通過DAPI對鉤狀木霉ACCC 31649分生孢子的細胞核進行染色，確定了鉤狀木霉ACCC31649清晰的單核細胞結構，經不斷摸索并優化了轉化條件，即當乙酰丁香酮 (AS) 濃度為200 mmol/L，誘導培養10 h，25℃黑暗共培養60 h時成功獲得了穩定遺傳的GFP標記菌株ACCC31649-GF21。轉化子的遺傳穩定性是進行生防菌定殖機理研究的重要條件[44]，故對ACCC 31649-GF21進行擴增潮霉素抗性基因驗證及真菌形態檢測，結果表明該基因在轉化子GF21中得到穩定、高效的表達；此外，對ACCC 31649-GF21的生長速率、產孢量和生物量測定結果表明，轉化子GF21的生長速率變慢，但這種現象在其他菌株中也有出現，如車建美等用GFP標記青枯雷爾氏菌 (Ralstonia solanacearum)[45]及劉路寧[46]用GFP標記綠木霉 (Trichoderma virens) 的研究中，也出現了標記菌株生長變慢。但對菌株ACCC31649-GF21檢測分析后發現，GFP標記菌株促生效果與野生型相比沒有顯著性差異。

圖6 ACCC31649-GF21在辣椒植株中的定殖Fig. 6 Colonization of the ACCC31649-GF21 in the pepper plants

通過GFP標記技術能夠實時、動態地研究微生物的空間定位、微生物與環境及宿主之間的互作[47–48]，如武坤毅等利用GFP標記技術成功觀測了溶桿菌(Lysobactersp.) SNNU513在玉米 (Zea mays) 根部定殖規律[49]；李亮亮等利用GFP標記短小芽孢桿菌(Bacillus pumilu) 并觀察到其在馬尾松 (Pinus massonianaLamb) 體內的定殖動態[50]。本研究證明了鉤狀木霉ACCC 31649能夠通過菌絲和孢子在辣椒不同組織中定殖，可通過側根、根毛和根表皮的自然孔口或氣孔侵入辣椒植株根內，經皮層到達根維管束系統，在蒸騰拉力或其它因素 (如礦物質的運輸等) 的作用下由地下根部向莖甚至葉等地上部遷移或擴散[51]。研究還發現，在辣椒植株的莖部維管束中未檢測到ACCC31649-GF21定殖，所以標記菌株是通過莖部木質部進行自下而上的侵染，而不是通過莖部維管束。同時，接種生防鉤狀木霉ACCC31649對辣椒幼苗的株高、根長及生物量等方面具有顯著的促生作用。本文的相關結果為進一步研究生防鉤狀木霉與辣椒病原菌及宿主植物之間的互作和生防作用奠定了重要基礎。

圖7 鉤狀木霉對辣椒幼苗生長的影響Fig. 7 Effects of the T. hamatum on the growth of the pepper seedlings

表2 鉤狀木霉對辣椒幼苗生長的影響Table 2 Effects of the T. hamatum on the growth of the pepper seedlings

致謝：本文在顯微照相方面得到貴州省農業生物技術重點實驗室譚玉梅、朱英兩位老師和貴州省植物保護研究所吳石平老師的幫助和指導，在轉化菌株和質粒方面得到中國科學院微生物所真菌學國家重點實驗室劉杏忠研究員的幫助和指導，特此感謝！

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GFP-labeled transformation ofTrichoderma hamatumACCC31649 and its promotion on colonization and growth of pepper plants

ZHAO Xing-li1, TAO Gang2*, ZHAO Dai-lin2, MAO Ting-ting2, WANG Nian2, GU Jin-gang3*
(1 Guizhou Normal University, Guiyang 550000, China; 2 Guizhou Institute of Plant Protection, Guiyang 550006, China;3 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, CAAS, Beijing 100081, China)

【Objectives】The green fluorescent protein (GFP) gene was transferred intoTrichoderma hamatumACCC31649 by theAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The growth-promoting effect and the colonizing patterns in pepper plants of this strain were investigated in this paper, which would provide a technical basis for the research of the rhizosphere colonization ofT. hamatumin pepper plants and biocontrol mechanism of antagonistic fungus against pathogen.【Methods】TheAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation was used to select the GFP-labeled strainT. hamatum-GF21 which inherited stably, and the inoculation ofT. hamatumby pouring root treatment and the observation of water slides of pepper tissue sections by fluorescence microscopy were used for the growth- promoting effect of pepper plants and its colonizing patterns.【Results】The stable GFP-labeled strainT. hamatum-GF21 was obtained. Fluorescence microscopy observation confirmed that the GFP-labeled strainT. hamatum-GF21 colonized in the roots, stems and leaves of the pepper. It colonized on theroots firstly and then moved to stems and leaves through the vascular bundle of the roots. After 30 days of pouring root treatment in the four-leaf pepper seedlings by the wide strain and the GFP-labeled strainT. hamatum-GF21 separately, the GFP-labeled strainT. hamatum-GF21 increased the pepper height by 13.5%, root length by 16.2%,fresh weight by 43.8% and dry weight by 45.3% respectively, compared with the water control. There is no significant difference between the wide strain and the GFP-labeled strainT. hamatum-GF21 in the effect on the plant growth promoting.【Conclusions】The GFP-labeled strainT. hamatumcan colonize in the roots, stems and leaves of the pepper, and show a significant growth-promoting effect on pepper plants. Therefore, the GFP-labeled strainT. hamatum-GF21 can be used on the research of the rhizosphere colonization in pepper plants and the biocontrol mechanism between pathogen and its antagonistic fungus.

green fluorescent protein; genetic transformation;Trichoderma hamatum; pepper seedling;plant growth-promoting; colonization

2017–03–03 接受日期：2017–03–22 網絡出版日期：2017–06–01

貴州省優秀青年科技人才培養對象專項資金（黔科合人字〔2015〕27號）；貴州省科學技術聯合基金（黔科合LH字〔2015〕7082號）；貴州農科院專項（黔農科院院專項〔2016〕029號）；貴州省農科院自主創新能力項目（黔農科院自主創新科研專項字〔2014〕002〕資助。

趙興麗（1989—），女，貴州六盤水人，碩士研究生，主要從事植物真菌病害生物防治研究。E-mail：18786037305@163.com。 *通信作者 E-mail：ttg729@sina.com; gujingang@caas.cn