一株植物內生細菌促進香菇木腐菌糖化秸稈的研究*

葉凱霞，趙慶新，康貽軍，沈 敏，王歡莉

（1.鹽城師范學院江蘇沿海生物工程研究所，江蘇 鹽城 224051；2.南京工業大學食品與輕工業學院，南京 211800）

一株植物內生細菌促進香菇木腐菌糖化秸稈的研究*

葉凱霞1，2，趙慶新1**，康貽軍1，沈 敏1，王歡莉1

（1.鹽城師范學院江蘇沿海生物工程研究所，江蘇 鹽城 224051；2.南京工業大學食品與輕工業學院，南京 211800）

香菇類木腐菌利用水稻秸稈的基本過程，包括清除果膠與木質素屏障、釋放纖維素和半纖維素、降解纖維素和半纖維素、利用單糖等，其中清除屏障釋放纖維素和半纖維素、降解纖維素和半纖維素為糖化過程。在香樟內生菌Bacillus spp WP7和香菇（Lentinus edodes）菌株SH2184共轉化水稻秸稈體系中，在香菇菌的定植期，菌絲生長速度是對照組的279%；共轉化體系的發酵物總還原糖釋放量比對照組提高了185.0%，葡萄糖釋放量比對照組提高了262.5%，非葡萄糖釋放量比對照組提高了139.0%；共轉化體系的發酵物中果膠酶活性是對照組的127.3%，纖維素酶活與對照組接近；木聚糖酶活是對照組的75%。根據結果分析，植物內生菌釋放的果膠酶可能是共轉化秸稈體系中葡萄糖和其它單糖釋放量提高的原因之一，從而進一步促進香菇菌菌絲定植期的生長速度；另外，該植物內生菌本身可能產生抑制木糖酶活性的物質或抑制木糖酶表達的信號物質。

植物內生細菌；促進；香菇木腐菌；糖化秸稈

農作物秸稈的利用是實現農業循環發展的重要環節，秸稈轉化的方向有多糖類食品物品、能源（生物乙醇、甲醇、甲烷）、飼料、肥料、食 (藥)用真菌菌體等多個方向，上述各方向轉化遇到的共性問題是如何有效去除秸稈屏障，秸稈屏障（straw barrier）是指秸稈細胞壁中包裹在纖維素和半纖維素網絡表面和沉積在網孔中的一些物質，在秸稈轉化過程中，它們阻礙纖維素和半纖維素的釋放與糖化[1-2]。

香菇等木腐菌糖化利用水稻秸稈纖維素與半纖維素的基本過程，與其它方向的秸稈纖維素與半纖維素利用過程類似，主要包括清除屏障釋放纖維素和半纖維素、纖維素和半纖維素糖化、單糖的利用等三階段，其中清除屏障釋放纖維素和半纖維素是其第一步，也是限速步驟[3-5]。秸稈利用過程中，清除秸稈屏障的主要方法有物理法、化學法和生物法，物理法能源消耗大，化學法帶來環境次生污染，微生物法具有低能耗和低污染的優勢[1-3]。目前，用來去除秸稈屏障的微生物主要有白腐菌和腸道菌等，白腐菌主要用在秸稈能源領域[6]，腸道菌主要用在食用菌與藥用菌秸稈轉化領域[7]。在腐生真菌降解利用秸稈領域，破除秸稈屏障的機制研究主要涉及腐生真菌本體的基因與酶研究[8-10]和腸道菌破除屏障的基因與酶研究[4，7]，而且重點聚焦木質素及其降解酶類。現有研究報道表明，使用腸道菌破除降解秸稈屏障的方法，對蘑菇等草腐菌具有較好的協同效果，但對于香菇的協同效果較差[8，11]。其主要原因，一方面可能是源自木腐菌和草腐菌的基因與蛋白酶的差異，因為香菇屬于木腐菌，與草腐菌相比，在基因組方面存在顯著的差異，導致香菇類木腐菌對主要農作物秸稈（水稻秸稈、小麥秸稈和玉米秸稈等禾本科秸稈）降解能力差，不能破除一些特殊的屏障物質；另一方面，可能是由于腸道菌菌群的基因組成與表達特性，不能與香菇屬木腐菌的基因與酶蛋白之間形成互補。

本課題初步研究了1種植物內生細菌促進香菇菌糖化水稻秸稈的機理，報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究所用菌株為香樟內生菌Bacillus spp WP7（簡稱WP7），由鹽城師范學院江蘇沿海生物工程研究所分離保存；所用香菇菌株2184（SH2184）由連云港石湖食用菌有限公司提供。

1.2 主要試劑與材料

木聚糖酶與果膠酸降解酶的底物木聚糖與果膠來自SIGMA公司；酵母提取物與胰蛋白胨來自OXOID公司；葡萄糖測定試劑盒來自蘇州科銘生物技術有限公司；木屑、麩皮、水稻秸稈由連云港石湖食用菌有限公司提供。秸稈用前預處理，將秸稈剪成1 cm～2 cm小段，用2%NaOH浸泡24 h，清水洗至中性，晾干。

1.3 培養基的配制

LB液體培養基配方（1 000 mL）：NaCl 10 g、蛋白胨10 g、酵母提取物5 g[12]。

香菇一級種培養基（PDA）配方見參考文獻 [13]。

香菇二級種與三級種培養基配方為：果樹木屑39%、秸稈39%、麥麩20%、石膏1%、蔗糖1%，含水量為60%。秸稈使用前預處理，將秸稈剪成1 cm～2 cm小段，用2%NaOH浸泡24 h，清水洗至中性，晾干。在溫度121℃，1.5大氣壓條件下，滅菌20 min。

香菇糖化秸稈培養基配方：秸稈78%、麥麩20%、石膏1%、蔗糖1%，含水量為60%。在121℃，1.5大氣壓條件下，滅菌20 min。

1.4 細菌菌種制備

提前1 d進行細菌的活化，使用LB液體培養基，37℃培養，200 r·min-1，培養10 h，第2天轉接培養8 h，用無菌的生理鹽水清洗后備用。

1.5 香菇菌種制備

香菇一級種制備：用PDA培養基進行香菇一級種的擴接和放大，靜置，無光，溫度25℃，培養8 d；香菇二級種制備：將香菇一級種接種到二級種培養基中，靜置，無光，溫度25℃，培養25 d；香菇三級種制備：將香菇二級種接種到三級種培養基中，靜置，無光，溫度25℃，培養25 d。

1.6 細菌與香菇聯合轉化秸稈

將用無菌生理鹽水清洗后的細菌菌種和香菇三級種同時接種到香菇糖化秸稈培養基，靜置，無光，溫度25℃，培養6 d，測量菌絲生長速度、培養物中還原糖量和有關多糖酶的活性。

1.7 定植期生長速度測定

在細菌與香菇共轉化秸稈的第6天，測量試驗組（內生菌與香菇共轉化水稻秸稈）和對照組（香菇菌SH2184獨自轉化水稻秸稈）轉化瓶不同部位內菌絲的生長長度，計算平均長度和菌絲生長速度。

1.8 聯合轉化體系的糖樣品和酶樣品的制備

取10 mg培養物，加10 mL的10 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH7.5） 重新懸浮，溫度0條件下抽提2 h，14 000 r·min-1條件下離心10 min，收集上清，作為聯合轉化體系的糖樣品和酶樣品。

1.9 葡萄糖與還原糖檢測

葡萄糖根據試劑盒說明書，還原糖檢測體系為：上清0.5 mL，加入0.5 mL dinitrosalicylic acid（DNS）試劑[14]，然后檢測520 nm處的吸收值，再根據標準曲線回歸方程，換算得到還原糖濃度。

1.10 酶活檢測

纖維素酶酶活檢測的反應體系為：反應液0.5 mL，內含 20 mmol·L-1磷酸緩沖液 （pH 7.5），0.1%纖維素鈉和適量的酶，在40℃反應10 min。為了檢測反應體系中產生的還原糖量，加0.5 mL的dinitrosalicylic acid（DNS） 試劑終止反應，然后檢測520 nm處的吸收值，再根據標準曲線回歸方程，換算得到還原糖濃度，計算裂解細胞上清的每毫升體積所含的總酶活，再計算相對于每毫升菌體培養液體積的總酶活。一個酶活單位定義為每分鐘釋放的還原糖等同1 mol葡萄糖（galacturonicacid）的酶量。

木聚糖酶活檢測的反應體系為：反應液0.5 mL，內含20 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.5），0.1%木聚糖和適量的酶，在40℃反應10 min。為了檢測反應體系中產生的還原糖的量，加0.5 mLDNS試劑終止反應，然后檢測520 nm處的吸收值，再根據標準曲線回歸方程，換算得到還原糖濃度，計算裂解細胞上清的每毫升體積所含的總酶活，再計算相對于每毫升菌體培養液體積的總酶活。一個酶活單位定義為每分鐘釋放的還原糖等同1 mol木糖的酶量。

果膠酸裂解酶活檢測的反應體系為：0.5 mL反 應液，內含 20 mmol·L-1Tris-HCl（pH7.5）、1 mmol·L-1CaCl2、0.1%果膠酸和適量的酶，在40℃反應10 min。為了檢測反應體系中產生的還原糖的量，加0.5 mLDNS試劑終止反應，然后檢測520 nm處的吸收值，再根據標準曲線回歸方程，換算得到還原糖濃度，計算裂解細胞上清的每毫升體積所含的總酶活，再計算相對于每毫升菌體培養液體積的總酶活。一個酶活單位定義為每分鐘釋放的還原糖等同1 mol半乳糖醛酸的酶量[12]。

2 結果與分析

2.1 共轉化秸稈體系中香菇菌絲定植期的生長速度

香菇菌絲生長速度見表1。定植期為6 d，測量6 d內菌絲生長的長度，計算6 d菌絲的生長速度。以香菇獨自轉化秸稈為對照（作為100%）。

在植物內生菌WP7和香菇SH2184共轉化水稻秸稈體系中，在香菇的定植期，菌絲生長速度是2.21 mm·d-1，是對照組的279%，接近300%。

表1 香菇菌絲生長速度Tab.1 Growth rate of Lentinus edodes mycelium

2.2 共轉化秸稈體系中還原糖的釋放

在植物內生菌WP7和香菇SH2184共轉化水稻秸稈體系中，對菌絲生長區的培養物中糖釋放進行檢測見圖1。

圖1 植物內生菌（WP7） 與香菇（SH2184） 共轉化水稻秸稈的發酵物中糖化效果Fig.1 Saccharification effect on the system of plant endophytic bacteria(WP7)and Lentinus edodes(SH2184)degrading and transforming rice straw

共轉化體系的發酵物中總還原糖釋放量為11.5 mol·g-1，其中葡萄糖釋放量為 6.3 mol·g-1，非葡萄糖釋放量為5.3 mol·g-1（圖1）。共轉化體系的發酵物總還原糖釋放量比對照組提高了185.0%，葡萄糖釋放量比對照組提高了262.5%，非葡萄糖釋放量比對照組提高了139.0%。

2.3 共轉化秸稈體系中幾類多糖降解酶活性

植物內生菌（WP7） 與香菇（SH2184） 共轉化水稻秸稈的發酵物中，果膠酶、纖維素酶與木聚糖活性見圖2。

在植物內生菌WP7和香菇SH2184共轉化水稻秸稈體系中，對菌絲生長區培養物中幾種多糖降解酶的活性檢測表明，共轉化體系發酵物中纖維素酶活為430 U·g-1，與對照組接近；木聚糖酶活為210 U·g-1，是對照組的75%，降低了25%；果膠酶活性是對照組的127.3%，增加了27.3%。

圖2 植物內生菌（WP7） 與香菇（SH2184） 共轉化水稻秸稈發酵物中果膠酶、纖維素酶與木聚糖活性Fig.2 Enzyme activity of pectinase,cellulase and xylanase from the system of plant endophytic bacteria(WP7)and Lentinus edodes(SH2184)degrading and transforming rice straw

2.4 WP7細菌天然狀態下產幾類多糖降解酶的效果

正常培養條件下，植物內生菌WP7在LB培養基中果膠酶、纖維素酶與木聚糖酶活性見圖3。

圖3 植物內生菌WP7在LB培養基中果膠酶、纖維素酶與木聚糖酶活性Fig.3 Enzyme activity of pectinase,cellulase and xylanase from the culture of WP7 in LB medium

從圖3可以看出，果膠酶活性達到400 U·mL-1，纖維素酶活僅僅為44 U·mL-1，而且未檢測到木聚糖酶活。

3 討論

3.1 共轉化秸稈體系中葡萄糖釋放量提高可能是香菇菌菌絲定植期生長速度增加的原因之一

香菇菌菌絲的定植期生長速度易受到培養基質中容易吸收的成分，特別是葡萄糖和木糖等單糖的影響。共轉化體系的發酵物中總還原糖釋放量檢測表明，共轉化體系的發酵物總還原糖釋放量比對照組提高了185.0%，進一步檢測顯示葡萄糖的提高量高于木聚糖等非葡萄糖的提高量（葡萄糖釋放量和非葡萄糖釋放量分別比對照組提高262.5%和139.0%）。

3.2 植物內生菌釋放的果膠酶可能是共轉化秸稈體系中葡萄糖釋放量提高的原因之一

對在植物內生菌WP7和香菇SH2184共轉化水稻秸稈培養物中幾種多糖降解酶的活性檢測表明，植物內生菌WP7使用僅增加了共轉化體系的果膠酶活性，與對照組相比增加了27.3%，結果提示，果膠酶可能是引起共轉化秸稈體系中葡萄糖釋放量提高的重要原因；進一步對植物內生菌WP7的天然產酶特性進行研究表明，正常培養條件下在LB培養基中，果膠酶活性達到為400 U·mL-1，纖維素酶活僅為44 U·mL-1，未檢測到木聚糖酶活，進一步驗證果膠酶可能是引起共轉化秸稈體系中葡萄糖釋放量提高的重要原因。前人研究顯示，果膠是植物細胞壁材料中的重要成分[14-15]，本文通信作者前期研究成果顯示，果膠對細胞壁的硬化具有重要的作用[16]，在秸稈降解中會影響纖維素酶和半纖維素酶的作用。關于消除秸稈降解細菌的果膠酶的研究顯示，消除秸稈降解細菌的果膠酶基因會顯著降低細菌對秸稈的利用效果[17]，另外關于香菇等木腐菌果膠酶的研究顯示，香菇木腐菌產果膠酶的效率很低，在10 U·mL-1左右[18]。所以，本研究使用細菌果膠酶在該細菌和香菇共轉化秸稈系統中，對香菇菌轉化秸稈可能是一種重要的協同因子。

3.3 共轉化體系木聚糖酶活性下降和非葡萄糖還原糖增加的原因

在植物內生菌WP7和香菇SH2184共轉化水稻秸稈培養物中幾種多糖降解酶的活性檢測中，發現植物內生菌WP7使用還降低了共轉化體系中木聚糖酶活性，而且植物內生菌本身的木糖酶的活性也未檢測到，說明植物內生菌本身可能產生抑制木糖酶活性的物質或抑制木糖酶表達的信號物質。導致共轉化體系中非葡萄糖還原糖增加的原因，可能是果膠酶等因素增加了培養物中已有木聚糖酶等半纖維素酶與底物的接觸機會。

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中國食用菌雜志編輯部

2017年9月10日

One Plant Endophytic Bacteria Promoting on Lentinus edodes Wood-rotting Fungi Saccharifying Rice Straw

YE Kai-xia1,2,ZHAO Qing-xin1,KANG Yi-jun1,SHEN Min1,WANG Huan-li1
(1.Bioengineering Institute of Jiangshu Costal,Yancheng Teachers University,Yancheng 224051,China;2.College of Food Science and Light Industry,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

The process of Lentinus edodes wood-rotting fungi degrading and transforming rice straw was composed of breaking the straw barrier(such as pectin and lignin)to release cellulose and hemicellulose,saccharifying cellulose and hemicellulose to monose and oligosaccharide,and transforming monose to other substances.In the system of plant endophytic bacteria and L.edodes transforming rice straw,the growth rate of L.edodes mycelium during 6 d colonization was 279%of the control system.Compared with the control group,the release amount of the total reduction sugar,glucose and non-glucose from the system of plant endophytic bacteria and L.edodes was increased by 185.0%,139.0%and 262.5%,respectively.The activity of pectinase and xylanase from the system of plant endophytic bacteria and L.edodes was 127.3%and 75%of that in the control group,and the cellulase activity was close to that of the control group.This results might implied that the pectin from the plant endophytic bacteria might be an important factor for promoting the release amount of glucose and other monosaccharide,which further promote the growth rate of L.edodes mycelium during the colonization period.Additionally,plant endophytic bacteria might produce one or more substance for inhibiting the activity of xylanase or for depressing the expression of xylanase genes.

plant endophytic bacteria;promote;Lentinus edodes wood-rotting fungi;saccharifying rice straw

S646.1

A

1003-8310（2017）05-0067-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.05.016

國家自然科學基金項目（41501256）；江蘇省鹽土生物資源重點實驗室（JKLBS2012023）。

葉凱霞（1993-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向為木質纖維素糖化。E-mail:

**通信作者：趙慶新（1966-），博士，教授，主要從事微生物工程與蛋白工程研究。E-mail:zhaoqingxinjs@aliyun.com

2017-07-10