HPLC在百草枯濃度檢測(cè)中的應(yīng)用研究

楊京霞，隋娟娟，姬云濤

（1.阜陽(yáng)師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037；2.安徽省抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽(yáng) 236037；）

HPLC在百草枯濃度檢測(cè)中的應(yīng)用研究

楊京霞1,2，隋娟娟1，姬云濤1

（1.阜陽(yáng)師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037；2.安徽省抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽(yáng) 236037；）

建立一種快速檢測(cè)病人血清中百草枯濃度的方法。本文采用乙腈沉淀血液中蛋白，色譜柱為島津vp-ODS柱，以乙腈-0.02 mol/L辛烷基磺酸鈉（4∶6）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，PDA檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm，柱溫25℃。結(jié)果是在0.1～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 3）；回收率為94.87%～105.51%；精密度RSD值為3.08%，重復(fù)性RSD值為2.26%。以該色譜條件對(duì)某患者的血清進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算得血清中百草枯濃度為5.91 μg/mL。實(shí)驗(yàn)證明本方法蛋白沉淀完全，沒有雜質(zhì)峰干擾，出峰時(shí)間較早，靈敏度高，可快速檢測(cè)病人血清中百草枯濃度，為臨床治療提供參考。

HPLC法；血清；百草枯濃度

百草枯（PQ），又名克無蹤、對(duì)草快，為快速觸殺型季胺鹽類除草劑，對(duì)人、畜都有較強(qiáng)的毒性，可經(jīng)口服、皮膚滲透等被吸收，造成急性中毒。由于目前還沒有特效的解毒劑，中毒后死亡率較高[1-2]，并且PQ在中毒患者血清中的濃度與死亡率密切相關(guān)，因此對(duì)病人血清中百草枯濃度的檢測(cè)對(duì)臨床治療十分重要。目前其檢測(cè)方法多為氣質(zhì)聯(lián)用法[3]、毛細(xì)管電泳法[4-6]、分光光度法[7]等，但這些方法有的儀器昂貴如液相串聯(lián)質(zhì)譜法[8]，有的樣品制備過程比較繁瑣如固液萃取[9-11]，還有的回收率較低（如低、中、高3種濃度的加樣回收率分別為90.5%、91.5%、87.4%），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差稍高（5%～10%）等[8]。本實(shí)驗(yàn)中采用乙腈去蛋白法離心后取病人血清，建立高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)病人血清中PQ濃度，該方法能快速準(zhǔn)確的測(cè)定病人血清中百草枯濃度，準(zhǔn)確性和靈敏度也相對(duì)較高，可以為臨床百草枯中毒患者的血清濃度進(jìn)行檢測(cè)，為評(píng)估中毒情況和臨床治療提供條件依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津），SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-M20A檢測(cè)器；MiniSpin(R)plus個(gè)人型高速離心機(jī)，真空抽濾泵等。

1.2 試劑

PQ標(biāo)準(zhǔn)品（青島豐邦農(nóng)化有限公司，20140414），辛烷基磺酸鈉，磷酸，乙腈（色譜純），高氯酸，三氯甲烷，離子水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱為島津VP-ODS柱（4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.02 mol/L辛烷基磺酸鈉緩沖液(4∶6)，用 0.26 mol/L磷酸調(diào) pH值為 2.5；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm；柱溫：25℃。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

準(zhǔn)確量取百草枯標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用去離子水稀釋成100 μg/mL溶液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 病人血樣的制備

將病人血樣置于4℃冰箱中，30 min后精密吸取析出的血清200 μL于離心管中，加入乙腈400 μL，渦旋混合 1 min，3500 rpm 離心 10 min，取上清液，然后10 000 rpm離心10 min，取上清液100 μL放入進(jìn)樣瓶，按2.1色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)其峰面積。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

用健康人血按2.3節(jié)樣品處理的方法得到血清，分別配制 0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/mL的百草枯含藥血清溶液，進(jìn)樣量為2 μL，按2.1色譜條件進(jìn)樣分析測(cè)其峰面積。以百草枯濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到PQ的回歸方程為y=6 560.7x－4 577.3，r=0.999 3。

2.4.2 回收率試驗(yàn)

配制低、中、高三種濃度（5 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL)的PQ標(biāo)準(zhǔn)血樣各5份，按2.3樣品制備方法處理后進(jìn)樣分析，分別測(cè)定各濃度下樣品的平均峰面積，將所得數(shù)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算實(shí)際濃度，并與理論濃度相比計(jì)算PQ的回收率分別為94.87%、95.79%、105.51%。

2.4.3 精密度試驗(yàn)

配制已知濃度（10 μg/mL）的PQ血清樣品5份，按2.3樣品制備方法處理后進(jìn)樣分析，測(cè)得該濃度下的峰面積的RSD值為3.08%，表明該方法的精密度較高。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

配制已知濃度（10 μg/mL）的PQ血清樣品5份，3 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣，測(cè)得峰面積的RSD值為2.26%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性較好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制已知濃度（10 μg/mL）的PQ血清樣品，按樣品處理方法處理進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，考察室溫放置24 h、48 h的穩(wěn)定性，結(jié)果測(cè)得峰面積的RSD值為1.47%，說明室溫條件下百草枯比較穩(wěn)定。

3 樣品分析結(jié)果

采集患者王某靜脈血,按血清樣品制備方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析，檢測(cè)出的峰面積為47 826，百草枯對(duì)照品（100 μg/mL）峰面積平均值（n≥5）為809 727，以外標(biāo)法計(jì)算病人血清中百草枯的濃度為 5.91 μg/mL，色譜結(jié)果如圖 1～2。

4 討論

4.1 樣品處理方法的討論

在本實(shí)驗(yàn)樣品處理過程中，先后采用四種不同的方法進(jìn)行蛋白沉淀，分別是方法一：用30%高氯酸和三氯甲烷沉淀蛋白，4 000 rpm離心后取上清進(jìn)樣。方法二：30%高氯酸沉淀蛋白，混旋2min后置于4℃冰箱中保存10 min，12 000 rpm下離心后取上清進(jìn)樣。方法三：方法二中得到的上清液再加入30%高氯酸，離心后取上清液進(jìn)樣分析。方法四：加入乙腈沉淀蛋白，渦旋混勻，離心后取上清液進(jìn)樣分析。四種方法所得的色譜圖見圖3～6。結(jié)果可知用乙腈做為蛋白沉淀試劑，可使蛋白沉淀完全，在檢測(cè)中未有干擾組分，血樣中的內(nèi)含物質(zhì)與百草枯分離完全，且峰型較好，所以最終確定乙腈沉淀蛋白。

圖1 百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 待測(cè)病人血清色譜圖

圖3 方法一病人血清色譜圖

圖4 方法二病人血清色譜圖

圖5 方法三病人血清色譜圖

圖6 方法四病人血清色譜圖

4.2 百草枯在全血和血清中含量的討論

本實(shí)驗(yàn)研究了百草枯在健康人全血和血清中的濃度差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明將已知濃度的百草枯加入健康人血液按2.3節(jié)處理后進(jìn)樣分析和取健康人血清直接加入已知濃度的百草枯后進(jìn)樣分析，所得結(jié)果存在明顯差異，大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明差值范圍在27%～31%，說明在樣品處理過程中百草枯有一定損失，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)該把這種損失考慮在內(nèi)。由已檢測(cè)140多名患者可知，病人血清百草枯濃度多集中在0.2～5.0 μg/mL。因此，確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍0.1～100 μg/mL較符合臨床實(shí)際。

[1]杜寶順，翟德勝，范文燕，等.百草枯半數(shù)致死量測(cè)定[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，23（2）：161-162．

[2]李 強(qiáng)，劉海英，王玉紅，等.百草枯中毒患者免疫功能改變及臨床意義[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，23（6）：575-576．

[3]孫世義，王 翠，羅曉芳．分光光度法快速測(cè)定尿中百草枯[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（5）：819-819,874．

[4]Nun E Z O,Monyan O E,Galceran M T.Solid-phase extraction and sample tacking-capillary electrophoresis for the determination of quaternary ammonium herbicides in drinking water[J].Journal of ChromatographyA,2002,946:275-285.

[5]Nun E Z O,Kim J B,Moyan O E,et al.Analysis of the herbicides paraquat,diquat and difenzoquat in drinking water by micellar electr kinetic chromatography using sweeping and cation selectirc exhaustive injection[J].Journal of ChromatographyA,2002,961:65-75.

[6]Mallat E,Barzen C,Abuknesha R,et al.Fast determination of paraquat residues in w at er by an optical immuno sensor and validation using capillary electrophoresis ultrariolrt detection[J].Analytica Chimaca Acta,2001,427:165-171.

[7]麥劍平，許啟榮．血液中百草枯的GC-MSD快速檢測(cè)法[J].職業(yè)與健康，2004，20（4）：40-40．

[8]晏曉軍，黨富生，吳 海，等.LC-Q/TOF法測(cè)定全血中百草枯[J].海峽藥學(xué)，2015，27（12）：255-256．

[9]Whitehead R D,Montesano M A,Jayatilaka N K,et al.Method for measurement of the quaternary amine compounds paraquat and diquat in human urine using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography.B,Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences,2010,878(27):2548-2553.

[10]趙燕燕，劉會(huì)芳，郝麗娜，等.血中百草枯的紫外分光光度測(cè)定法[J].環(huán)境與健康雜志，2007，24（5）：346-347．

[11]孫世義，王 翠，羅曉芳.分光光度法快速測(cè)定尿中百草枯[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（5）：819-819,874．

Detection of paraquat concentration using high performance liquid Chromatography

YANG Jing-xia1,2,SUI Juan-juan1,JI Yun-tao1

(1.School of Biological and Food Engineering,Fuyang Normal University,Fuyang,Anhui,236037,China;2.Engineering Technology Research Center of Anti-aging Chinese Herbal Medicine of Anhui Province,Fuyang Anhui 236037,China)

To establish a rapid method for the determination of paraquat in patient's serum,this analysis used acetonitrile to precipitate protein in the blood and conducted on a vp-ODS column.The mobile phase consists of acetonitrile-0.02 mol/L symplectic alkyl sulfonate(4∶6),and the flow rate is 1.0 mL/min.The analysis used PDA detector,and the detection wavelength was 258 nm and the column temperature was 25 ℃.The results were a good linearity in the rage of 0.1～100 μg/mL(r=0.999 3);The recovery ratio was 94.87%～105.51%;Precision RSD value was 3.08%,the repeatability RSD value was 2.26%.In the chromatographic conditions for some of patient’s serum detection,the external standard method for calculating the concentration of serum paraquat was 5.91 μg/mL.Conclusions:The method of protein precipitate is complete,without impurity peak,with an earlier peak time and high sensitivity,which can quickly detect patients with paraquat concentration in serum,and provide reference for clinical treatment.

HPLC;serum;paraquat concentration

R917

A

1004-4329（2017）02-042-04

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2017）02-042-04

2016-12-21

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31201788）；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2016A872）；安徽省科技計(jì)劃項(xiàng)目（1704g07020112）資助。

楊京霞(1982－ )，女，碩士，講師，研究方向：中藥成分分析及活性。