氟康唑誘導耐藥的阿薩希毛孢子菌ERG11基因表達研究

丁瀟 夏志寬 張德全 楊蓉婭

100700北京，安徽醫科大學陸軍總醫院臨床學院皮膚科（丁瀟、楊蓉婭）；陸軍總醫院全軍皮膚損傷修復研究所（夏志寬、張德全）

氟康唑誘導耐藥的阿薩希毛孢子菌ERG11基因表達研究

丁瀟 夏志寬 張德全 楊蓉婭

100700北京，安徽醫科大學陸軍總醫院臨床學院皮膚科（丁瀟、楊蓉婭）；陸軍總醫院全軍皮膚損傷修復研究所（夏志寬、張德全）

目的探討ERG11基因在阿薩希毛孢子菌耐藥的作用以及基因表達量與藥物濃度間的關系。方法通過氟康唑體外誘導獲得阿薩希毛孢子菌耐藥菌株，將敏感株與耐藥株同時置于含0～64 μg/ml濃度氟康唑的培養基中培養，用實時PCR檢測ERG11基因的表達情況。結果在無藥情況下，阿薩希毛孢子菌耐藥株組ERG11基因表達（7.542±5.311）高于敏感株組（1.014±0.012），兩組比較t=3.002，P=0.03。在不同濃度氟康唑作用下，耐藥株組ERG11 mRNA水平分別為9.183±3.226，13.657±5.428，15.292±7.007，13.720± 8.550，13.949±2.960，13.123±6.429，亦高于敏感株組3.281±2.068，3.459±1.923，3.242±2.530，3.651±0.728，3.969±1.924，3.824±1.875，均P＜0.05。但ERG11表達量與氟康唑濃度之間差異無相關性（耐藥株rs=0.229，P=0.096；敏感株rs=0.166，P=0.357）。結論阿薩希毛孢子菌ERG11基因過表達與氟康唑耐藥有關。ERG11基因mRNA表達與氟康唑濃度之間無相關性。

氟康唑；抗藥性，真菌；基因表達；阿薩希毛孢子菌；基因，ERG11

阿薩希毛孢子菌（Tricrosporon asahii，T.asahii）是一種機會致病真菌，可以引起致命性播散性毛孢子菌病及深部真菌感染［1-2］。近年來，隨著抗菌藥的濫用、免疫抑制劑的廣泛使用以及艾滋病患者增加，阿薩希毛孢子菌感染的發生率有所上升。唑類藥物因抗真菌譜廣、不良反應小而用于抗真菌治療。ERG11基因編碼的羊毛甾醇14α脫甲基酶為唑類抗真菌藥的靶酶，與唑類藥物特異性結合后活性被抑制，從而阻遏細胞膜麥角甾醇的合成。故ERG11的改變或許與阿薩希毛孢子菌的耐藥有關。本研究通過實時PCR，檢測T.asahii耐藥株與敏感株ERG11基因表達量的差異，以及不同藥物濃度下ERG11基因的表達情況，探討該基因表達與T.asahii氟康唑耐藥的關系。

資料與方法

一、實驗菌株

臨床分離的6株T.asahii氟康唑敏感株（BZP902、BZP703、BZP705 為 實 驗 室 保 存 ，CBS7137、CBS6956、CBS4848購自荷蘭真菌多樣化研究中心），參照美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）推薦的M27-A3標準化方案對其進行藥敏試驗，試驗重復3次取均值。氟康唑對6株受試菌株的最小抑菌濃度（MIC）值分別為：1、2、0.5、0.25、1、2 μg/ml）。質控菌株為近平滑念珠菌ATCC 22019。

二、儀器與主要試劑

核酸檢測儀Nanodrop 2000（賽默飛世爾科技），Ultra PowerTM可見光凝膠透射儀和Ultra Power?RNA染料（北京百泰克生物技術有限公司），Bioer 96plus qPCR儀（杭州博日科技有限公司）；引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成（18sRNA，正向：5′-AACAACGGATCTCTTGGCTCTC-3′；反向：5′-CAGGCATGCTCTCCGGAATA-3′。ERG11，正向：5′-CGTGTTCACCTTTATCCTG-3′；反向：5′-ACTTCT TCTGCTGCATGA-3′）。TRNzol Universal總RNA提取試劑（天根生化科技北京有限公司），cDNA反轉錄試劑盒和熒光定量PCR mix（北京全式金生物技術有限公司），氟康唑干粉、RPMI1640粉與MOPS干粉均購自美國Sigma公司。

三、方法

1.氟康唑體外誘導耐藥：參照［3］氟康唑誘導耐藥T.asahii的方法，將6株T.asahii氟康唑敏感菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上35℃培養48 h，并以同樣條件傳代2次，以確保其純度和活力。取單菌落轉種于不含氟康唑的酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）液體培養基中，35℃、150 rpm搖床（矩形）振蕩培養18～48 h。當菌液濃度達到0.5麥氏單位時，取0.5 ml菌液加至20 ml含1/2 MIC FLC的YEPD培養基中培養，菌液濃度再次達到0.5麥氏單位時，取0.5 ml菌液轉種至20 ml含1倍MIC FLC的YEPD培養基中培養。依次進行下一級濃度梯度誘導，直至氟康唑誘導濃度達到128 μg/ml（所得誘導耐藥株MIC值分別為：128、128、64、64、128、64 μg/ml），每一代菌株均進行藥敏試驗，并用50%無菌甘油-80℃保存。

2.藥物干預下真菌培養：將敏感株與對應誘導耐藥株分別接種于PDA培養基上35℃溫箱培養48 h，取3個單菌落轉種于20 ml不含氟康唑的YEPD培養基中，35℃、矩形搖床（150 r/min）振蕩培養至生長對數期，取1 ml菌液離心，PBS沖洗2～3遍后用無菌氯化鈉溶液配成0.5麥氏濁度的菌懸液。分別取0.5 ml該菌懸液同時轉種至20 ml含有0～64 μg/ml濃度FLC的YEPD培養基中培養至生長對數期。

3.總RNA提取：取上述YEPD液體培養基中生長對數期的各菌液適量，1 146×g、4℃離心10 min，棄上清，液氮速凍后將沉淀置于滅菌預冷研缽中；加入1 ml Trnzol Universal總RNA提取試劑研磨，靜置至融化后重新移入焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過的EP管中；加入0.2 ml氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置10 min。4℃、13 400×g離心15 min；離心后分3層，取上層水相至新的無RNase離心管，加入等體積異丙醇混勻，室溫放置10 min。4℃、13 400×g離心10 min，去上清，加入1 ml 75%乙醇洗滌沉淀；4℃、9 391×g離心5 min，室溫2～3 min晾干。加入100 μl RNase-Free ddH2O，反復吹打混勻，充分溶解RNA，放置-80℃冰箱備用。

4.cDNA反轉錄及實時定量PCR擴增：用核酸檢測儀測量所提取的總RNA濃度，然后進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。反轉錄實驗時，在DEPC處理過的微量離心管中加入4 μl 5×TransScript?、1 μl gDNA Remover、1 μg總量RNA，然后加RNase水至20 μl，輕輕混勻，42 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s，反應結束后，cDNA放置-20℃冰箱備用。

qPCR實驗時，每個cDNA進行5倍稀釋作為模板，PCR反應體系為上下游引物各0.4 μl、10 μl 2 ×Trans Script?qPCR反應試劑盒、0.4 μl參考染料，1 μl cDNA模板，然后加RNase水至20 μl。將PCR反應管混勻離心后放入qPCR儀，擴增程序如下：94℃30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環反應數為45，然后進行溶解反應。以18sRNA作為內參，整個過程由qPCR儀自動完成，每個循環的熒光量由Bio-Rad CFX Manager系統軟件監測并計算出Ct值，ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內參基因18sRNA）。最后根據公式：2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。實驗重復3次取均值。

四、統計學處理

用SPSS 19.0軟件對數據進行統計學分析。ERG11表達量用（x±s）表示，用t檢驗對ERG11表達量進行統計學分析，用Spearman相關性分析對ERG11表達量與氟康唑濃度及阿薩希毛孢子菌耐藥性的相關性進行統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、誘導及藥物培養結果

經氟康唑藥物體外誘導后，成功獲得6株穩定T.asahii氟康唑耐藥菌株（MIC ≥ 64 μg/ml），MIC值范圍64～128 μg/ml。6對氟康唑敏感株及耐藥株在含0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/ml FLC干預下，對氟康唑的敏感性情況見表1。

二、ERG11表達水平

溶解曲線可以看出在PCR產物溶解溫度（ERG11：88℃）處只有一個峰，說明全部樣本的目的基因都獲得了特異性擴增。無藥情況下，6株T.asahii氟康唑耐藥株ERG11基因表達量為（7.542±5.311），6株敏感株表達量為（1.014± 0.012），兩者差異有統計學意義（P=0.03），見圖1。6個不同氟康唑濃度下，6株T.asahii耐藥株表達量均值亦均高于敏感株，差異有統計學意義，見表2。無論是T.asahii敏感株還是耐藥株，ERG11表達量并非隨著氟康唑濃度增加而升高，兩者之間無秩相關性。T.asahii氟康唑敏感株體外誘導耐藥過程中ERG11表達量有上升趨勢，但只有BZP902與BZP705的耐藥性與其ERG11表達量之間有相關性（BZP902：rs=0.865，P=0.003；BZP705：rs=0.847，P=0.002）。見圖2。

討 論

真菌耐藥已被廣泛關注，目前已報道的半擔子菌唑類耐藥機制主要有：①羊毛甾醇-14α-脫甲基酶（14DM）的改變（編碼基因的突變或表達增加）；②唑類外排加快或通透性增加。ERG11作為編碼唑類靶酶14DM的基因被廣泛研究［4］。因為臨床上很難在同一患者中同時獲得敏感株及治療后耐藥株的親本，而通過遞增濃度梯度氟康唑誘導產生的T.asahii氟康唑耐藥菌株與臨床預防性或治療性用藥產生的耐藥株更為接近［5］，故我們通過分析氟康唑誘導耐藥株ERG11基因表達情況來進一步探討該基因在T.asahii氟康唑耐藥中的作用。

表1 不同濃度氟康唑T.asahii的氟康唑敏感性情況（MIC）

表2 不同氟康唑濃度T.asahii敏感株與耐藥株ERG11表達量結果

圖1 未加氟康唑處理T.asahii氟康唑敏感株與耐藥株ERG11基因表達量差異

圖2 6株T.asahii氟康唑敏感株體外誘導耐藥過程中ERG11表達量與其耐藥性的關系 BZP902與BZP705的耐藥性與其ERG11表達量之間有顯著等級相關性（BZP902：rs=0.865，P=0.003；BZP705：rs=0.847，P=0.002）

本研究中，在未加氟康唑處理前6株T.asahii氟康唑耐藥株ERG11基因表達均高于敏感株，且在不同氟康唑濃度下耐藥株ERG11 mRNA水平亦均較敏感株高；提示ERG11基因高表達或許與阿薩希毛孢子菌氟康唑耐藥有關。與之前Franz等［6］和Teymur等［7］發現白念珠菌耐藥株ERG11基因表達高于敏感株相一致。Kontoyiannis等［8］發現，釀酒酵母ERG11基因過表達出現了耐藥現象。周永安等［9］也在研究熱帶念珠菌氟康唑耐藥機制中發現耐藥株ERG11 mRNA水平是敏感株的1.4倍，表明ERG11表達上調或許是致病真菌唑類耐藥機制之一。

江惟蘇等［5］和Kushima等［10］研究表明，通過體外氟康唑誘導或者聯合伊曲康唑可獲得較穩定的白念珠菌與阿薩希毛孢子菌氟康唑耐藥株，提示是否氟康唑濃度可影響T.asahiiERG11基因的表達情況。在本研究中，施加不同濃度氟康唑處理后，6對T.asahii臨床菌株表達量均較處理前有升高，無論是T.asahii敏感株還是耐藥株，ERG11的mRNA水平并未隨著氟康唑濃度的增加而呈遞增趨勢。Henry等［11］在其關于甾醇合成抑制劑對念珠菌ERG基因上調的研究中也發現氟康唑的用量似乎對ERG11表達量無明顯影響；并且觀察到ERG11基因上調先于念珠菌耐藥性增加，是念珠菌發生耐藥的原因之一。另外，我們分析誘導過程中檢測到的ERG11表達量數據發現，除BZP902和BZP705兩株T.asahii外ERG11 mRNA水平與其氟康唑耐藥性無顯著等級相關性，與郭鵬豪等［12］的報道相一致。因此我們認為氟康唑干預會引起T.asahiiERG11基因表達上調，進而發生耐藥。但ERG11 mRNA水平升高會先于菌株耐藥性的增加，因此ERG11 mRNA水平與T.asahii耐藥性并無相關性；而氟康唑更多的是作為一個誘發T.asahiiERG11基因上調的刺激因素，故其濃度對ERG11表達量影響不大。

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［5］江惟蘇,譚升順,江國英,等.特比萘芬與氟康唑或伊曲康唑聯合對氟康唑誘導耐藥穩定白念珠菌的影響［J］.中華微生物學和免疫學雜志,2006,26（4）:360-364.DOI:10.3760/j:issn:0254-5101.2006.04.016.

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［12］郭鵬豪,廖康,周琦嫻,等.光滑念珠菌ERG11基因mRNA含量與氟康唑耐藥性之間的關系［C］//中華醫學會,中華醫學會微生物學與免疫學分會.中華醫學會第十二次全國臨床微生物學術年會暨第十一次全球華人臨床微生物學與感染癥學術年會論文匯編,蘭州,2015:112.

Expression of the ERG11 gene in fluconazole-resistant Trichosporon asahii

Ding Xiao,Xia Zhikuan,Zhang Dequan,Yang Rongya
Department of Dermatology,Clinical College of General Hospital of Beijing Military Command,Anhui Medical University,Beijing 100700,China（Ding X,Yang RY）;Institute of Skin Damage and Repair,General Hospital of Beijing Military Command of PLA,Beijing 100700,China（Xia ZK,Zhang DQ）

Yang Rongya,Email:yang_rya@sina.com

ObjectiveTo investigate the role of the ERG11 gene in the drug resistance ofTrichosporon asahii（T.asahii）,and to explore the relationship between the gene expression and drug concentrations.MethodsStable fluconazole-resistant strains ofT.asahiiwere inducedin vitrofollowing exposure to a series of concentrations of fluconazole.Fluconazole-sensitive and-resistant strains ofT.asahiiwere separately cultured in the medium containing fluconazole at concentrations of 0,0.25,0.5,1,2,4,8,16,32 and 64 μg/ml.Real-time quantitative PCR was performed to determine the mRNA expression of ERG11 gene.ResultsIn fluconazole-free medium,the fluconazole-resistant strain ofT.asahiishowed significantly increased mRNA expression of the ERG11 gene compared with the fluconazole-sensitive strain（7.542±5.311vs.1.014±0.012,t=3.002,P=0.03）.Additionally,the mRNA expression of ERG11 gene was also significantly higher in the fluconazole-resistant strains than the fluconazole-sensitive strains in the culture medium containing fluconazole at different concentrations of 0.25（9.183±3.226vs.3.281±2.068）,0.5（13.657 ± 5.428vs.3.459 ± 1.923）,1（15.292 ± 7.007vs.3.242 ± 2.530）,2（13.720 ± 8.550vs.3.651 ± 0.728）,4（13.949 ± 2.960vs.3.969 ± 1.924）and 8（13.123 ± 6.429vs.3.824 ± 1.875）μg/ml（allP＜ 0.05）.However,no significant correlation was observed between the mRNA expression of ERG11 gene and fluconazole concentrations（fluconazole-resistant strains:rs=0.229,P=0.096;fluconazole-sensitive strains:rs=0.166,P=0.357）.ConclusionOverexpression of ERG11 gene is associated with fluconazole resistance inT.asahii,but there is no correlation between the mRNA expression of ERG11 gene and fluconazole concentrations.

Fluconazole;Drug resistance,fungal;Gene expression;Trichosporon asahii;Genes,ERG11

楊蓉婭，Email：yang_rya@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.05.010

國家自然科學基金（81271764）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81271764）

2016-08-05）

（本文編輯：吳曉初）