HPLC-熒光法測定人血漿中伊立替康及其活性代謝產物的濃度Δ

張曉霈，劉曉明，徐今寧，王愛萍，姜愛雯（1.河北北方學院藥學系，河北張家口075000；.河北北方學院附屬第一醫院藥劑科，河北張家口075000）

·臨床藥學與研究·

HPLC-熒光法測定人血漿中伊立替康及其活性代謝產物的濃度Δ

張曉霈1＊，劉曉明2#，徐今寧2，王愛萍2，姜愛雯2（1.河北北方學院藥學系，河北張家口075000；2.河北北方學院附屬第一醫院藥劑科，河北張家口075000）

目的：建立同時測定人血漿中伊立替康（CPT-11）及其活性代謝產物7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38）濃度的方法。方法：血漿樣品經乙腈沉淀蛋白及鹽酸酸化后，以喜樹堿為內標，采用高效液相色譜-熒光法測定。色譜柱為Waters Luna C18，流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液-乙腈（70∶30，V/V，用磷酸調節pH至4.0），流速為1 mL/min，激發波長為380 nm，發射波長為480 nm（CPT-11）、535 nm（SN-38），柱溫為25，進樣量為20 μL。結果：CPT-11和SN-38血藥濃度分別在200～1 000、5～45 ng/mL范圍內線性關系良好（r分別為0.999 4、0.999 2，n＝5），定量下限分別為200、5 ng/mL；日內、日間RSD為1.68%～5.57%；CPT-11和SN-38的相對回收率分別為90.12%～106.93%（RSD＜8%，n＝5）、92.07%～102.56%（RSD＜6%，n＝5），提取回收率分別為72.23%～86.56%（RSD＜6%，n＝5）、71.98%～83.44%（RSD＜7%，n＝5）。采用該方法測得5例結腸癌患者體內CPT-11和SN-38的血藥濃度分別為431.13～617.19、13.97～31.89 ng/mL（靜脈滴注結束后1 h），398.14～584.43、11.61～29.94 ng/mL（靜脈滴注結束后2 h）。結論：該方法樣品處理簡單、快速，且靈敏度高、重復性好，適用于臨床常規監測CPT-11及其代謝物SN-38的血藥濃度及藥動學研究。

高效液相色譜-熒光法；伊立替康；7-乙基-10-羥基喜樹堿；血藥濃度

伊立替康（Irinotecan，CPT-11）屬于水溶性半合成喜樹堿類衍生物，是DNA拓撲異構酶抑制劑，作用于細胞周期S期，阻止拓撲異構酶對DNA斷鏈的修復，從而抑制細胞分裂[1]。CPT-11作為前體藥物進入人體后，一部分經過羧酸酯酶（Carboxylesterase，CES）轉化為活性代謝物7-乙基-10-羥基喜樹堿（7-ethyl-10-hydroxycamptothecin，SN-38），其活性比CPT-11強100～1 000倍，細胞毒性約為CPT-11的200～2 000倍[2]。

CPT-11現已廣泛應用于結直腸癌、非小細胞肺癌和宮頸癌等實體瘤的臨床治療，在腫瘤化療領域具有廣泛的應用前景[3]。但隨著臨床研究的不斷深入，CPT-11給患者帶來的骨髓抑制、嚴重腹瀉等毒副反應也成為限制其臨床應用的重要因素[4]。相關研究表明，CPT-11及SN-38的血藥濃度與臨床療效、化療所致嚴重不良反應密切相關[5]。因此，建議對使用CPT-11的患者進行血藥濃度監測。目前，測定CPT-11血藥濃度的方法主要包括高效液相色譜（HPLC）法和液-質聯用（LC-MS）法[6-10]。本研究在已有文獻的基礎上，建立了同時測定人血漿中CPT-11及其活性代謝產物SN-38的HPLC-熒光法，并將該方法應用于臨床，為進一步探討CPT-11血藥濃度與其所致不良反應的相關性提供參考。

1 材料

1.1 儀器

100型HPLC儀，包括手動進樣器、G1312A型二元泵、G1316A型柱溫箱、G1321A型熒光檢測器、Chemstation色譜工作站（美國Agilent公司）；H1650-W型臺式低溫高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；MX-S型渦旋混合器（美國Scilogex公司）；BSZ10型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；PHS-3C型酸度計（上海雷磁公司）。

1.2 藥品與試劑

伊立替康對照品（批號：141228，純度：≥99%）、SN-38對照品（批號：150102，純度：98.86%）均購自北京世紀奧科生物技術有限公司；喜樹堿對照品（內標，北京恒元啟天化工研究院，批號：14090401，純度：98.82%）；注射用鹽酸伊立替康[江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H20040711，批號：16221AF，規格：100 mg（按C33H38N4O6·HCl計）]；乙腈為色譜純，磷酸二氫鈉、二甲基亞砜、鹽酸、磷酸等均為分析純，水為純凈水。

1.3 空白血漿

健康人空白血漿由河北北方學院附屬第一醫院（以下簡稱“我院”）血庫提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Luna C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液-乙腈（70∶30，V/V，用磷酸調節pH至4.0）；流速：1 mL/min；熒光激發波長：380 nm；發射波長：480 nm（CPT-11）、535 nm（SN-38）；柱溫：25；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

精密稱取CPT-11、SN-38對照品各適量，用二甲基亞砜溶解并分別定容至10 mL棕色量瓶中，配制成質量濃度均為1.0 mg/mL的標準貯備液。量取上述標準貯備液適量，用0.01 mol/L鹽酸-乙腈混合溶液（2∶3，V/V）作為稀釋劑，分別配制成CPT-11質量濃度為4、6、10、12、14、18、20 μg/mL，SN-38質量濃度為0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、0.9 μg/mL的標準工作液。精密稱取內標對照品適量，用二甲基亞砜溶解并定容，配制成質量濃度為2 μg/mL的內標溶液。以上所有溶液均置于－20冰箱中避光保存，備用。

2.3 血漿樣品的處理

精密吸取空白血漿適量，置于1.5 mL EP管中，加入內標溶液20 μL，渦旋混勻30 s；再加入乙腈200 μL，渦旋混勻1 min；以離心半徑9 cm、轉速13 000 r/min離心3 min。精密吸取上清液200 μL，加入1.0 mol/L鹽酸50 μL酸化，渦旋混勻30 s，精密吸取20 μL，進樣分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 分別取不同來源的空白血漿、空白血漿+CPT-11+SN-38、患者用藥后的血漿樣品各適量，按“2.3”項下方法處理（空白血漿樣品不加內標）后，于“2.1”項色譜條件下進樣分析，記錄色譜圖（見圖1）。結果表明，CPT-11、內標、SN-38的色譜峰峰形對稱，保留時間分別為3.6、4.7、7.1 min，血漿中的內源性物質均不干擾待測物的測定，表明該方法專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1HPLC chromatograms

2.4.2 標準曲線的繪制與定量下限的考察 精密量取空白血漿適量，置于1.5 mL EP管中，加入不同質量濃度的CPT-11和SN-38標準工作液各10 μL，混合搖勻，分別配制成CPT-11質量濃度為200、300、500、600、700、900、1 000 ng/mL，SN-38質量濃度為5、10、20、25、30、40、45 ng/mL的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣測定，記錄色譜圖。以待測物質量濃度（x）為橫坐標、待測物與內標的峰面積比值（y）為縱坐標，采用加權最小二乘法（加權系數w＝1/x2）進行線性回歸，得CPT-11的回歸方程為：y＝0.003x+0.186（r＝0.999 4，n＝5），SN-38的回歸方程為：y＝0.026x+1.122（r＝0.999 2，n＝5）。結果表明，CPT-11、SN-38血藥濃度分別在200～1 000、5～45 ng/mL范圍內線性關系良好。

配制CPT-11、SN-38質量濃度分別為200、5 ng/mL的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，平行測定5次，連續測定5 d。結果顯示，日內、日間RSD均小于15%；實測質量濃度在理論質量濃度的80%～120%內，表明CPT-11、SN-38的定量下限分別為200、5 ng/mL。

2.4.3 精密度試驗 取空白血漿、相應質量濃度的CPT-11和SN-38標準工作液各適量，分別配制成CPT-11低、中、高質量濃度（300、500、800 ng/mL）和SN-38低、中、高質量濃度（10、20、35 ng/mL）的質控樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析。各樣品平行測定5次，連續測定5 d，考察方法的精密度[精密度以RSD（RSD＝實測質量濃度標準偏差/實測質量濃度平均值×100%）表示]。結果顯示，CPT-11的日內RSD為1.68%～3.22%，日間RSD為3.12%～5.57%；SN-38的日內RSD為2.06%～3.48%，日間RSD為1.98%～4.51%，表明精密度良好，詳見表1。

表1 精密度試驗結果（±s，n＝5）Tab 1Results of precision tests（±s，n＝5）

表1 精密度試驗結果（±s，n＝5）Tab 1Results of precision tests（±s，n＝5）

待測物CPT-11 SN-38理論質量濃度，ng/mL 300 500 800 10 20 35日內實測質量程度，ng/mL 291.87±7.16 516.12±16.62 820.97±13.79 9.92±0.34 19.11±0.53 34.09±0.87 RSD，%2.45 3.22 1.68 3.48 2.78 2.06日間實測質量濃度，ng/mL 288.25±13.78 510.58±28.43 816.46±25.47 9.86±0.44 19.37±0.38 34.24±0.79 RSD，%4.78 5.57 3.12 4.51 1.98 2.31

2.4.4 回收率試驗 取空白血漿、相應質量濃度的CPT-11和SN-38標準工作液各適量，分別配制成CPT-11低、中、高質量濃度（300、500、800 ng/mL）和SN-38低、中、高質量濃度（10、20、35 ng/mL）的質控樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析。每個樣品平行測定5次，根據當日標準曲線計算實測質量濃度與理論質量濃度的比值，考察相對回收率；以經提取所得血漿樣品的色譜峰面積與未經提取血漿樣品的色譜峰面積進行比較，考察提取回收率。結果顯示，CPT-11的相對回收率為90.12%～106.93%（RSD＜8%，n＝5），提取回收率為72.23%～86.56%（RSD＜6%，n＝5）；SN-38的相對回收率為92.07%～102.56%（RSD＜6%，n＝5），提取回收率為71.98%～83.44%（RSD＜7%，n＝5），詳見表2。

表2 回收率試驗結果（±s，n＝5）Tab 2Results of recovery tests（±s，n＝5）

表2 回收率試驗結果（±s，n＝5）Tab 2Results of recovery tests（±s，n＝5）

待測物CPT-11 SN-38理論質量濃度，ng/mL 300 500 800 10 20 35相對回收率計算值，%96.08±6.81 102.16±6.67 102.05±3.53 98.60±4.32 96.85±5.05 97.82±3.81 RSD，%7.09 6.52 3.46 4.38 5.22 3.89提取回收率計算值，%79.83±4.09 83.15±4.48 82.22±2.45 74.54±4.20 78.07±5.13 79.79±4.75 RSD，%4.12 5.39 2.98 5.64 6.58 5.97

2.4.5 穩定性試驗 分別配制CPT-11低、中、高質量濃度（300、500、800 ng/mL）和SN-38低、中、高質量濃度（10、20、35 ng/mL）的質控樣品各5份，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，考察各樣品在光照室溫條件下放置8 h、經歷3次凍融（－20～室溫）、－80保存1個月、手動進樣器中存放6 h的穩定性。結果顯示，各樣品在上述條件下穩定性良好，RSD＜10%（n＝5）。

2.5 臨床應用

采用上述HPLC-熒光法測定5例結腸癌患者血漿中CPT-11和SN-38的濃度。其中，男性2例，女性3例；年齡45～53歲；3例患者聯用5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、亞葉酸鈣（Leucovorin，LV）等藥物，2例患者為單藥治療。

所有患者均于90 min內靜脈滴注注射用鹽酸伊立替康，分別于靜脈滴注結束后1、2 h抽取其外周血各2 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，以離心半徑9 cm、轉速3 000 r/min離心10 min，取上層血漿按“2.3”項下方法處理后，進樣分析。結果顯示，靜脈滴注結束后1 h，5例患者體內CPT-11、SN-38的血藥濃度分別為431.13～617.19 ng/mL、13.97～31.89 ng/mL；靜脈滴注結束后2 h，其體內CPT-11、SN-38的血藥濃度分別為398.14～584.43 ng/mL、11.61～29.94 ng/mL，詳見表3。

表3 血藥濃度測定結果Tab 3Determination results of plasma concentration

3 討論

3.1 方法學評價

目前，臨床并尚普及CPT-11及其活性代謝產物SN-38血藥濃度的監測。現有的濃度測定方法主要包括HPLC-紫外法、HPLC-熒光法和LC-MS法[6-10]。其中，質譜分析方法的樣本前處理過程較為復雜，且受儀器成本較高的影響，不利于在臨床上大規模推廣。CPT-11及SN-38的結構式中含有π-π共軛體系，為剛性平面結構，同時含有給電子基（羥基），可以增加熒光效率，滿足熒光物質檢測的要求，選擇性較紫外檢測更好[2，7-9]。故筆者參考上述文獻，在370～430 nm激發波長范圍內每隔5 nm掃描其激發光譜，發現CPT-11、SN-38在380 nm處的熒光激發強度最大，故將兩者的激發波長設定為380 nm；在470～540 nm發射波長范圍內每隔5 nm掃描其發射光譜，發現CPT-11在480 nm、SN-38在535 nm處的熒光發射強度最大，故將其兩者的發射波長依次設定為480、535 nm。

CPT-11具有一個不穩定的內酯環，有pH依賴性，在體內保持內酯與羧酸鹽2種形式的動態平衡：當pH為3.0～5.0時，CPT-11主要以具有活性的內酯形式存在；當pH為7.0時，則CPT-11主要以羧酸鹽形式存在[11]。因此，筆者考察了不同pH流動相對分離度的影響，結果發現，當流動相pH＝3.0時，出現前延峰；當pH＝4.5時，峰形存在拖尾現象；而當用磷酸調節pH至4.0時，在保證完全分離的前提下，各待測物峰形良好，故最終確定流動相的pH為4.0。

前期試驗曾使用甲醇作為蛋白沉淀劑，經處理后，血漿樣品呈渾濁狀，沉淀不完全。使用相同體積的10%高氯酸處理后，空白血漿進樣后響應值變大，干擾明顯，檢測限升高。而使用乙腈作為蛋白沉淀劑不僅回收率較高，而且內源性物質的干擾較小。離心后的血漿樣品經鹽酸酸化后，可保證CPT-11的內酯-羧酸鹽平衡向內酯移動，使測定結果更為準確。

筆者通過優化色譜條件，調節流動相比例和pH，并采用蛋白沉淀法處理血漿樣品，操作簡單、迅速，同時又可消除血漿中內源性物質的干擾，可滿足生物樣本快速批量檢測的需求。臨床上與CPT-11可能合用的藥物包括5-FU、LV等，在臨床應用中并未發現上述兩種藥物對CPT-11、SN-38和內標的檢測有所干擾。該方法在10 min之內即可完成CPT-11和SN-38血藥濃度的檢測，且成本較低，可用于臨床治療藥物監測。值得注意的是，空白血漿在3～4 min處出現色譜峰（見圖1A），雖然響應值很低，但也有可能對測定結果造成一定影響，故該方法仍有待進一步完善。

3.2 臨床應用

目前，臨床上主要依靠尿苷二磷酸葡糖醛酸轉移酶（UGT）1A1基因多態性檢測來指導CPT-11的個體化用藥，從而降低限制性毒副反應的發生。當患者服用高劑量（＞300 mg/m2）的CPT-11時，其不良反應與基因型存在相關性；而服用中、低劑量（＜300 mg/m2）的CPT-11時，其不良反應則與基因型無關[12]。然而，我國人群UGT1A1基因突變的比例僅占10%～12%，且CPT-11的給藥劑量一直處于較低水平，因此僅依靠基因檢測來指導其個體化用藥存在明顯的局限性[13]。相關研究發現，CPT-11所造成的嚴重骨髓抑制與SN-38的峰濃度密切相關，腹瀉的發生率也與SN-38的谷濃度存在相關性[14-15]。但上述研究仍處于初始階段，尚無一致結論。

本研究所建立的血藥濃度監測方法已成功應用于患者。由表3可見，若CPT-11劑量為100～300 mg，CPT-11、SN-38的血藥濃度分別維持在398.14～617.19、11.61～31.89 ng/mL。其中，4號患者的用藥劑量高于3號，但活性代謝產物SN-38的血藥濃度卻明顯低于3號，提示CPT-11的體內代謝可能存在明顯的個體差異。但由于本研究檢測的患者例數較少，監測的樣本量也較小，且均為結腸癌患者，具有一定的局限性，故有待后續研究收集更多的樣本，進一步探討CPT-11血藥濃度與不良反應的相關性，以指導臨床個體化用藥。

綜上所述，該方法樣品處理簡單、快速，方法靈敏度高、重復性好，適用于臨床常規監測CPT-11及其代謝物SN-38的血藥濃度及藥動學研究。

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Concentration Determination of Irinotecan and Its Active Metabolite in Human Plasma by HPLC-FLD

ZHANG Xiaopei1，LIU Xiaoming2，XU Jinning2，WANG Aiping2，JIANG Aiwen2（1.Dept.of Pharmacy，Hebei North University，Hebei Zhangjiakou 075000，China；2.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Hebei North University，Hebei Zhangjiakou 075000，China）

OBJECTIVE：To develop a method for simultaneous determination of irinotecan（CPT-11）and its active metabolite 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin（SN-38）in human plasma.METHODS：After precipitated by acetonitrile and acidified with hydrochloric acid，using camptothecin as internal standard，the plasma sample was determined by HPLC-FLD.The determination was performed on Waters Luna C18column with mobile phase consisted of 0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate-acetonitrile（70∶30，V/V，adjusted pH to 4.0 by phosphoric acid）at flow rate of 1 mL/min.The excitation wavelength was set at 380 nm；the emission wavelengths of CPT-11 and SN-38 were set at 480 nm and 535 nm，respectively.The column temperature was 25and the sample size was 20 μL.RESULTS：The linear ranges were 200-1 000 ng/mL for CPT-11（r＝0.999 4，n＝5）and 5-45 ng/mL for SN-38（r＝0.999 2，n＝5）.RSDs of inter-day and intra-day were 1.68%-5.57%.The relative recoveries of CPT-11 and SN-38 were 90.12%-106.93%（RSD＜8%，n＝5）and 92.07%-102.56%（RSD＜6%，n＝5）；the extraction recoveries of CPT-11 and SN-38 were 72.23%-86.56%（RSD＜6%，n＝5）and 71.98%-83.44%（RSD＜7%，n＝5），respectively.The plasma concentrations of CPT-11 and SN-38 in 5 patients with colon cancer were 431.13-617.19，13.97-31.89 ng/mL（1 h after intravenous dripping）and 398.14-584.43，11.61-29.94 ng/mL（2 h after intravenous dripping）.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，sensitive，reproducible and suitable for the determination of plasma concentration and pharmacokinetic study of CPT-11 and its metabolite SN-38.

HPLC-FLD；Irinotecan；7-ethyl-10-hydroxycamptothecin；Plasma concentration

R969.1

A

1001-0408（2017）29-4072-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.29.11

河北省醫學科學研究重點課題計劃（No.20120157）

＊碩士研究生。研究方向：臨床藥學。電話：0313-8043563。E-mail：2605520609@qq.com

#通信作者：主任藥師，碩士生導師。研究方向：藥理學。電話：0313-8043563。E-mail：lxmyf@hotmail.com

2016-11-23

2017-03-15）

（編輯：張元媛）