適宜黑牛肝菌菌絲生長的合成培養基及主要環境條件*

羅順珍，紀光玉，紀光燕，黃海濤，金 福，紀開萍

（云南省景洪市宏臻農業科技有限公司，云南 景洪 666100）

適宜黑牛肝菌菌絲生長的合成培養基及主要環境條件*

羅順珍，紀光玉，紀光燕，黃海濤，金 福，紀開萍**

（云南省景洪市宏臻農業科技有限公司，云南 景洪 666100）

在以馬鈴薯為主要成分的半人工合成培養基基礎上，研究替代馬鈴薯的全合成培養基及主要環境條件（溫度、pH）對黑牛肝菌（Phlebopus portentosus）菌絲生長的影響。結果表明，半人工合成培養基去除馬鈴薯，增加尿素、硫酸銨、蛋白胨等氮源0.5 g·L-1和氧化鈣（無機鹽0.2 g·L-1）對黑牛肝菌菌絲生長有很明顯的促進作用。主要環境條件中，適宜溫度為28℃～33℃，適宜pH為5～7。

黑牛肝菌；合成培養基；營養需求；環境條件

黑牛肝菌 [Phlebopus portentosus（Berk.&Broome）Boedi jn.]，又名暗褐網柄牛肝菌，隸屬于擔子菌門（Basi-diomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 牛肝菌目（Boletales） 小牛肝菌科（Boletinellaceae） 脈柄牛肝菌屬（Phlebopus）[1]，分布于斯里蘭卡、越南、印度尼西亞、泰國、巴西、墨西哥、澳大利亞、新西蘭等國家，國內廣西、海南、云南等省均有分布[2-7]，其子實體味道鮮美，營養豐富，具有很高的經濟價值。目前黑牛肝菌已實現人工栽培[8]，液體菌種是黑牛肝菌人工栽培及工廠化栽培的發展方向。本研究旨在用合成培養基代替以馬鈴薯為主要營養成份的半人工培養基，培養液體菌種用于黑牛肝菌人工栽培制種，降低成本，縮短菌絲培養周期，提高黑牛肝菌的生產效益。根據何明霞等[9]暗褐網柄牛肝菌菌絲培養基的碳源、氮源及無機鹽的篩選研究，以及以黑牛肝菌菌絲體培養基的碳源、氮源及無機鹽的篩選研究中所用的碳源、氮源、無機鹽種類及使用的量作為參考[10-12]，精細化培養基，以求找到代替馬鈴薯的配方，達到減小生產成本的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：宏臻農業科技有限公司生產所用菌株HZ14080；以馬鈴薯為主要成分的半人工合成培養基M1；去除馬鈴薯半人工合成培養基M2。

1.2 方法

1.2.1 碳源實驗

在培養基M2中分別添加2 g·L-1的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉，觀測不同碳源對黑牛肝菌菌絲生長的影響。

1.2.2 氮源試驗

在培養基M2中分別添加0.5 g·L-1的牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、氯化銨、酒石酸銨、硝酸鉀、尿素等，觀測不同氮源對黑牛肝菌菌絲生長的影響。

1.2.3 無機鹽試驗

在培養基M2中分別添加0.2 g·L-1的硫酸鎂、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硝酸鉀、氧化鈣、碳酸鈣、氯化鈉、酒石酸鉀鈉等。觀察不同無機鹽對黑牛肝菌菌絲生長的影響。

1.2.4 溫度試驗

以M1為菌絲生長培養基，設置25℃、27℃、29℃、31℃、33℃五個溫度梯度，觀測不同溫度對黑牛肝菌菌絲生長的影響。

1.2.5 pH試驗

以M1為菌絲生長培養基，設置pH為4、5、6、7、8五個梯度的基礎培養基（用0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1HCl調節pH，使用pH計進行pH測量）[10]。觀測不同pH對黑牛肝菌菌絲生長的影響。

1.2.6 接種培養與數據分析

所有試驗均于平板中央接種1塊直徑7 mm的活化菌絲塊，于29℃下恒溫培養（溫度試驗則在設定的恒溫下培養），定期（10 d、15 d、20 d、25 d、30 d）用十字交叉法[11]，測量菌落直徑；每一試驗每一處理設3次重復，試驗結果進行統計分析，采用LSD法比較差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 碳源對黑牛肝菌絲生長的影響

碳源對黑牛肝菌絲菌絲生長的影響情況見表1、圖1。

表1 不同碳源對黑牛肝菌菌絲生長速度及生長勢的影響Tab.1 Effects of different carbon sources on growth rate and growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

圖1 M2培養基中加入不同碳源后菌絲生長情況Fig.1 Growth of the Phlebopus portentosus mycelium in the M2 medium added the different carbon sources

表1和圖1結果表明，菌絲在M1培養基上生長速度最快0.25 cm·d-1，M2基礎培養基中加入5種不同碳源時菌絲生長速度反而變慢，M2中添加蔗糖、果糖、淀粉、乳糖、葡萄糖后菌絲平均每天生長速度分別為 0.222 cm·d-1、0.223 cm·d-1、0.202 cm·d-1、0.222cm·d-1、0.225 cm·d-1。從圖 1 可以看出，M2 培養基加入不同碳源后，培養至第10天時不同碳源間菌絲長勢差異明顯，第15天時菌絲長勢相似，第20天時添加淀粉的菌絲長勢最差，對照M1中菌絲長勢最好；第20天至第30天時依然是添加淀粉的菌絲長勢最差，對照M1中菌絲長勢最好；添加蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖的菌絲長勢雖然有浮動，但浮動不大。結合表1結果，得出在試驗所用的基礎培養基中分別添加葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、乳糖時菌絲的生長速度慢，與對照相比存在顯著差異。在試驗中觀察到額外添加碳源的實驗中菌絲顏色變黑，極易出現菌絲不長和老化的現象。

綜合試驗結果得出，M2培養基中無需再增加碳源，馬鈴薯在培養基M2中主要的作用并非提供碳源成分，M2培養基中的碳源已為最佳用量，故無需再加入其他碳源。

2.2 氮源對黑牛肝菌菌絲生長的影響

培養基M2加入不同氮源對黑牛肝菌菌絲生長的影響見表2、圖2。

表2 不同氮源對牛肝菌菌絲生長速度和生長勢的影響Tab.2 Effects of different nitrogen sources on growth rate and growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

圖2 M2培養基中加入不同氮源后菌絲生長情況Fig.2 Growth of the Phlebopus portentosus mycelium in the M2 medium added the different nitrogen sources

從圖2和表2可知，在試驗所用的基礎培養基中分別添加0.5 g·L-1的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素時，與對照相比，菌絲的長勢優于未加氮源的M2。其中尿素明顯促進菌絲生長，在加入尿素的M2培養基上菌絲生長最快且最為健壯，邊緣整齊，顏色呈嫩黃色，與其他氮源處理菌絲生長速度相比差異達極顯著水平。尿素是完全合成培養基中牛肝菌菌絲生長的最佳氮源，其次是酵母浸膏、硫酸銨、牛肉膏和蛋白胨。綜合結果可知，黑牛肝菌菌絲培養中，馬鈴薯可能提供部分的氮源成分，同時亦可以說明無機氮源和有機氮源可以進行復合使用，且在原有的配方上可以適量調整碳氮比。

本實驗中，M2添加尿素促進菌絲的生長，與何明霞等[12]在氮源篩選時尿素抑制菌絲生長的結論相反，有待于進一步試驗和驗證。

2.3 無機鹽對黑牛肝菌菌絲生長的影響

不同無機鹽對黑牛肝菌菌絲生長的影響結果見表3、圖3。

表3 不同無機鹽對黑牛肝菌菌絲生長速度及生長勢的影響Tab.3 Effects of different inorganic salts on growth rate and growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

圖3 M2培養基中加入不同無機鹽后菌絲生長情況Fig.3 Growth of Phlebopus portentosus mycelium in M2 medium added the different inorganic salts

在M2添加9種無機鹽，均對菌絲的生長有抑制作用，且易出現菌絲老化，但添加氧化鈣或碳酸鈣時，菌絲比對照菌絲粗壯。加入磷酸二氫鉀時，對菌絲的抑制作用最為顯著。

2.4 pH對黑牛肝菌菌絲生長的影響

不同pH對黑牛肝菌菌絲長勢的影響見圖4。

根據圖4可以得出，黑牛肝菌在pH4～8的范圍內均可生長，pH5～7為適宜的pH范圍。在此范圍內，不同pH處理的菌絲生長速度間差異不顯著，但與其他pH處理的菌絲生長速度間差異達顯著或極顯著水平。pH小于8時，菌絲不僅生長速度快，而且生長健壯，隨著pH的升高，菌絲生長速度減慢，而且細弱。pH為5時菌絲生長速度最快、最健壯，pH為8時菌絲長勢最差。可以看出菌絲的長勢隨pH升高，生長速度減慢。不同pH對菌絲的生長有一定的影響，但影響不大，黑牛肝菌菌絲適宜pH范圍與褐環粘蓋牛肝菌菌絲生長的pH范圍相同[13]。

圖4 不同pH對黑牛肝菌菌絲長勢的影響Fig.4 Influence of different pH value on the growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

2.5 溫度對黑牛肝菌絲生長的影響

不同培養溫度對黑牛肝菌絲長勢的影響情況見圖5。

圖5 不同培養溫度對黑牛肝菌菌絲長勢的影響Fig.5 NInfluence of different culture temperature on the growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

黑牛肝菌在25℃～33℃菌絲均能生長。31℃時，菌絲生長速度最快，達2.46 mm·d-1，超過31℃，菌絲生長速度迅速下降；在25℃菌絲生長速度最慢。試驗中黑牛肝菌菌絲生長的適宜溫度為27℃～31℃，與王文斌等[12]暗褐網柄牛肝菌菌絲深層發酵培養實驗中得出牛肝菌菌絲適宜生長溫度為29℃～31℃基本一致。菌絲的生長速度快，有利于縮短黑牛肝菌的生長周期。縮短菌絲生長周期對減少生產成本有重大意義。

3 討論

黑牛肝菌作為優質珍稀食用菌，其生物學特性、遺傳育種和高產栽培研究在我國的報道尚不多見。關于牛肝菌培養基配方的試驗有很多的報道，其中以何明霞等[9]黑牛肝菌菌絲體培養基的碳源、氮源及無機鹽的篩選研究中得出的結果重復性更強，更有借鑒作用。

目前食用菌大多采用半人工培養基進行培養，很少有合成培養基的相關報道。試驗借助于前人對牛肝菌培養基的研究，主要突破點，即找到代替馬鈴薯的物質，得出化學成分及物質含量的準確數值，從而使生產及分析更方便快捷。

氮源試驗中，在試驗所用的基礎培養基中添加適量的氮源時，如尿素、硫酸銨、蛋白胨等，對菌絲的生長有促進作用，且菌絲生長健壯。同時在黑牛肝菌栽培中，無機氮源和有機氮源可以進行復合使用，且在原有的配方上可以適量調整碳氮比。

研究結果表明，牛肝菌菌絲在20℃～35℃時均能生長；在本試驗中，黑牛肝菌菌絲在31℃生長速度更快。菌絲生長速度快有利于縮短黑牛肝菌的生長周期，減少生產成本。

黑牛肝菌菌絲生長的pH范圍為4～10，最適pH范圍為5～7。但用自來水配出的培養基pH為5.8左右，為簡化生產所以不調整pH。

[1]曹旸，紀開萍，劉靜，等.暗褐網柄牛肝菌人工栽培中不同覆土材料理化性質及其對出菇的影響[J].云南農業科技，2012（1）：10-11.

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[13]蔡楠楠.褐環粘蓋牛肝菌菌絲與培養基pH的互通作用[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2011：1-40.

Synthetic Medium and Main Environmental Conditions Suitable for Mycelium Growth of Phlebopus portentosus

LUO Shun-zhen,JI Guang-yu,JI Guang-yan,HUANG Hai-tao,JIN Fu,JI Kai-ping
(Hongzhen Agricultural Science and Technology Co.Ltd.,Jinghong 666100,China)

On the basis of half synthetic medium with potato as the main composition,the effect of whole synthetic medium and environmental conditions on mycelium growth of Phlebopus portentosus was studied.The results showed that the semi-artificial medium was used to remove the potato and increase the nitrogen sources such as urea,ammonium sulfate,peptone(0.5 g·L-1)and calcium oxide(inorganic salt 0.2 g·L-1),which had a significant effect on the mycelium growth of P.portentosus.The optimum growth temperature of P.portentosus was 28℃-33℃,pH was 5-7.

Phlebopus portentosus;synthetic medium;nutritional requirements;environmental conditions

S646.9

A

1003-8310（2017）05-0045-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.05.011

云南省科技富民強縣計劃（2015EB056）；西雙版納州科技三項費（201504）。

羅順珍（1992-），女，本科，實習研究員，主要從事黑牛肝菌栽培研究。E-mail:515170711@qq.com

2017-07-15