吲哚胺2，3-雙加氧酶在尖銳濕疣皮損中表達(dá)的研究

謝震 陳源漢 王思宇 萬(wàn)慧穎 雷華 楊戈 林昭春

610031成都，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所（謝震、王思宇、萬(wàn)慧穎、雷華、楊戈、林昭春）；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 廣東省人民醫(yī)院腎內(nèi)科（陳源漢）

吲哚胺2，3-雙加氧酶在尖銳濕疣皮損中表達(dá)的研究

謝震 陳源漢 王思宇 萬(wàn)慧穎 雷華 楊戈 林昭春

610031成都，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所（謝震、王思宇、萬(wàn)慧穎、雷華、楊戈、林昭春）；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 廣東省人民醫(yī)院腎內(nèi)科（陳源漢）

目的分析尖銳濕疣組織中吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）水平，研究其局部代謝色氨酸的能力。方法免疫組化法觀察尖銳濕疣患者皮膚IDO蛋白表達(dá)情況，計(jì)數(shù)IDO陽(yáng)性細(xì)胞的比例。免疫熒光觀察IDO（+）細(xì)胞與樹突細(xì)胞的關(guān)系。分離對(duì)照皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和疣體上皮細(xì)胞，色氨酸體外孵育后檢測(cè)上清液中色氨酸代謝產(chǎn)物犬尿氨酸的濃度以反映細(xì)胞代謝色氨酸的能力。結(jié)果IDO（+）細(xì)胞在正常皮膚中非常少，但在疣體表皮中卻大量聚集。疣體內(nèi)IDO（+）細(xì)胞/總體細(xì)胞48.3%±15.4%顯著高于正常皮膚5.2%±2.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IDO（+）細(xì)胞的熒光信號(hào)和皮膚朗格漢斯細(xì)胞并不重合，提示來源于疣體表皮細(xì)胞。從疣體組織分離的上皮細(xì)胞在體外代謝色氨酸的能力強(qiáng)于健康對(duì)照皮膚中分離的表皮細(xì)胞。結(jié)論尖銳濕疣疣體中存在大量的IDO（+）細(xì)胞，這些細(xì)胞可能參與尖銳濕疣的發(fā)病。

尖銳濕疣；吲哚胺-吡咯2，3-雙加氧酶；郎格爾漢斯細(xì)胞；免疫組織化學(xué)；熒光免疫測(cè)定

尖銳濕疣是人乳頭瘤病毒（HPV）感染引起的一種性傳播疾病，免疫逃逸是引起HPV持續(xù)復(fù)制的關(guān)鍵原因［1］，但機(jī)制尚不清楚。吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）是沿犬尿氨酸途徑代謝色氨酸的限速酶，在調(diào)控機(jī)體的免疫耐受中發(fā)揮著作用。正常皮膚只有極少量的IDO存在于朗格漢斯細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中，但是在某些免疫障礙的皮膚疾病中，IDO卻大量表達(dá)，例如，扁平苔蘚、銀屑病、皮膚肉芽腫和白癜風(fēng)［2-4］。IDO是否參與了尖銳濕疣的發(fā)病，目前尚無研究。本研究通過免疫組化分析尖銳濕疣組織中IDO水平，并對(duì)其局部代謝色氨酸的能力進(jìn)行了研究，以探討該分子在尖銳濕疣發(fā)病中的作用。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

納入30例疣體超過5 mm的尖銳濕疣患者，其中男17例，女13例，年齡（28±8）歲，平均有（4.5±2.8）個(gè)疣體。男性皮損取材部位包括包皮、陰阜、陰莖根部和肛周，女性患者皮損取材部位包括大、小陰唇、肛周、會(huì)陰。疣體感染HPV分型包括6、11、42和43型，患者最少感染1個(gè)型別，最多同時(shí)感染3個(gè)型別。30例患者中11例復(fù)發(fā)，其中7例為原位復(fù)發(fā)，4例為新部位復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)時(shí)間為2.4～5.9個(gè)月。12例行包皮環(huán)切的健康人包皮作為對(duì)照皮膚，年齡（30±9）歲，與尖銳濕疣患者年齡比較無差異（P＞0.05）。尖銳濕疣患者排除標(biāo)準(zhǔn)：①納入前6周接受過疣體治療；②接受過免疫抑制藥物或糖皮質(zhì)激素治療；③患有先天或后天免疫缺陷疾病；④經(jīng)病史詢問、體檢及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)符合自身免疫性疾病；⑤近1周內(nèi)有發(fā)熱、咳嗽、腹瀉及尿頻、尿急尿痛等感染性疾病表現(xiàn)。本研究通過四川省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選者均簽署知情同意書。所有納入治療的患者均根據(jù)《尖銳濕疣診療指南》的方案進(jìn)行治療［5］，在盡可能切除疣體后，用CO2激光去除疣體聯(lián)合局部外用咪喹莫特軟膏治療。患者治療后均隨訪半年觀察復(fù)發(fā)情況。

二、主要試劑及儀器

鼠抗人抗IDO（ab55305）、鼠抗人抗CD1a抗體（ab201337）、兔抗人抗IDO1抗體（ab76157）均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。alexa488標(biāo)記的驢抗鼠IgG（A-21202）、alexa555標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體（A-31572）均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。色氨酸、1-甲基-色氨酸均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

三、方法

1.免疫組化方法定量IDO（+）細(xì)胞：取最大的疣體進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。皮膚取樣經(jīng)福爾馬林液處理后石蠟包埋。用鼠抗人抗IDO（1∶100）作為一抗，根據(jù)Immuno CruzTM鼠ABC染色系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化檢查。生物素標(biāo)記的二抗作用后孵育抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶，鄰苯二胺法顯色。IDO（+）細(xì)胞由兩位病理醫(yī)生獨(dú)立雙盲閱片計(jì)數(shù)。隨機(jī)選取3個(gè)表皮高倍視野（×400）分別計(jì)數(shù)IDO（+）細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)，取平均數(shù)作為該例患者的結(jié)果。

2.免疫熒光檢查朗格漢斯細(xì)胞和IDO（+）細(xì)胞：石蠟包埋組織切片脫蠟后經(jīng)熱處理修復(fù)抗原。用流動(dòng)的冷Tris緩沖液（pH7.4）沖洗后，分別用鼠抗人的抗CD1a抗體（1∶50）和兔抗人抗IDO1抗體（1∶100）作為染色朗格漢斯細(xì)胞和IDO（+）細(xì)胞的一抗進(jìn)行孵育，然后分別加入alexa488標(biāo)記的驢抗鼠IgG（1∶1 000）和alexa555標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體（1∶1 000）作為二抗。同型鼠抗體作為一抗的陰性對(duì)照。用熒光顯微鏡（Zeiss Axio Imager Z1）觀察熒光強(qiáng)度。

3.皮膚提取細(xì)胞的IDO活性：除用于免疫組化的疣體外，其余疣體用于提取上皮細(xì)胞。由于4例復(fù)發(fā)者只有單個(gè)疣體，最終只有26例用于IDO活性檢測(cè)。正常皮膚對(duì)照取自健康包皮環(huán)切術(shù)的包皮皮膚。用此前文獻(xiàn)報(bào)道的方法提取對(duì)照皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）和疣體上皮細(xì)胞（epidermal cell from warts，EC-W），并制備細(xì)胞懸液［6］。操作均在無菌條件下進(jìn)行，簡(jiǎn)要描述：去掉脂肪和結(jié)締組織后，皮膚組織被切為0.5 cm×0.5 cm小片。待用0.25%胰酶溶液4℃過夜消化使真皮和表皮分離后，用無菌鑷分離表皮。搗碎表皮組織后加入含10%人血清的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基中和胰酶，然后將組織碎塊混合物通過70 μm的細(xì)胞過濾器。梯度離心法去除死細(xì)胞后收獲分離的KC或EC-W。

用細(xì)胞體外將色氨酸代謝為犬尿氨酸的能力來反映IDO活性。將分離的KC或EC-W洗滌2遍后按1×105/L重懸于含100 μmol/L色氨酸的Hanks液中孵育4 h［7］。收集上清，用高效液相色譜檢測(cè)上清液犬尿氨酸濃度，其濃度作為IDO酶學(xué)活性［7］。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和IDO基因質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。為了說明色氨酸向犬尿氨酸轉(zhuǎn)換是否依賴IDO，部分實(shí)驗(yàn)在Hanks液中加入了200 μmol/L的IDO特異性抑制劑1-甲基-色氨酸。

4.統(tǒng)計(jì)方法：結(jié)果用x±s表示，兩組間和多組間比較采用方差分析，多組間比較在總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后行Post Hoc分析。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、疣體組織高表達(dá)IDO

正常對(duì)照皮膚僅在基底層可見少量IDO（+）細(xì)胞，在鱗狀上皮細(xì)胞層中幾乎見不到IDO（+）細(xì)胞（圖1A），但是尖銳濕疣患者的疣體內(nèi)高表達(dá)IDO（圖1B）。疣體內(nèi)IDO（+）細(xì)胞/總細(xì)胞百分率48.3%±15.4%顯著高于正常皮膚5.2%±2.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IDO分布于胞質(zhì)（圖1C方框中放大圖）。疣體的這些IDO（+）細(xì)胞廣泛分布于表皮中，真皮僅見個(gè)別散在分布。特別是，復(fù)發(fā)患者在初診（圖1C）和復(fù)發(fā)時(shí)（圖1D）的IDO（+）細(xì)胞在疣體組織中顯色都非常明顯，復(fù)發(fā)者IDO（+）細(xì)胞/總細(xì)胞百分率65.5%±22.5%顯著高于未復(fù)發(fā)者22.4%±10.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

免疫熒光證實(shí)，IDO在對(duì)照皮膚中幾乎為陰性，而大量IDO（+）細(xì)胞分布在疣體中。IDO的熒光和朗格漢斯細(xì)胞標(biāo)記物CD1a的熒光并不重合（圖2）。結(jié)合免疫組化顯示IDO（+）細(xì)胞為異常的角質(zhì)形成細(xì)胞或空泡細(xì)胞，上述結(jié)果表明，疣體局部增多的IDO主要來源于異常的角質(zhì)形成細(xì)胞，而不是來源于皮膚朗格漢斯細(xì)胞。

二、尖銳濕疣局部色氨酸代謝

圖1 免疫組化顯示對(duì)照皮膚和尖銳濕疣疣體組織中IDO（+）細(xì)胞（鄰苯二胺法×100）1A：來源于包皮環(huán)切術(shù)的對(duì)照皮膚，幾乎無IDO表達(dá)，僅在表皮基底層可見表達(dá)；1B：未復(fù)發(fā)的尖銳濕疣疣體組織，表皮中聚集較多IDO（+）細(xì)胞；1C：尖銳濕疣疣體組織表現(xiàn)為典型的棘層細(xì)胞肥厚和棘層細(xì)胞肥厚伴乳頭瘤樣增生。表皮部分幾乎完全被IDO（+）細(xì)胞占據(jù)。紅框?yàn)榈湫虸DO（+）細(xì)胞的放大圖（×200）；1D：尖銳濕疣復(fù)發(fā)后疣體組織仍有大量IDO（+）細(xì)胞浸潤(rùn)

圖2 免疫熒光顯示IDO和朗格漢斯細(xì)胞位置關(guān)系 2A：免疫熒光顯示正常皮膚散在少量分枝狀CD1a（+）朗格漢斯細(xì)胞，IDO（+）細(xì)胞幾乎為陰性；2B：尖銳濕疣聚集大量IDO（+）細(xì)胞，IDO的紅色熒光極少與綠色的CD1a熒光重合。綠色、紅色和藍(lán)色熒光分別顯示CD1a、IDO和細(xì)胞核（DAPI染色）。白色箭頭表示朗格漢斯細(xì)胞

KC幾乎不具有代謝色氨酸為犬尿氨酸的能力，但EC-W卻具有這種能力。加入1-甲基-色氨酸可以顯著抑制EC-W代謝色氨酸的能力（表1），表明EC-W代謝色氨酸依賴IDO的酶學(xué)活性。表明疣體組織IDO（+）細(xì)胞增強(qiáng)了局部色氨酸代謝能力。

討 論

IDO是一種介導(dǎo)免疫耐受的關(guān)鍵分子，通過多種途徑調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。色氨酸是T淋巴細(xì)胞增殖的必需氨基酸，IDO代謝色氨酸的效應(yīng)可抑制T細(xì)胞的增殖；色氨酸被IDO代謝生成的犬尿氨酸也能促進(jìn)免疫耐受［8］。另外，IDO的分子結(jié)構(gòu)包含一段免疫受體酪氨酸抑制基序，該結(jié)構(gòu)進(jìn)一步正反饋放大IDO介導(dǎo)的免疫耐受作用［9］。IDO介導(dǎo)的色氨酸缺失和犬尿氨酸升高還會(huì)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞［10-11］。這些多途徑免疫抑制效應(yīng)使該分子近年來受到廣泛關(guān)注。

表1 對(duì)照皮膚和疣體組織提取細(xì)胞的吲哚胺2，3-雙加氧酶活性

既往報(bào)道在扁平苔蘚、單純皰疹、特應(yīng)性皮炎、銀屑病和慢性盤狀紅斑狼瘡的皮損中，IDO主要分布于真皮組織，表皮IDO幾乎沒有變化［2］，這與我們?cè)诩怃J濕疣局部發(fā)現(xiàn)IDO的分布規(guī)律不同。尖銳濕疣主要累及表皮，而上述皮膚病同時(shí)累及表皮和真皮，這可能是不同病種IDO分布部位不同。尖銳濕疣中IDO高表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。在一些病毒感染性皮膚病中，感染會(huì)誘導(dǎo)IDO高表達(dá)，例如，皮膚單純皰疹病毒感染［2］。轉(zhuǎn)染了HPV癌蛋白e7基因的小鼠皮膚高表達(dá)IDO［12］，提示HPV的某些蛋白可能會(huì)誘導(dǎo)皮膚IDO表達(dá)。

我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這些疣體局部的IDO（+）細(xì)胞具有代謝色氨酸的能力。此前的體外實(shí)驗(yàn)表明，皮膚組織IDO增加可以抑制T淋巴細(xì)胞增生［13］。轉(zhuǎn)染了HPV蛋白的小鼠高表達(dá)IDO，這類小鼠的皮膚作為移植供體的排斥反應(yīng)弱，給予IDO抑制劑可重建皮膚的排斥反應(yīng)［12］。本研究提示，尖銳濕疣局部增加的IDO（+）細(xì)胞通過形成色氨酸缺失微環(huán)境介導(dǎo)免疫耐受，可能是尖銳濕疣發(fā)病的一種新機(jī)制。另外值得一提的是，IDO（+）細(xì)胞在復(fù)發(fā)個(gè)體的疣體內(nèi)大量聚集，提示IDO可能參與了尖銳濕疣復(fù)發(fā)。由于缺乏這些患者復(fù)發(fā)前的IDO資料，我們無法分析IDO水平和復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。由于樣本量的限制，我們沒有分析IDO表達(dá)是否和HPV分型有關(guān)，也沒有研究其他臨床指標(biāo)和IDO水平的關(guān)系，例如，性別和年齡。因此，疣體中IDO大量增加的機(jī)制和臨床意義尚待更多的研究。

［1］Frazer IH.Interaction of human papillomaviruses with the host immune system:a well evolved relationship［J］.Virology,2009,384（2）:410-414.DOI:10.1016/j.virol.2008.10.004.

［2］Scheler M,Wenzel J,Tüting T,et al.Indoleamine 2,3-dioxygenase（IDO）:the antagonistoftype Iinterferon-driven skin inflammation?［J］.Am J Pathol,2007,171（6）:1936-1943.DOI:10.2353/ajpath.2007.070281.

［3］von Bubnoff D,Scheler M,Wilms H,et al.Indoleamine 2,3-dioxygenase-expressing myeloid dendritic cells and macrophages in infectious and noninfectious cutaneous granulomas［J］.J Am Acad Dermatol,2011,65（4）:819-832.DOI:10.1016/j.jaad.2010.07.050.

［4］Schallreuter KU,Salem MA,Gibbons NC,et al.Blunted epidermal L-tryptophan metabolism in vitiligo affects immune response and ROS scavenging by Fenton chemistry,part 2:epidermal H2O2/ONOO（-）-mediated stress in vitiligo hampers indoleamine 2,3-dioxygenase and aryl hydrocarbon receptor-mediated immune response signaling［J］.FASEB J,2012,26（6）:2471-2485.DOI:10.1096/fj.11-201897.

［5］中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)分會(huì)性病學(xué)組,中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)皮膚科分會(huì)性病亞專業(yè)委員會(huì).尖銳濕疣診療指南（2014）［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（8）:598-599.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.020.

［6］Borowiec AS,Delcourt P,Dewailly E,et al.Optimal differentiation ofin vitrokeratinocytes requires multifactorial external control［J］.PLoS One,2013,8（10）:e77507.DOI:10.1371/journal.pone.0077507.

［7］Braun D,Longman RS,Albert ML.A two-step induction of indoleamine 2,3 dioxygenase（IDO）activity during dendritic-cell maturation［J］.Blood,2005,106（7）:2375-2381.DOI:10.1182/blood-2005-03-0979.

［8］Medzhitov R,Shevach EM,Trinchieri G,et al.Highlights of 10 years of immunology in nature reviews immunology［J］.Nat Rev Immunol,2011,11（10）:693-702.DOI:10.1038/nri3063.

［9］Pallotta MT,Orabona C,Volpi C,et al.Indoleamine 2,3-dioxygenase is a signaling protein in long-term tolerance by dendritic cells［J］.Nat Immunol,2011,12（9）:870-878.DOI:10.1038/ni.2077.

［10］Salazar F,Hall L,Negm OH,et al.The mannose receptor negatively modulates the toll-like receptor 4-aryl hydrocarbon receptor-indoleamine 2,3-dioxygenase axis in dendritic cells affecting T helper cell polarization［J］.J Allergy Clin Immunol,2016,137（6）:1841-1851.e2.DOI:10.1016/j.jaci.2015.10.033.

［11］Mellor AL,Munn DH.Physiologic control of the functional status of Foxp3+regulatory T cells［J］.J Immunol,2011,186（8）:4535-4540.DOI:10.4049/jimmunol.1002937.

［12］Mittal D,Kassianos AJ,Tran LS,et al.Indoleamine 2,3-dioxygenase activity contributes to local immune suppression in the skin expressing human papillomavirus oncoprotein e7［J］.J Invest Dermatol,2013,133（12）:2686-2694.DOI:10.1038/jid.2013.222.

［13］von Bubnoff D,Bausinger H,Matz H,et al.Human epidermal langerhans cells express the immunoregulatory enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase［J］.J Invest Dermatol,2004,123（2）:298-304.DOI:10.1111/j.0022-202X.2004.23217.x.

Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in condyloma acuminatum lesions

Xie Zhen,Chen Yuanhan,Wang Siyu,Wan Huiying,Lei Hua,Yang Ge,Lin Zhaochun
Institute of Dermatology and Venereology,Sichuan Academy of Medical Sciences and Sichuan Provincial People′s Hospital,Chengdu 610031,China（Xie Z,Wang SY,Wan HY,Lei H,Yang G,Lin ZC）;Department of Nephrology,Guangdong Academy of Medical Sciences,Guangdong General Hospital,Guangzhou 510080,China（Chen YH）

Xie Zhen,Email:xiezhen6289@126.com

ObjectiveTo measure the expression of indoleamine 2,3-dioxygenase（IDO）in condyloma acuminatum（CA）lesions,and to evaluate its ability to locally metabolize tryptophan.MethodsImmunohistochemical study was performed to observe the protein expression of IDO in skin lesions of patients with CA,and count the number of IDO-positive cells.Immunofluorescence assay was conducted to estimate the relationship between IDO-positive cells and dendritic cells.Epidermal cells and keratinocytes were isolated from warts of 30 patients with CA and prepuces of 11 healthy controls respectively,and bothin vitroincubated with tryptophan solution for 4 hours.Then,high-performance liquid chromatography（HPLC）was performed to detect the level of tryptophan metabolite,kynurenine,in the culture supernatant of the above cells,which could reflect the ability of epidermal cells to metabolize tryptophan.ResultsRare IDO-positive cells were found in the normal skin,but a lot of IDO-positive cells gathered in the epidermis of the wart tissues.The IDO-positive cell/total cell ratio was significantly higher in the wart tissues than in the normal skin（48.3%±15.4%vs.5.2%±2.4%,P＜0.05）.The fluorescence signals of IDO-positive cells and CD1a-positive Langerhans cells were not overlapped with each other,suggesting that IDO-positive cells were derived from epidermal cells of the wart tissues.Compared with the keratinocytes from the healthy skin,the epidermal cells from warts had a stronger ability to metabolize tryptophanin vitro.ConclusionA large number of IDO-positive cells exist in CA warts,and may be involved in occurrence of CA.

Condylomata acuminata;Indoleamine-pyrrole 2,3,-dioxygenase;Langerhans cells;Immunohistochemistry;Fluoroimmunoassay

謝震，Email：xiezhen6289@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.05.006

四川省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題（16PJ440）

Fund program:Research Program of Health and Family Planning Commission of Sichuan Province of China（16PJ440）

2016-03-02）

（本文編輯：吳曉初）