基于梅毒核酸疫苗pcD/Tp92的不同接種策略

劉安元 陶立堅 趙鐵 趙飛駿 張曉紅

410078長沙，中南大學湘雅公共衛(wèi)生學院（劉安元、陶立堅）；南華大學病原生物研究所特殊病原體防控湖南省重點實驗室（張曉紅、趙飛駿、趙鐵）

基于梅毒核酸疫苗pcD/Tp92的不同接種策略

劉安元 陶立堅 趙鐵 趙飛駿 張曉紅

410078長沙，中南大學湘雅公共衛(wèi)生學院（劉安元、陶立堅）；南華大學病原生物研究所特殊病原體防控湖南省重點實驗室（張曉紅、趙飛駿、趙鐵）

目的評估基于梅毒核酸疫苗pcD/Tp92的各接種優(yōu)化策略對新西蘭兔梅毒螺旋體（Tp）皮膚感染的免疫保護效應。方法核酸疫苗pcD/Tp92采用2次肌內(nèi)注射免疫或肌內(nèi)注射初免鼻飼加強的免疫方式結(jié)合黏膜佐劑CpG ODN及Tp92重組蛋白，分別或聯(lián)合免疫新西蘭兔。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各接種策略組免疫期間（0～8周）兔特異性抗體產(chǎn)生及變化水平，免疫8周后兔鼻咽部、陰道黏膜SIgA產(chǎn)生水平及兔脾細胞IL-2、γ干擾素（IFN-γ）誘導水平，噻唑藍法（MTT）檢測兔脾淋巴細胞增殖水平。記錄各組在初次免疫后第10周兔皮下接種Tp標準株感染后接種部位感染早期皮損的變化。結(jié)果采用pcD/Tp92核酸疫苗肌內(nèi)注射初免，CpG-ODN聯(lián)合Tp92重組蛋白抗原鼻飼新西蘭兔加強免疫的接種策略組（C2組）分別與pcD/Tp92疫苗肌注組（A2組），pcD/Tp92疫苗肌注初免，pcD/Tp92鼻飼加強免疫組（B1組）或結(jié)合黏膜佐劑CpG ODN聯(lián)合免疫的接種策略組（B2組）相比，既能促進pcD/Tp92核酸疫苗在兔體內(nèi)免疫期間（8周）誘生更高特異性抗體水平（C2組：1.825 ± 0.175；A2組：1.372 ± 0.322；B1組：0.893 ± 0.297；B2組：1.294 ± 0.124；P＜ 0.05），IL-2（C2組：154.7± 14.6；A2組：112.3± 13.4；B1組：76.6± 21.5；B2組：97.3± 18.7；P＜ 0.05）及IFN-γ（C2組：277.4± 24.4；A2組：232.8± 25.3；B1組：165.7± 22.6；B2組：211.3± 24.6；P＜ 0.05）分泌水平，以及更高的T細胞增殖分化水平（SI C2組：3.57±0.24；A2組：3.08±0.22；B1組：2.12±0.14；B2組：2.88±0.18；P＜0.05），還能刺激更高的黏膜特異性SIgA抗體，導致最低Tp感染部位皮損Tp陽性率（6.67%）及潰瘍病灶形成率（6.67%）從而達到有效的保護作用。結(jié)論pcD/Tp92核酸疫苗肌內(nèi)注射初免，CpG ODN聯(lián)合Tp92重組蛋白鼻飼加強免疫的接種策略能在新西蘭兔體內(nèi)誘導最強的黏膜免疫和免疫保護效應。

梅毒；蒼白密螺旋體；疫苗；DNA；免疫；黏膜；兔；Tp92；CpG-ODN

Fund program:National Natural Science Foundation（81373230,81301470）

梅毒是梅毒螺旋體（Treponema Pallidun，Tp）感染引起的危害人類健康的性傳播疾病。近年來，全球梅毒發(fā)病率逐年上升［1］，中國梅毒發(fā)病率也呈增長趨勢［2］，因此，研制安全有效的梅毒疫苗，成為控制該病的關鍵之一。機體免疫系統(tǒng)的局部黏膜效應在應對早期抗Tp感染過程中發(fā)揮著重要的作用，而單一的梅毒核酸疫苗或蛋白疫苗通過肌注方式免疫新西蘭兔雖能刺激產(chǎn)生較強的系統(tǒng)免疫應答，但對黏膜免疫系統(tǒng)的有效刺激顯得很局限，難以獲得有效的免疫保護效果［3-4］。近年來，大量疫苗的研究采用核酸疫苗初次免疫，繼而用相應蛋白疫苗加強免疫的聯(lián)合免疫策略，顯示免疫保護性應答效應較單一核酸疫苗或蛋白疫苗有所提高［5-7］。CpGODN有促進黏膜免疫和增強免疫原性的雙重功能，是一種具應用前景的黏膜佐劑［8-10］?；诖耍狙芯恳环矫嬖诔醪津炞CpcD/Tp92核酸疫苗免疫效應的基礎上，用CpG-ODN的黏膜佐劑結(jié)合肌注初次免疫，鼻飼加強免疫接種模式強化誘導機體免疫應答；另一方面采用pcD/Tp92核酸疫苗肌注初免，CpG-ODN聯(lián)合Tp92重組蛋白鼻飼免疫加強新策略免疫新西蘭兔，期望能有效激發(fā)和增強免疫兔的全身免疫效應。

資料和方法

一、資料

1.實驗動物：新西蘭雌性大白兔（SYXK湘2010-0006）由南華大學醫(yī)學科學研究中心實驗動物部提供并飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫保持18～20℃，喂養(yǎng)用飼料和飲用水保證無抗生素。

2.菌株和質(zhì)粒：Tp Nichols標準株由上海市皮膚病性病醫(yī)院檢驗科顧偉鳴主任和廈門大學中山醫(yī)院檢驗科楊天賜主任惠贈并由南華大學醫(yī)學院病原生物研究所傳代保存。E.coli BL21（DE3）株、重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/Tp92和PET43.1a（+）/Tp92由本研究所成功構(gòu)建并保存［2］。

3.主要試劑：Toxin EraserTMEndotoxin Removal試劑盒（美國GenScript公司），BCA微量蛋白試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），CpG ODN序列（TCCATGACGTTCCTGACGTT）由Invitrogen（上海）貿(mào)易有限公司合成，HRP標記山羊抗人/兔IgG二抗（美國Invitrogen公司），兔IFN-γ、IL-2及兔IgA ELISA定量檢測試劑盒（美國RayBiotech公司），F(xiàn)BS和RPMI1640培養(yǎng)基（美國HyClone公司）。

二、方法

1.核酸疫苗的制備及純化：按文獻［3］所述，大量提取重組質(zhì)粒pcD/Tp92和空質(zhì)粒pcDNA3.1（+），純化后溶于pH7.3的無菌PBS溶液中，調(diào)整質(zhì)粒濃度為0.2 mg/ml。

2.重組蛋白的表達、純化及鑒定：將重組質(zhì)粒PET43.1a（+）/Tp92轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）擴大培養(yǎng)至對數(shù)期，16 ℃，IPTG（0.2 mmol/L）誘導表達6 h，菌液12 300×g離心8 min收集沉淀，裂解后取上清層析過柱；4℃，2 000×g離心40 min，加入PBS 4～5次洗凈蛋白。透析濃縮蛋白，去內(nèi)毒素后調(diào)整蛋白濃度為0.03 mg/ml備用。用His標簽抗體或梅毒陽性人血清為一抗，HRP標記的羊抗兔/人抗體為二抗，免疫印跡實驗鑒定純化蛋白。

3.免疫接種策略的實施及感染實驗：將新西蘭兔分為對照組A1，疫苗免疫策略實施組A2、B1、B2、C1、C2共6個組，每組18只。免疫接種策略實施如下：A1組pcD（100 μg）肌注免疫 2次；A2組 pcD/Tp92（100 μg）肌注免疫2次；B1組pcD/Tp92（100 μg）初次肌注免疫，pcD/Tp92（100 μg）鼻飼加強免疫；B2組pcD/Tp92（100 μg）初次肌注免疫，pcD/Tp92（100 μg）聯(lián)合CpGODN（10 μg）鼻飼加強免疫；C1組pcD/Tp92（100 μg）初次肌注免疫，Tp92 重組蛋白（50 μg）鼻飼加強免疫；C2組pcD/Tp92（100 μg）初次肌注免疫，Tp92 重組蛋白（50 μg）聯(lián)合CpGODN（10 μg）鼻飼加強免疫。兩次免疫時間間隔2周。初次免疫后8周，每組隨機取3只兔用于脾細胞增殖試驗、細胞因子分泌檢測及鼻咽部、陰道黏膜SIgA分泌水平檢測。初次免疫后10周左右，將6個組剩余15只兔背部剃毛后，皮下接種8個皮丘，每個皮丘位點接種Tp Nichols株菌量為105個左右。每隔3天記錄測量0～60 d感染部位皮損紅腫、潰爛變化及愈合時間情況，在背部皮膚感染21 d左右暗視野和鍍銀染色檢查記錄皮損Tp陽性率及皮損潰瘍病灶形成率。

4.實驗組不同時間點兔血清特異性Tp92抗體水平檢測：參照文獻［3］，6個組（n=18）在初次免疫后第0周（免疫當天）、2、4、6、8周5個時間點分別進行兔耳緣靜脈采血1 ml，分離血清。間接ELISA法檢測血清特異性Tp92抗體水平：將1∶50稀釋的Tp92重組蛋白4℃包被96孔酶標板過夜，37℃10%BSA-PBS液封閉酶標板1 h，PBS多次洗滌后，加入經(jīng)倍比稀釋的不同濃度的待測免疫兔血清，用梅毒陽性兔血清做陽性對照，37℃孵育1h后洗滌，加入HRP標記的羊抗兔IgG（1∶2 000）二抗，37℃孵育1 h后洗滌，TMB顯色，酶標儀讀取450 nm波長的A值，每個樣本重復檢測3次，取均值。

5.兔免疫后鼻咽部及陰道沖洗液中IgA水平測定及脾淋巴細胞培養(yǎng)上清細胞因子IFN-γ及IL-2水平的檢測：參照文獻［3］，各實驗組在免疫后第8周隨機處理3只兔，分別用500 μl的PBS溶液連續(xù)沖洗鼻咽部或從陰道口向內(nèi)重復沖洗3次，收集鼻咽部/陰道沖洗液1 500 μl；2 000 ×g離心10 min，收集上清。取1∶50稀釋的Tp92蛋白4℃包被96孔酶標板過夜孵育，將沖洗液上清加入反應孔中，37℃孵育1 h，充分洗滌后，加入HRP標記的羊抗兔IgA二抗，37℃再孵育1 h，充分洗滌后加入顯色液和終止液。酶標儀讀取抗體492 nm波長的A值。無菌采用200目銅網(wǎng)研磨脾臟組織后收獲脾細胞，離心棄上清，加裂解液，離心棄上清后稀釋計數(shù)脾細胞，以100 μl/孔加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔細胞數(shù)調(diào)整為6×105個。用純化的Tp92蛋白作為刺激抗原（20 μg/ml），同時設ConA（10 μg/ml）刺激孔作為陽性對照，未用抗原刺激細胞孔作為陰性對照。細胞因子ELISA檢測試劑盒檢測分析細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ的濃度。

6.MTT法檢測兔免疫期間脾細胞增殖：參照方法5制備脾淋巴細胞懸液，稀釋至細胞數(shù)4×106/ml，以100 μl/孔加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，用純化的Tp92蛋白作為刺激抗原（8 μg/ml），同時設ConA（5 μg/ml）刺激作為陽性對照，未用抗原刺激細胞孔作為陰性對照。置37℃、CO2培養(yǎng)箱中孵育68 h，MTT法檢測兔T細胞增殖反應，結(jié)果以刺激指數(shù)（stimilation index，SI）表示。酶標儀上讀取570 nm波長A值，計算SI值（SI=實驗組A值/對照組A值）。

7.統(tǒng)計學方法：使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，對6組免疫感染后各時期特異性抗體滴度水平，細胞因子分泌水平及脾細胞SI值等數(shù)據(jù)資料進行方差分析，兔背部皮膚Tp感染部位皮損Tp檢測陽性率和潰爛病灶形成率相關數(shù)據(jù)采用χ2檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、Tp92重組蛋白的表達與鑒定

PET43.1a（+）/Tp92重組質(zhì)粒擴大培養(yǎng)，于16℃，IPTG終濃度0.2 mmol/L，誘導表達6 h后上清中見特異性表達，結(jié)果見圖1A。誘導表達的重組蛋白經(jīng)His標簽純化柱純化、去內(nèi)毒素后，分別用His標簽抗體（圖1B）及梅毒陽性病患血清（圖1C）行Western印跡分析，在92 000位置左右有一印跡條帶，大小與預期相符。

二、間接ELISA法檢測免疫期血清抗Tp92特異性IgG抗體

圖 2所示，A2、B1、B2、C1、C2組所誘導的抗Tp92特異性IgG抗體水平在第1次免疫后2、4、6、8周這4個時間點顯著高于A1對照組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.001）；B1組在免疫后4、6、8周抗Tp92特異性IgG抗體水平與B2、A2、C1、C2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.05）；A2、B2、C1組3組、在免疫后4、6、8周抗Tp92特異性IgG抗體水平，組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；C2組免疫后4、6、8周抗Tp92特異性IgG抗體水平升高尤為明顯，與其他實驗組（A2、B1、B2、C1組）比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

圖1 梅毒螺旋體Tp92蛋白的表達及免疫印跡分析鑒定 1A：PET43.1a（+）/Tp92重組質(zhì)粒在E.coli，BL21的表達：誘導與未誘導表達菌裂解液行12%SDS-PAGE分析；1B、1C：考馬斯亮藍染色：免疫印跡分析純化重組Tp92蛋白的反應性（1B用His抗體，1C用梅毒陽性血清）

圖2 疫苗免疫策略實施組A2、B1、B2、C1、C2組新西蘭兔在免疫后不同時間段誘導的特異性Tp92 IgG抗體A值變化（A450 nm）

三、ELISA檢測免疫期兔鼻咽部及陰道沖洗液SIgA水平和脾淋巴細胞培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-2分泌水平

經(jīng)免疫后第8周ELISA檢測兔脾淋巴細胞培養(yǎng)上清IL-2及IFN-γ分泌水平，A2、B1、B2、C1、C2組高于A1組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）；B1組IL-2分泌水平與B2、C1組比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），與A2、C2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.05）；而B1組IFN-γ分泌水平與A2、B2、C1、C2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；A2組兔IL-2及IFN-γ分泌水平與B2、C1組比較，差異無統(tǒng)計學意義，而與B1、C2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；C2組在IL-2及IFN-γ分泌水平在各組中最高，與A2、B1、B2、C1、C2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。免疫后第8周，ELISA檢測兔鼻咽部及陰道沖洗液SIgA分泌水平，B1、B2、C1、C2組均高于A1組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001），但A2組與A1組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；A2組與B1、B2、C1、C2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.01）；B1組與B2，C1，C2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；B2組與C2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），但與C1組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；C1組與C2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見表1。

四、MTT比色法檢測新西蘭兔免疫后T細胞增殖反應

圖3所示，在免疫后第8周，A2、B1、B2、C1、C2組SI均高于A1組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）；B1組SI與A2、B2、C1、C2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而B2組與A2、C1組比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞ 0.05），C2組則與A2、B1、B2、C1組感染前SI比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

五、感染期保護性效果初步評估

1.皮損Tp陽性率及潰瘍病灶形成率比較：比較各組兔背部皮膚感染位點Tp陽性率及潰瘍病灶形成率發(fā)現(xiàn)，A2、B1、B2、C1、C2組均低于A1對照組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）；A2組與B2、C1、C2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），但與B1組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；B1組與B2、C1、C2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；B2，C1組與C2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但B2與C1組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

2.感染早期不同時間節(jié)點皮損紅腫及潰瘍的變化趨勢：A1、A2、B1、B2、C1、C2組兔背部皮膚8個位點皮內(nèi)Tp感染后21 d后，同比觀察皮損紅腫直徑及潰瘍病灶形成數(shù)，對照組A1感染位點皮損紅腫直徑最大，潰瘍病灶形成數(shù)多（圖4A）；A2組和B1組皮損紅腫直徑同比中等大小（圖4B，4C）；B2組、C1組及C2組皮損紅腫直徑同比最?。▓D4D～4F）。各Tp疫苗接種策略組兔感染位點皮損紅腫在第3天左右開始出現(xiàn)（直徑3～5 mm），紅腫直徑達峰值的時間為C2組和B2組21 d（直徑9.15和9.62 mm）；A2組16 d和C1組第18天（9.66 mm和10.73 mm）；B1組18 d（11.13 mm）；A1組皮損紅腫出現(xiàn)的較晚且較小（第6天，2.5 mm），但紅腫增大很快，在第15天達頂峰（為14.44 mm）。皮損紅腫完全消退的時間為C2組第44天，A2組47 d，B2組和C1組50 d；B1組56 d；A1對照組在第60天仍保持4 mm，紅腫消退晚。

表1 各免疫組兔脾淋巴細胞IL-2及IFN-γ分泌水平及兔鼻咽部及陰道沖洗液SIgA分泌水平比較分析

討 論

圖3 疫苗免疫策略實施組A2、B1、B2、C1、C2組感染前脾細胞刺激指數(shù)（SI）比較 各組間單因素方差分析，SI（A1，A2，B1，B2，C1，C2組）：F=68.411，P＜0.001；a：組間兩兩比較，P ＜0.05

表2 6組兔背部皮膚Tp感染后的皮損Tp陽性率及潰瘍病灶形成率比較分析

圖4 對照組A1，疫苗免疫策略實施組A2、B1、B2、C1、C2組兔背部皮膚8個位點皮內(nèi)Tp感染后21 d皮損圖 A2、B1、B2、C1、C2組初次免疫后10周，將各實驗組15只兔分別用T p.Nichols株進行背部皮內(nèi)接種，每隔3天觀察測量記錄皮損紅腫及潰瘍（紅圈示皮損紅腫大?。?。4A：A1組兔未愈合潰瘍；4B：A2組兔中等大紅腫；4C：B1組兔中等大紅腫；4D：B2組兔最小紅腫；4E：C1組兔最小紅腫；4F：C2組兔最小紅腫

Tp在感染早期主要經(jīng)泌尿生殖道黏膜侵入機體，機體黏膜局部特異性SIgA對早期抗Tp感染發(fā)揮著重要作用。理想的人用梅毒疫苗除了能激發(fā)機體全身性的系統(tǒng)免疫外，還必須能有效激發(fā)早期黏膜免疫，目前尚無有效的人用梅毒疫苗。疫苗的種類及免疫方式日趨增多，但單一疫苗類型或免疫方式均存在一定缺陷，常規(guī)的肌注核酸疫苗通常誘導局部的黏膜免疫水平很低［3，11］，我們前期［3］研究結(jié)果也證實這一缺陷，肌注pcD/Tp92免疫兔雖能激發(fā)較強的系統(tǒng)免疫應答，但局部黏膜免疫水平很低，未能獲得完全保護力。而黏膜免疫模式不但能夠誘導局部黏膜免疫，還能誘導加強一定程度的全身系統(tǒng)免疫［12-13］。CpG ODN可被樹突細胞和B細胞上Toll樣受體9識別，可誘導干擾素γ、趨化因子產(chǎn)生以及誘導Th1免疫應答［14］。因其在黏膜疫苗中作用靶點pDCs是現(xiàn)成的，作為黏膜疫苗佐劑有著良好應用前景。本研究評估了pcD/Tp92疫苗肌注初疫，pcD/Tp92聯(lián)合佐劑CpG ODN鼻飼加強免疫的接種策略（B2組），結(jié)果顯示該免疫策略誘生的系統(tǒng)免疫效應較之未聯(lián)合佐劑CpG ODN免疫策略實施組（B1組）有明顯提高，與傳統(tǒng)肌注pcD/Tp92免疫法（A2組）差異無統(tǒng)計學意義。因不同類型黏膜表面連接關系，鼻咽部及陰道部黏膜免疫SIgA分泌水平差異無統(tǒng)計學意義，而二者SIgA的水平較之B1和A2免疫策略實施組則有顯著升高，且兔背部皮膚感染位點Tp DF陽性率及潰瘍病灶形成率均有降低，但皮損愈合的時間（50 d）卻較A2組（47 d）長，表明該接種策略可誘導較強特異性黏膜免疫和系統(tǒng)免疫，增強pcD/Tp92核酸疫苗對Tp早期皮膚黏膜感染的免疫保護作用；可能也說明sIgA并非早期抗皮膚黏膜Tp感染的唯一因素，皮損愈合的時間長短不能作為客觀反映免疫保護性的指標。

蛋白合成物和多肽免疫原性較弱，加之直接免疫到黏膜位點易失效和黏膜的耐受，常需聯(lián)合佐劑加強免疫應答［15］。如將CpGODN與蛋白抗原耦合后在免疫過程中能促進蛋白抗原被組織細胞攝入，從而可以降低蛋白抗原疫苗的用量，減少疫苗的免疫次數(shù)［10］。因此，本研究評估了pcD/Tp92注初免疫，Tp92重組蛋白聯(lián)合CpGODN鼻飼加強免疫（C2組）的接種策略，研究顯示，此免疫策略誘生兔的系統(tǒng)免疫效應并不比pcD/Tp92肌注免疫2次接種策略（A2組）差，而較pcD/Tp92初次肌注免疫，Tp92重組蛋白加強免疫（C1組）的接種法有顯著提高，同時，該接種策略還促進了SIgA的分泌，增強了兔的黏膜免疫，從該組的抗Tp皮膚感染實驗皮損病灶DF陽性率（6.67%）及皮損潰瘍陽性率（6.67%）結(jié)合其皮損病灶愈合時間（44 d），其保護性效果似乎更優(yōu)于pcD/Tp92核酸疫苗肌內(nèi)注射加強免疫模式（A2組）和pcD/Tp92疫苗肌注射初免，Tp92重組蛋白抗原鼻飼加強的免疫接種法（C1組）及其他免疫接種策略（B1、B2組）。當然這幾項指標尚不能客觀準確地反映各實驗組疫苗免疫策略的保護性免疫效應，我們將在后續(xù)的研究中進一步完善實驗數(shù)據(jù)和指標，更深入地探討梅毒疫苗的免疫優(yōu)化策略。

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［9］Xiang XX,Zhou XQ,Wang JX,et al.Effects of CpG-ODNs on phenotype and function of monocyte-derived dendritic cells in chronic hepatitis B［J］.World J Gastroenterol,2011,17（43）:4825-4830.DOI:10.3748/wjg.v17.i43.4825.

［10］Zhang C,Zheng M,Zhu XH,et al.Protective effect of CpG-oligodeoxynucleotides against low-and high-LET irradiation［J］.Cell Physiol Biochem,2014,34（5）:1663-1674.DOI:10.1159/000366368.

［11］Ye T,Yue Y,Fan X,et al.M cell-targeting strategy facilitates mucosal immune response and enhances protection against CVB3-induced viral myocarditis elicited by chitosan-DNA vaccine［J］.Vaccine,2014,32（35）:4457-4465.DOI:10.1016/j.vaccine.2014.06.050.

［12］Khera AK,Afkhami S,Lai R,et al.Role of B cells in mucosal vaccine-induced protective CD8+T cell immunity against pulmonary tuberculosis［J］.J Immunol,2015,195（6）:2900-2907.DOI:10.4049/jimmunol.1500981.

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［14］Birk R,Aderhold C,H?rmann K,et al.CpG-Oligodeoxynucleotides in chronic rhinosinusitis cell culture［J］.In Vivo,2016,30（1）:47-52.PMID:26709128.

［15］De Cesare M,Sfondrini L,Pennati M,et al.CpG-oligodeoxynucleotides exert remarkable antitumor activity against diffuse malignant peritoneal mesothelioma orthotopic xenografts［J］.J Transl Med,2016,14（1）:25.DOI:10.1186/s12967-016-0781-4.

世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會第八屆中醫(yī)皮膚科國際學術大會暨2017中國中醫(yī)藥研究促進會皮膚性病學分會學術會議征文通知

由世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會皮膚科專業(yè)委員會和中國中醫(yī)藥研究促進會皮膚性病學分會聯(lián)合主辦，江蘇省中醫(yī)藥學會皮膚科分會承辦的“世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會第八屆中醫(yī)皮膚科國際學術大會”和“2017中國中醫(yī)藥研究促進會皮膚性病學分會學術會議”將于2017年8月24-26日在中國南京市舉辦。

一、征文內(nèi)容：①中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合防治皮膚性病的臨床總結(jié)、特色療法、實驗研究、文獻綜述、病例報告、經(jīng)驗體會等；②皮膚科名老中醫(yī)學術思想、流派的繼承及方法學研究；③世界各地中醫(yī)皮膚科臨床實踐和發(fā)展現(xiàn)狀介紹。

二、征文要求：論文內(nèi)容科學，資料可靠，未在正式出版物發(fā)表過。論文文責自負，字數(shù)要求中文3 000字以內(nèi)，并附中英文摘要，以word文檔格式發(fā)往郵箱 sjzyylhhpfk2009@126.com。

三、截稿日期：2017年7月30日。

聯(lián)系地址：廣州市大德路111號，廣東省中醫(yī)院皮膚科，郵編：510120；聯(lián)系人：吳元勝、李紅毅；聯(lián)系電話：86-020-81887233-30603。

第十三屆全國中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病研究進展學習班暨2017年廣東省中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學術會議征文通知

廣東省中醫(yī)藥學會皮膚病專業(yè)委員會、廣東省中西醫(yī)結(jié)合學會皮膚性病專業(yè)委員會、廣東省中醫(yī)藥學會外治法專業(yè)委員會、廣東省中醫(yī)院皮膚科（廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院皮膚科）聯(lián)合定于2017年11月23-26日在廣州市召開第十三屆全國中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病研究進展學習班暨2017年廣東省中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學術會議。會議期間同時舉辦國醫(yī)大師禤國維學術思想及流派特色技術推廣培訓班及中醫(yī)傳統(tǒng)特色療法在皮膚病領域的應用學習班。

征文內(nèi)容：①中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合防治皮膚性病的臨床總結(jié)、特色療法、實驗研究、文獻綜述、病例報告、經(jīng)驗體會等；②皮膚科名老中醫(yī)學術思想、學術流派的繼承及方法學研究。

征文要求：論文內(nèi)容科學，資料可靠，未在正式出版物發(fā)表過。論文文責自負，字數(shù)要求在中文3000字以內(nèi)，并附中文摘要，以word文檔格式，會議征文發(fā)往郵箱lihongyich@126.com，聯(lián)系人李紅毅、陳信生。聯(lián)系電話：020-81887233-30603。征文截止日期：2017年10月31日。

Optimization of strategies for inoculation of Treponema pallidum pcD/Tp92 DNA vaccine

Liu Anyuan,Tao Lijian,Zhao Tie,Zhao Feijun,Zhang Xiaohong
Xiangya School of Public Health,Central South University,Changsha 410078,China（Liu AY,Tao LJ）;Institute of Pathogenic Biology,University of South China,Hunan Provincial Key Laboratory for Special Pathogens Prevention and Control,Hengyang 421001,China（Zhang XH,Zhao FJ,Zhao T）

Zhang Xiaohong,Email:hengyangzhfj@126.com

ObjectiveTo evaluate immune protective effects ofTreponema pallidum（Tp）pcD/Tp92 DNA vaccine delivered through different inoculation routes against Tp-induced skin infection in New Zealand rabbits.MethodsA total of 108 New Zealand rabbits were randomly and equally divided into 6 groups:A1 and A2 groups treated with intramuscular injection of empty plasmids pcD and pcD/Tp92 DNA vaccine respectively for 2 sessions,B1,B2,C1 and C2 groups firstly treated with intramuscular injection of the pcD/Tp92 DNA vaccine for 1 session for primary immunization,then receiving nasogastric feeding with pcD/Tp92 DNA vaccine,pcD/Tp92 DNA vaccine+cytosine-phosphate-guanine（CpG）oligodeoxynucleotide（ODN）,and recombinant Tp92 protein,and recombinant Tp92 protein+CpG ODN respectively for booster immunization.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to detect the serum level of anti-Tp92 IgG antibody at week 0,2,4,6,8 after immunization,the SIgA level in the nasopharyngeal region and vaginal mucosa at week 8 after immunization,as well as levels of interleukin-2（IL-2）and interferon-γ（IFN-γ）in the culture supernatant of rabbit spleen cells at week 8 after immunization,and methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was performed to estimate proliferative activity of rabbit splenic lymphocytes in three rabbits from each group.At week 10 after immunization,other 15 rabbits from each group were subcutaneously inoculated with Tp standard strain,and changes of skin lesions at the inoculation site during early-stage infection were observed and recorded.ResultsAt week 8 after immunization,the C2 group showed significantly higher serum level of anti-Tp92 IgG antibody（1.825 ± 0.175）,supernatant levels of IL-2（154.7 ± 14.6）and IFN-γ（277.4 ± 24.4）,and proliferative activity of T cells（3.57 ± 0.24）compared with the A2（1.372±0.322,112.3±13.4,232.8±25.3,3.08±0.22,respectively,allP＜0.05）,B1（0.893±0.297,76.6±21.5,165.7±22.6,2.12±0.14,respectively,allP＜0.05）and B2（1.294±0.124,97.3±18.7,211.3±24.6,2.88±0.18,respectively,allP＜0.05）groups.In addition,effective immunoprotection was achieved in the C2 group with more production of mucosa-specific SIgA antibody,as well as the lowest Tp-positive rate（6.67%）and ulcer formation rate（6.67%）in skin lesions at the inoculation sites.ConclusionThe effective vaccination strategy,namely intramuscular injection of the pcD/Tp92 DNA vaccine for primary immunization followed by nasogastric feeding with mucosal adjuvant CpG ODN combined with recombinant Tp92 protein for booster immunization,can induce the strongest mucosal immune responses and immune protective effects.

Syphilis;Treponema pallidum;Vaccines;DNA;Immunity;Mucous membrane;Rabbits;Tp92;CpG-ODN

張曉紅，Email：hengyangzhfj@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.05.004

國家自然科學基金（81373230、81301470）

2016-11-15）

（本文編輯：吳曉初）